CN113088565A - 一种快速检测microRNA的太赫兹芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测microRNA的太赫兹芯片及其检测方法，该芯片采用磁控溅射法在高电阻率硅片衬底表面制备二氧化硅介质层，然后离子束蚀刻二氧化硅介质层形成圆环形凹槽，中间形成圆盘结构，接着在圆环形凹槽和圆盘上依次沉积Cr层和Au层，最后在Au层修饰修饰链霉亲和素制得，该芯片能够用于检测检测microRNA，具有特异性好和灵敏度高，且高通量，重复性好和抗干扰能力强等优点，能够实现对靶标进行定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体涉及一种快速检测microRNA的太赫兹芯片，还涉及利用太赫兹芯片快速检测microRNA的方法。
背景技术
microRNA已被证明是一种理想的非侵入性肿瘤诊断、预后和治疗的生物标志物。不同于循环microRNAs，外泌体源性microRNAs来源于外泌体，能准确反映了亲代细胞的特定生理状态和功能。有证据表明肿瘤源性外泌体microRNA的表达与肿瘤细胞的代谢、生长和发展密切相关，可以为肿瘤细胞的早期诊断提供有效信息，使其成为液体活检的新型生物标志物。然而，由于其序列同源性高、体积小(约19-23个核苷酸)和低丰度等特点，从总的外泌体RNA中检测特定的microRNAs仍存在挑战。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)作为检测外泌体microRNA的金标准，其检测灵敏度可达fM水平，但仍存在耗时、重复热循环等问题。其他生物传感方法如荧光生物传感器、电化学生物传感器、表面增强拉曼光谱(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)生物传感器等近些年广泛开发，但仍存在检测稳定性不高、实验过程繁琐等缺点。因此，迫切需要开发一种快速、可靠、简便的外泌体源性microRNA检测方法。
太赫兹(Terahertz，THz)波具有光子能量低、对生物分子间相互作用敏感和高信噪比等优点，太赫兹(THz)光谱技术成为了一种很有潜力的生物传感方法。即使THz光谱在细胞和组织检测上表现出了良好的性能，但核酸和THz波(30-3000μm)之间的尺寸失匹配阻碍了其在microRNA检测方面的应用。太赫兹超材料最近被用来增强太赫兹生物分子的相互作用，以达到更高的灵敏度。太赫兹超材料是由亚波长微结构阵列组成的周期性人工电磁介质，太赫兹超材料表面外来物质沉积而引起的介电常数变化会导致共振频率偏移。因此，多种THz超材料生物传感器已被开发用于细菌、病毒、蛋白质和有机化合物的检测。
现有的THz生物传感器采用磁珠磁分离的方式纯化核酸扩增产物，但由于磁珠本身的介电常数较高，会产生较高的背景信号产生进而覆盖核酸扩增产物的信号，并且核酸扩增过程中的蛋白酶和样本制备过程中产生的盐离子结晶会导致THz波的散射，影响检测的效果。其次，通过直接将样品滴加在超材料芯片上烤干的方式会不可避免的产生“咖啡环效应”，即液滴中心向外的毛细管流会将样本带向液滴的边缘，导致样本分布不均匀进而影响样品检测重复性。最后，RCA作为一种恒温扩增方式，会产生部分非特异性扩增产物，影响检测结果的准确度。
因此，亟需克服上述几个问题，获得一种能够通过THz测量对靶标进行定性定量检测的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种快速检测microRNA的太赫兹芯片；本发明的目的之二在于提供利用太赫兹芯片快速检测microRNA的方法，该方法通过在磁珠上修饰DNA捕获探针形成功能化磁珠，DSN在功能化磁珠捕获靶标microRNA后可以精确识别DNA/RNA复合物，并降解其中的DNA互补部分释放靶标以microRNA实现循环放大。DNA被部分降解后剩余的部分可作为下一步RCA的引物进行核酸扩增，扩增过程中由于引入了生物素化的碱基，产生了含有大量生物素的核酸扩增产物可以被链霉亲和素修饰的太赫兹超材料芯片所捕获，进一步用含有生物素的核酸扩增产物捕获用于太赫兹信号增强的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒，捕获后通过去离子水清洗去除非靶标物质并干燥后进行THz测量对靶标进行定量检测。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种快速检测microRNA的太赫兹芯片，所述芯片由以下方法制备：采用磁控溅射法在高电阻率硅片衬底表面制备二氧化硅介质层，然后离子束蚀刻二氧化硅介质层形成圆环形沟槽，接着在圆环形沟槽和圆盘上依次沉积Cr层和Au层(Cr/Au层)，最后在Au层修饰修饰链霉亲和素，制得太赫兹芯片。
本发明中通过将芯片设置为圆环形，使局域较强电场分布在圆盘结构上和Au层之间，提高检测灵敏度，在太赫兹测量过程中，芯片表面修饰的链霉亲和素、生物素化核酸扩增产物与金纳米颗粒形成的三聚体复合物与太赫兹超材料芯片所产生的较强的局域电场分布之间的重叠有助于增强太赫兹波与分析物之间的相互作用，进一步提高检测灵敏度。
本发明优选的，所述Cr层和Au层的厚度为200nm。
所述圆环形沟槽的内径为43μm，外径为53μm。
2、利用权利要求1所述太赫兹芯片快速检测microRNA的方法，包括如下步骤：
1)提取全血中的外泌体与外泌体中的microRNAs；
2)在磁珠上修饰DNA捕获探针形成功能化磁珠，利用功能化磁珠捕获靶标microRNA，将捕获靶标microRNA进行双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease，DSN)反应，通过DSN精确识别DNA/RNA复合物并降解其中的DNA互补部分，释放靶标microRNA以及DNA捕获探针中的引物部分；
3)将释放的捕获探针中的引物部分通过滚环扩增(Rolling CircleAmplification，RCA)反应进行核酸扩增，扩增过程引入生物素化的碱基，产生含有生物素的核酸扩增产物；
4)用修饰链霉亲和素的太赫兹超材料芯片捕获含有生物素的核酸扩增产物，进一步用含有生物素的核酸扩增产物捕获用于太赫兹信号增强的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒，清洗去除非靶标物质，干燥后进行THz测量。
本发明中，所述功能化磁珠的构建方法如下：将磁珠于磁珠缓冲液中洗涤后用磁珠缓冲液重悬，然后加入DNA捕获探针，摇匀后进行磁分离获得功能化磁珠。
本发明中，所述磁珠直径为220nm，浓度为10mg/mL；所述磁珠缓冲液各组分浓度如下：20mM Tris·Cl，1.0M NaCl，0.02％
X-100；pH 7.8。
本发明中，所述DNA捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明中，所述DSN反应的反应体系如下：0.1μL浓度为0.5U/μL的DSN，1μL浓度为10μM的靶标microRNA，1μL含如下组分的缓冲液：500mM Tris-HCl，pH 8.0；50mM MgCl2；10mM DTT，7.9μL H2O，所述DSN反应的反应条件是在恒温混匀仪中55℃反应2h后，100℃反应20min后终止DSN反应。
本发明中，所述RCA反应的反应体系如下：扩增引物10μL，1μL Bst 3.0DNApolymerase，1μL浓度为10μM的环形扩增引物，各2μL of dATP，dGTP，dCTP，biotin-11-dUTP，5μL等温扩增缓冲液，1μL MgSO4和24μL H2O；所述RCA反应条件为反应2小时后80℃下5min终止RCA反应。
本发明中，超材料芯片修饰链霉亲和素的方法是将超材料芯片浸泡在巯基十一烷酸溶液中，冲洗后，用高纯度氮气吹干，在金表面形成烷基硫醇层；然后用0.1M NHS和0.1MEDC的1:1的混合物活化芯片上的烷基硫醇中的羧基；然后将芯片置于800nM链霉亲和素溶液中孵育，形成链霉亲和素化学修饰的超材料芯片；最后，用水冲洗超材料芯片，去除未结合的链霉亲和素。
优选的，所述THz测量是核酸扩增产物滴在太赫兹超材料芯片上孵育10min后水冲洗去除杂质，进而滴加5μL链霉亲和素修饰的纳米金孵育10min，芯片用水冲洗去除杂质，用高纯度氮气干燥，然后在25℃，光路充满干氮，用太赫兹波检测，每个样本次重复测量三次，通过计算含有核酸扩增产物的太赫兹信号与空白对照组THz频率移动之间的差异ΔF作为定量指标。
本发明中靶标以microRNA-21为靶标，将三种其他类型的microRNAs(microRNA-25，microRNA-107，microRNA-145)作为对照来验证传感器的特异性。
本发明的有益效果在于：本发明公开了基于太赫兹快速检测microRNA的方法，通过DSN触发RCA，RCA扩增过程中引入生物素化的碱基，实现太赫兹检测，并解决核酸和THz波(30-3000μm)之间的尺寸匹配问题，同时还具有如下优点：
1.特异性高：在这种方法中，DSN在保持microRNA完整性的同时实现了循环反应，能准确识别和特异性(低至单碱基错配)降解捕获探针中的DNA，DSN触发的级联反应既保证了识别靶标microRNA的特异性，也避免了下一步RCA的非特异性扩增，极大程度上保证了特异性。
2.灵敏度高：RCA本身可以在引物存在的同时进行大量的核酸扩增，同时由于引入了生物素化的碱基，不仅对RCA产物的信号有增强效果，同时可以保证生物素化的RCA产物被修饰了链霉亲和素的芯片所捕获，通过生物素化富集的RCA产物可以进而捕获用于信号增强的链霉亲和素修饰的纳米金，进一步增强检测灵敏度。
3.高通量：太赫兹时域光谱技术的采集时间短，仅需约10秒便可获取分辨率较高的光谱信号，因此，可以在短时间内实现大量样本的检测。
4.样本分布均一：由于芯片上通过化学修饰方法修饰了链霉亲和素，通过链霉亲和素的捕获可以始样本均匀的分布在超材料芯片上，避免了由于直接滴加样本后烤干而引起的“咖啡环效应”。
5.重复性好：由于高特异性和样本制备过程中样本分布均一，因此，同一个样本多次检测的重复性较好。
6.抗干扰能力强：由于反应体系中包含了大量的酶、金属离子等非靶标物质，干燥后会在超材料芯片上形成结晶以影响太赫兹信号，通过在芯片上化学修饰链霉亲和素特异性捕获生物素化的RCA产物，通过去离子水冲洗即可去除非靶标物质的背景信号干扰。
7.可实现临床全血样本中外泌体源性microRNA的检测。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为太赫兹超材料芯片结构及检测结果(A：太赫兹超材料的结构单元示意图B：太赫兹超材料的横截面示意图C：电场分布的俯视图D：电场分布的横截面图E：不同样品的太赫兹超材料测量miR-21：靶标microRNA-21Blank Control：空白对照SA-functionalizedMM:链霉亲和素修饰的超材料芯片Bare MM:空白超材料芯片F：图1E中相应组别的太赫兹频率移动)。
图2为基于DSN出发RCA的功能化太赫兹超材料芯片用于外泌体源性microRNA-21检测的示意图。
图3为DSN触发RCA的过程(泳道M：DNA ladder；泳道1：P0；泳道2：miR-21：泳道3：RCA template，泳道；4：P0与miR-21互补结合；泳道5：P0与miR-21结合产物被DSN特异性识别并降解其中的DNA；泳道6：以泳道1产物为模板发生RCA；泳道7：以泳道4产物为模板发生RCA；lane 8：以泳道5产物为模板发生RCA)。
图4为反应条件优化结果(A：链霉亲和素浓度的优化；B：P0浓度的优化；C:DSN反应时间优化；D：RCA反应时间优化)。
图5为太赫兹传感器的灵敏度检测结果。
图6为太赫兹传感器的特异性检测结果。
图7为太赫兹传感器的临床样本运用(A：胰腺癌患者全血样本与健康人群全血样本提取外泌体源性microRNAs的检测结果；B：太赫兹传感器与金标准RT-PCR检测相同浓度的microRNA-21的一致性)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、太赫兹超材料芯片的构建
太赫兹超材料芯片具体制备方法如下：
1)采用磁控溅射法在高电阻率硅片衬底表面制备二氧化硅介质层；
2)通过离子束蚀刻去除部分二氧化硅层形成圆环形凹槽，中间形成圆盘结构；
3)采用光刻法在圆环形凹槽和圆盘上沉积了200nm厚的Au和Cr层，Au层和高阻硅层之间的Cr层作为粘附层增加黏附作用，Au层表面修饰链霉亲和素。
金盘阵列结构的设计是偏振不敏感的，进而确保检测的稳定性和重复性，结构如图1中A和B所示。
本发明中芯片衬底的长和款用P表示，圆环形凹槽的内径用ri表示，内径用ro，二氧化硅介质层厚度用t表示，其中P＝114μm，ro＝53μm，ri＝43μm，t＝2μm。
将设计的超材料芯片模拟电势结果，结果如图1中C和D所示。结果显示，设计为圆环形凹槽太赫兹超材料的电场在凹槽内和金盘区域表现出较强的局域电场分布，横截面电场分布提示两层金层之间的较强的局域电场分布，因此能提高检测灵敏度。
本发明的芯片检测原理如下(图2)：在芯片上修饰链霉亲和素，利用链霉亲和素捕获生物素富集的RCA产物时，RCA产物中富含的氢键、范德华力等作用以及链霉亲和素和生物素之间的相互作用会使太赫兹信号有一定的偏移，当生物素富集的RCA产物进一步捕获链霉亲和素修饰的纳米金时，由于纳米金引起超材料芯片折射率进一步改变，会使太赫兹信号有进一步的偏移，从而增加检测的灵敏度和特异性。
实施例2、利用太赫兹超材料芯片快速检测microRNA
快速检测microRNA的方法，具体步骤如下：
1)外泌体的提取：通过试剂盒提取全血中的外泌体与外泌体中的microRNAs；
2)太赫兹超材料上化学修饰链霉亲和素(SA)：将超材料芯片浸泡在10mM的巯基十一烷酸(MUA)溶液中24h，用去离子水冲洗3次，用高纯度氮气吹干，在金表面形成烷基硫醇层；然后用0.1M NHS和0.1M EDC的1:1的混合物活化芯片上的羧基硫醇中的羧基；然后将芯片置于800nM SA溶液中孵育，形成SA化学修饰的超材料芯片；最后，用去离子水冲洗超材料芯片三次，以去除未结合的SA；
3)功能化磁珠的构建：取10μL链霉亲和素磁珠(直径220nm，浓度10mg/ml)在30μL磁珠缓冲液中洗涤三次(磁珠缓冲液包括：20mM Tris·Cl，1.0M NaCl，0.02％
X-100；pH 7.8)磁分离后再次重悬于30μL磁珠缓冲液中，加入1μL浓度为10μM的P0探针(如表1所示)后缓慢摇匀30分钟后磁分离，无菌无酶去离子水洗涤三次后完成制备；
4)DSN触发的RCA反应：10μL DSN反应体系如下：0.1μL DSN(0.5U/μL)，1μL targetmiR-21(10μM)，1μL master buffer(500mM Tris-HCl，pH 8.0；50mM MgCl2；10mM DTT)和7.9μL H2O，在恒温混匀仪中55℃反应2h后，100℃反应20min终止DSN反应过程，使用功能化磁珠分离后的上清即为下一步RCA反应的引物P1(如表1所示)。50μL RCA反应体系包括：10μL P1，1μL Bst 3.0DNA polymerase，1μL RCA template(10μM)，各2μL of dATP，dGTP，dCTP，biotin-11-dUTP，5μL isothermal amplification buffer，1μL MgSO4 and 24μL H2O反应2小时后，80℃5min终止RCA反应。
5、RCA产物的太赫兹光谱测量：将RCA产物25μL滴在超材料芯片上孵育10min，去离子水洗涤三次后，进一步用含有生物素的核酸扩增产物捕获用于太赫兹信号增强的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒，芯片用去离子水冲洗3次，去除盐离子、蛋白质等杂质，用高纯度氮气干燥；实验条件保持在25℃，光路充满干氮，以消除水蒸气对THz的影响；每个样本次重复测量三次，通过计算含有RCA产物的太赫兹信号与空白对照组THz频率移动之间的差异ΔF作为microRNA-21的定量指标。
为验证DSN触发RCA的可行性，将DSN触发RCA的产物进行电泳，结果如图3所示。结果显示，泳道6和泳道7中单纯的P0与P0与miR-21互补结合作为引物的情况下均无法触发RCA反应，只有泳道8中经过DSN切割的P0与P0与miR-21互补结合产物作为引物才可以触发RCA反应。
将空白太赫兹超材料芯片、链霉亲和素修饰的太赫兹超材料芯片、空白对照组以及microRNA-21作为靶标发生反应的太赫兹光谱测量。结果如图1中E和F所示。结果显示，链霉亲和素修饰的太赫兹超材料芯片组的信号相较于空白太赫兹超材料芯片组的信号发生了一定的偏移，证实了链霉亲和素的成功修饰；空白对照组相较于链霉亲和素修饰组仅发生了少部分的偏移，证实即使是空白对照组中的生物素化的碱基也会对信号造成一定的影响，但这种影响并不明显；而microRNA-21组相较于空白对照组信号发生了明显的偏移，证实该方法具有检测靶标microRNA-21的能力。
反应条件的优化：
1)P0浓度优化：按照本实施例的方法，分别使用浓度分别为5μM、10μM、15μM、20μM和25μM的P0探针检测microRNA-21，结果如图4中A所示。结果显示，P0探针的最优浓度为20μM。
2)DSN反应时间优化：按照本实施例的方法，分别使用DSN反应时间为0.5h，1h，1.5h，2.0h和2.5h，结果如图4中B所示。结果显示，DSN反应最优时间为2h。
3)RCA反应时间优化：按照本实施例的方法，分别使用RCA反应时间为0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h，结果如图4中C所示。结果显示，RCA反应最优时间为2小时。
4)纳米金尺寸优化：按照本实施例的方法，分别使用纳米金尺寸为1.4nm、10nm、20nm，结果如图3中D所示。结果显示，纳米金最优尺寸为1.4nm。
5)纳米金浓度优化：按照本实施例的方法，分别使用纳米金尺寸为10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL、90μg/mL，结果如图4中E所示。结果显示，纳米金最优尺寸为50μg/mL。
太赫兹超材料芯片的灵敏度检测：
使用不同浓度的靶标microRNA-21检测，浓度分别由100aM至10nM变化，然后统计不同浓度靶标频率移动变化的直方图与浓度变化之间的线性拟合曲线，结果如图5所示。结果显示，计算出检测限为84aM，检测范围为1fM-10nM。
太赫兹超材料芯片的特异性：
分别检测标microRNA-21、包含靶标microRNA-21的不同microRNAs混合物、单碱基突变靶标、双碱基突变靶标、三碱基突变靶标、microRNA-25、microRNA-107、microRNA-145在太赫兹超材料芯片上响应的频率移动直方图，结果如图6所示。结果显示，该传感器具有较好的特异性，并且能从不同microRNAs混合物中识别靶标microRNA-21。
本实施例中使用的序列如表1所示。
表1、探针及靶标序列
实施例3、太赫兹超材料芯片检测临床样本
选取20名胰腺癌患者全血样本与20名健康人群全血样本提取外泌体源性microRNAs的检测结果，结果如图7所示。结果显示，胰腺癌组明显高于健康组。并且该太赫兹超材料芯片与金标准RT-PCR检测相同浓度的microRNA-21的一致性，R2＝0.9514。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120> 一种快速检测microRNA的太赫兹芯片及其检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atataggggt gggaggggtg ggagtcaaca tcagtctgat aagctatttt tt 52
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcaggtagt gcatcaccct cccacccctc ccacccctat atcggagc 48
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uagcuuaucg gacugauguu ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uagcuuaucg gauugauguu ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uagcuuaucg gauugacguu ga 22
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcagcauug uacagggcua uca 23
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
guccaguuuu cccaggaauc ccu 23
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cauugcacuu gucucggucu ga 22
Claims (10)
1.一种快速检测microRNA的太赫兹芯片，其特征在于：所述芯片由以下方法制备：采用磁控溅射法在高电阻率硅片衬底表面制备二氧化硅介质层，然后离子束蚀刻二氧化硅介质层形成圆环形凹槽，中间形成圆盘结构，接着在圆环形凹槽和圆盘上依次沉积Cr层和Au层，最后在Au层修饰修饰链霉亲和素，制得太赫兹芯片。
2.根据权利要求1所述快速检测microRNA的太赫兹芯片，其特征在于：所述Cr层和Au层的厚度为200nm。
3.根据权利要求1所述快速检测microRNA的太赫兹芯片，其特征在于：所述圆环形沟槽的内径为43μm，外径为53μm。
4.利用权利要求1所述太赫兹芯片快速检测microRNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取全血中的外泌体与外泌体中的microRNAs；
2)在磁珠上修饰DNA捕获探针形成功能化磁珠，利用功能化磁珠捕获靶标microRNA，将捕获靶标microRNA进行双链特异性核酸酶反应，通过DSN精确识别DNA/RNA复合物并降解其中的DNA互补部分，释放靶标microRNA以及DNA捕获探针中的引物部分；
3)将释放的捕获探针中的引物部分通过滚环扩增反应进行核酸扩增，扩增过程引入生物素化的碱基，产生含有生物素的核酸扩增产物；
4)用修饰链霉亲和素的太赫兹超材料芯片捕获含有生物素的核酸扩增产物，进一步用含有生物素的核酸扩增产物捕获用于太赫兹信号增强的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒，清洗去除非靶标物质，干燥后进行THz测量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述功能化磁珠的构建方法如下：将磁珠于磁珠缓冲液中洗涤后用磁珠缓冲液重悬，然后加入DNA捕获探针，摇匀后进行磁分离获得功能化磁珠。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述磁珠直径为220nm，浓度为10mg/ml；所述磁珠缓冲液各组分浓度如下：20mM Tris·HCL，1.0M NaCl，0.02％
X-100；pH7.8。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DNA捕获探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DSN反应的反应体系如下：0.1μL浓度为0.5U/μL的DSN，1μL浓度为10μM的捕获靶标microRNA，1μL含如下组分的缓冲液：500mMTris-HCl，pH 8.0；50mM MgCl2；10mM DTT，7.9μL H2O，所述DSN反应的反应条件是在恒温混匀仪中55℃反应2h后，100℃反应20min后终止DSN反应。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RCA反应的反应体系如下：扩增引物10μL，1μL Bst 3.0DNA polymerase，1μL浓度为10μM的环形扩增模板，各2μL dATP，dGTP，dCTP，biotin-11-dUTP，5μL等温扩增缓冲液，1μL MgSO4和24μL H2O；所述RCA反应条件为65℃反应2小时后80℃下5min终止RCA反应。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：超材料芯片修饰链霉亲和素的方法是将超材料芯片浸泡在巯基十一烷酸溶液中，冲洗后，用高纯度氮气吹干，在金表面形成烷基硫醇层；然后用0.1M NHS和0.1M EDC的1:1的混合物活化芯片上的烷基硫醇中的羧基；然后将芯片置于800nM链霉亲和素溶液中孵育，形成链霉亲和素化学修饰的超材料芯片；最后，用水冲洗超材料芯片，去除未结合的链霉亲和素。
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| XINYU ZHAN等: "Streptavidin-functionalized terahertz metamaterials for attomolar exosomal microRNA assay in pancreatic cancer based on duplex-specific nuclease-triggered rolling circle amplification", 《BIOSENS BIOELECTRON》 * |
| 孙雅茹等: "太赫兹超材料类EIT谐振无标记生物传感", 《光学学报》 * |
| 武东伟: "平面超材料太赫兹波非对称开口环谐振器研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库信息科技辑》 * |
| 詹新宇等: "基于双链特异性核酸酶触发滚环扩增的microRNA-21太赫兹超材料传感方法的构建", 《中华预防医学杂志》 * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113088565B (zh) | 2023-07-14 |
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