CN113101293A

CN113101293A - 熊果酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN113101293A
Application number: CN202110416785.0A
Authority: CN
Inventors: 陈广通; 陆游佳; 徐天怡; 储呈娇; 宋开南; 宋妍
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2041-04-19
Also published as: CN113101293B

Abstract

本发明属于医药领域，公开了一类熊果酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。本发明利用微生物转化技术，对熊果酸成功地进行了结构修饰，获得了4个具有母核结构修饰的新型的化合物，通过体外神经细胞损伤保护试验和神经小胶质细胞炎症试验证实，这些化合物具有较好的神经细胞保护活性和抗神经炎症活性，可以作为治疗神经退行性疾病、创伤性脑损伤、中风药物的活性成分，具有广泛的用途。

Description

熊果酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及熊果酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。

背景技术

随着老龄化加剧，神经退行性疾病、创伤性脑损伤及中风等神经系统疾病发病率逐年上升。目前临床药物只能缓解部分症状，不能有效地预防疾病的发生，改善患者认知状态和阻止疾病发展。寻找积极有效的治疗方法已经成为神经科学等相关学科刻不容缓的重任。在上述疾病的发生、发展过程中，大脑的神经细胞受损、缺失或死亡是其最基本的病理改变，常使神经功能严重受损而导致偏瘫、失语、智力障碍或昏迷，甚至死亡。有研究表明，在神经退行性疾病的发生与发展中，脑内始终存在着以胶质细胞激活为主要特征的炎症反应。因此，神经炎症在整个神经学领域的重要性越来越明显。

熊果酸又名乌索酸，是一类结构比较特殊的五环三萜类成分，存在于多种中草药，如山茱萸、女贞子和五味子等。现代药理研究发现，熊果酸具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降糖、抗肝纤维化等作用。此外，近年来亦有许多关于熊果酸神经保护作用的研究。在化学结构修饰方面，熊果酸的化学合成衍生物在抗肿瘤方面的研究较为丰富，化学结构修饰的位点主要为熊果酸3位的羟基和28位的羧基。但是，由于五环三萜类化合物结构的特殊性，母核缺乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以获得母核上具有羟基、羰基等修饰的衍生物。因此，具有母核结构修饰的熊果酸衍生物化学和药理研究尚不全面。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种熊果酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，该熊果酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，可用于制备治疗神经退行性疾病、中风以及脑损伤等药物。所述熊果酸衍生物为结构式为式Ⅰ-Ⅳ的化合物：

结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ和式Ⅳ的化合物为本发明首次公开的熊果酸新衍生物。

进一步的，熊果酸衍生物的制备方法具体为：

1)在培养基中发酵培养微生物，然后加入熊果酸进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为蝇卷霉Circinella muscae CGMCC 3.2695；所述熊果酸的加入量为每1mL培养基中加入2-5000μg的熊果酸。

2)将所述发酵液经乙酸乙酯溶剂萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物；

3)将所述转化粗提物用反相高效液相色谱纯化，获得所述熊果酸衍生物；

其中，所述反相高效液相色谱的制备条件为：半制备用色谱柱YMC ODS-A，10.0I.D×250mm，体积比为45:55的乙腈-水溶液，流速2.5mL/min，检测波长203nm。

进一步的，所述治疗神经系统疾病药物为修复神经损伤药物。

进一步的，所述治疗神经系统疾病药物为抗神经炎症药物。

进一步的，所述神经损伤包括神经退行性疾病、创伤或中风引起的中枢神经损伤。

进一步的，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森氏症、亨廷顿病或肌萎缩侧索硬化症。

进一步的，所述药物还含有药学上可以接受的辅料。

进一步的，所述药学上可接受的辅料为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明利用微生物转化技术，对熊果酸成功地进行了结构修饰，获得了一类新的熊果酸衍生物，通过神经细胞损伤保护试验和神经小胶质细胞炎症试验证实，这些化合物具有较好的神经细胞损伤修复及抗神经炎症活性，可以作为治疗神经退行性疾病、中风以及脑损伤等药物的活性成分，具有广泛的用途。

附图说明

图1为本发明实施例1得到的熊果酸衍生物的HPLC液相色谱图。

具体实施方式

实施例1、结构式为式Ⅰ-式Ⅳ的化合物的制备

本发明采用微生物转化方法，以熊果酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。卷霉(Circinella)属的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。

以蝇卷霉Circinella muscae CGMCC 3.2695为例，制备结构式为式Ⅰ-式Ⅳ的化合物的过程如下：

1)发酵、转化以及萃取

将蝇卷霉Circinella muscae CGMCC 3.2695接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入25mg熊果酸(0.2mL，125mg/mL DMSO溶液)，共用500mg底物。相同条件下继续转化5天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.83g。

2)反相高效液相色谱纯化

合并组分用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS A-5μm，10.0×250mm，乙腈-水(45:55，V/V)，流速2.5mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式Ⅰ-式Ⅳ的4个转化产物，其¹³C-NMR数据如表1所示。

表1.化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的碳谱数据(氘代吡啶)

以上结果表明，所得化合物结构正确。

实施例2化合物Ⅰ-Ⅳ对由过氧化氢损伤的神经细胞修复及保护活性

(1)实验材料

CO₂培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(OlympusIX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、DMEM高糖培养基(Gibcol BRL)，胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)、30％的过氧化氢(H₂O₂)(天津市瑞金特化学品有限公司)、SH-SY5Y细胞(中国医学科学院肿瘤研究所)。

(2)实验方法

采用MTT法测定各受试化合物对H₂O₂损伤的SH-SY5Y细胞活性的影响：用胰酶消化后进行细胞计数，调整细胞悬液的细胞密度至5×10⁴个/mL，于96孔培养板中每孔加入200μL，置于5％CO₂，37℃恒温CO₂培养箱中培养12h。待细胞贴壁后分组处理：对照组、模型组(H₂O₂ 700μmol/L损伤4h)、模型+受试化合物(1、10、20μM)组。每孔终体积均为200μL，每个浓度设3个平行。药物处理24h后，于各孔内加入MTT溶液10μL(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。酶标仪490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率：细胞存活率＝加药组OD值/对照组OD值。

(3)实验结果

根据MTT法测试结果，计算熊果酸衍生物Ⅰ-Ⅳ对H₂O₂损伤的SH-SY5Y细胞存活率的影响结果如表2所示。

表2.熊果酸衍生物对H₂O₂损伤的SH-SY5Y细胞存活率的影响

(与模型组相比较，^*P＜0.05)

与对照组比较，H₂O₂处理组的细胞存活率显著降低，说明细胞造模成功。与H₂O₂处理组比较，盐酸多奈哌齐(阳性药物)和熊果酸衍生物Ⅰ-Ⅳ均能显著提高细胞的生存率，表明熊果酸衍生物Ⅰ-Ⅳ具有显著的修复神经细胞损伤作用，且在一定的剂量范围内呈现良好的剂量依赖关系，可以作为治疗神经退行性疾病、中风及创伤性脑损伤药物的活性成分。

实施例3本发明化合物Ⅰ-Ⅳ的抗神经炎症活性

1)实验材料

仪器与试剂：CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPMI 1640培养基(Gibcol BRL)，神经小胶质细胞BV-2、Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。

测试样品：熊果酸及实施例1所合成得到的化合物Ⅰ–Ⅳ，纯度在95％以上；同时，选取L-单甲基精氨酸(L-NMMA)为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。

2)实验方法

采用MTT法测定各受试化合物对神经小胶质细胞BV-2细胞活力的影响：取对数生长期的BV-2细胞，用含10％小牛血清及1％青霉素-链霉素双抗液的DMEM培养液，调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入DMEM全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO₂培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定490nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。

采用Griess法测定各受试化合物对LPS诱导的BV-2细胞NO释放的影响：调整细胞浓度为2×10⁵个/mL，接种于96孔培养板，每孔1mL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入DMEM全培养基，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO₂培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养12h后，取上清液，按试剂盒说明书操作，测定培养液中NO的水平。数据采用SPSS Statistics 25软件进行分析处理，计算各受试样品抑制NO释放的半数抑制浓度(IC₅₀)。

3)实验结果

根据MTT法和Griess法测试结果，计算熊果酸及本发明化合物Ⅰ–Ⅳ对LPS诱导的BV-2细胞NO释放的影响，结果如表3所示。

表3.测试样品抑制LPS诱导的BV-2细胞NO释放的结果

化合物	IC<sub>50</sub>/μM	细胞活力(％)
			L-NMMA	22.46±1.08	112.71±5.04
熊果酸	63.86±2.46	104.52±6.72
			化合物Ⅰ	39.70±1.82	106.47±6.70
化合物Ⅱ	20.23±1.24	118.46±7.56
			化合物Ⅲ	11.50±1.01	98.96±5.76
化合物Ⅳ	58.61±3.18	101.63±4.61

结果表明，本发明的化合物Ⅰ–Ⅳ对BV-2均未见明显的细胞抑制作用，同时可显著降低由LPS诱导的BV-2细胞炎症因子NO的释放水平，具有良好的抗神经炎症活性，可以作为抗神经炎症药物的活性成分。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种熊果酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，其特征在于，所述熊果酸衍生物的结构式选自如下任一结构式：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述熊果酸衍生物的制备方法具体为：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗神经系统疾病药物为修复神经损伤药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗神经系统疾病药物为抗神经炎症药物。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述神经损伤包括神经退行性疾病、创伤或中风引起的中枢神经损伤。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森氏症、亨廷顿病或肌萎缩侧索硬化症。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还含有药学上可以接受的辅料。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。