CN113087784A - 索玛鲁肽氨基端甲醛化物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种索玛鲁肽注射剂中的降解物质索玛鲁肽氨基端甲醛化物及其制备方法，所述方法包括：以氨基载体树脂为原料，按照固相合成方式依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，再与侧链偶联，经高效液相色谱法进行纯化、冷冻干燥制得该化合物。本发明还制备、分离、纯化及表征了该索玛鲁肽氨基端甲醛化物，并对其生物学活性进行了充分研究。此外，本发明还涉及一种安全性高的药物组合物，所述药物组合物含有索玛鲁肽或其药学上可接受的盐和含量不高于0.5％的相关物质，且其中索玛鲁肽氨基端甲醛化物的含量不高于0.1％。

Description

索玛鲁肽氨基端甲醛化物及其制备方法
技术领域
本发明属于多肽药物合成领域，具体涉及索玛鲁肽氨基端甲醛化物以及该多肽分子的 制备方法。
背景技术
糖尿病是一种以血液中高血糖为特征，因体内胰岛素不足所导致的一系列临床综合症， 与遗传基因有着非常密切的关联。糖尿病的主要临床表现为多饮、多尿、多食和体重下降， 以及血糖高、尿液中含有葡萄糖等。任何类型的糖尿病都会导致胰腺中的β细胞不能产生 足量的胰岛素以降低血糖的浓度，导致高血糖症的发生。Ⅱ型糖尿病患者占所有糖尿病患 者的90％左右，所以针对Ⅱ型糖尿病的药物对于糖尿病的治疗有着十分重要的意义。
针对Ⅱ型糖尿病的治疗药物种类很多。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂是近年 来研究的热点。GLP-1分子结合并激活GLP-1受体，GLP-1受体是天然GLP-1分子的作用靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，可以与胰岛细胞上的受体结合并刺激胰岛素分泌，进而产生降低血糖的作用。GLP-1受体激动剂类降糖药物的优点在于低血糖事件的发生率明显低于胰岛素，而且可以减少食物摄取和延缓胃排空，有利于控制体重，可以保护胰岛β细胞功能。
索玛鲁肽(Sermaglutide)是一款新的长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，与人 体的内源性GLP-1具有97％的序列同源性，不仅具有显著的降血糖疗效，还具有明显的减 肥功效(结构见下式Ⅰ)。索玛鲁肽(Sermaglutide)注射剂每周皮下注射一次，可使II型糖尿病患者血糖水平大幅改善，并且低血糖风险较低。于此同时，索玛鲁肽还能够通过降低食欲和减少食物摄入量，诱导减肥。此外，索玛鲁肽还能够显著降低II型糖尿病患者重大心血管事件风险。
但是，由于索玛鲁肽药品治疗糖尿病所使用的剂量非常低(毫克剂量)，因此极微量的 相关杂质的存在将会大大降低这个糖尿病治疗药物的疗效。本专利技术人员通过研究找到 了一种索玛鲁肽注射剂中的降解物质，即索玛鲁肽氨基端甲醛化物；并且制备、分离、纯 化及表征了该索玛鲁肽氨基端甲醛化物，并对其生物学活性进行了充分研究。通过对该物 质的研究，能够严格控制索玛鲁肽注射剂中该物质的含量，从而提高药物的安全性和疗效。
Figure BDA0002330900310000021
发明内容
本发明目的在于提供一种索玛鲁肽注射剂中的降解物质，即索玛鲁肽氨基端甲醛化物。 所述物质具有如下式Ⅱ所示结构。
Figure BDA0002330900310000022
本发明的另一个目的在于提供一种制备索玛鲁肽氨基端甲醛化物的方法。所述方法包 括使用特定的(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物，其特征是在固相法合成索玛鲁肽主链时，将组氨 酸与甲醛反应所制备的(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物引入到索玛鲁肽分子中。
(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物具有式(Ⅲ)所示结构，化学名称为(S)-3，5-双(叔丁氧羰 基)-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸。
Figure BDA0002330900310000031
进一步，本发明提供一种制备索玛鲁肽氨基端甲醛化物的方法，其包括如下步骤：
(1)以Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl树脂为原料，加入氨基脱保护 试剂，脱除所述树脂上的Fmoc保护基；
(2)将步骤(1)脱除Fmoc保护基的树脂在活化助剂和缩合剂存在下采用固相合成逐 一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，每一个偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终 点，每一轮Fmoc氨基酸偶联反应完毕后都使用氨基脱保护试剂脱除Fmoc保护基，然后再 与下一个Fmoc保护的氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到氨基酸侧链官能团全保 护[2-31]-索玛鲁肽主链肽-树脂：
Fmoc-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tB u)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Bo c)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂
(3)将步骤(2)制备得到的氨基酸侧链官能团全保护[2-31]-索玛鲁肽主链肽-树脂用 氨基脱保护试剂脱除Fmoc保护后，再与(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物(式Ⅲ)在活化助剂和 缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化 物主链肽-树脂。
Figure BDA0002330900310000032
式(Ⅲ)(S)-3，5-双(叔丁氧羰基)-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸
(4)经酸性裂解试剂裂解同步除去氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化 物主链肽-树脂上的树脂和保护基团，经沉淀，得到索玛鲁肽氨基端甲醛化物的主链粗品。
(5)将上述步骤(4)得到的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品经反相高效液相色谱 进行纯化。
(6)将上述步骤(5)经纯化得到的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链与索玛鲁肽谷氨酰胺 脂肪侧链进行偶联得到带有保护基的索玛鲁肽氨基端甲醛化物，并用酸性裂解试剂脱去谷 氨酰胺脂肪侧链上的两个叔丁基保护基，得到索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品。
带有两个叔丁基保护基的索玛鲁肽谷氨酰胺脂肪侧链的活性酯具有式(Ⅳ)结构：
Figure BDA0002330900310000041
(7)将上述步骤(6)所得到的索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品经过反相高效液相色谱 进行纯化，合并纯化后的组分，经过冷冻干燥得到索玛鲁肽氨基端甲醛化物纯品。
其中，所述氨基脱保护试剂为10～30％(V/V)哌啶(PIP)/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，优选为20％；氨基脱保护试剂用量为每毫摩尔投料树脂的20～40倍(毫升)，优选 为每毫摩尔投料树脂的30倍(ml)；脱保护反应时间为20～50分钟，优选为30～40分钟。
所述活化助剂选自1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲脲六氟磷酸酯(HBTU)至少中的一种。
所述的缩合剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1， 1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N，N，N’，N-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的一种或多种； 优选为N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU) 中的一种或多种。
步骤(1)所述的Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl树脂的荷载量为0.1～ 0.6mmol/g，优选0.2～0.5mmol/g；氨基树脂与脱保护剂投料比为1:10～50，优选1:20～40， 单位：mol/L；脱保护反应时间为20～50分钟，优选为30～40分钟。
步骤(2)中所述的Fmoc保护的氨基酸及其依次连接顺序为：Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH。
步骤(2)中所述缩合试剂的摩尔用量为起始树脂摩尔数的2～6倍，优选为2.5～3.5倍。 活化助剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲脲六氟磷酸(HBTU)， 优选的为1-羟基苯并三唑。活化助剂用量为起始树脂摩尔数的2～6倍，优选的为2.5～3.5倍。 偶联反应时间为60～150分钟，优选的为90～120分钟。
步骤(3)所述的固相偶联反应与步骤(2)的反应条件完全相同，所用的活化助剂和缩 合剂与步骤(2)相同，活化助剂和缩合剂的用量也与步骤(2)相同。
步骤(4)所述的酸性裂解试剂为三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯甲硫醚、乙二硫醇和水 组成的混合物，三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：水＝90～95:0～5:0～5:0～5:0～5 体积比。
步骤(5)所述索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品的纯化方法，高效液相色谱柱参数为： 色谱填料为10微米的反相C18固定相，色谱柱直径为50毫米，长度为250毫米，步骤如下：
称取索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品加入到适量水中进行超声溶解，然后进行微孔 滤膜过滤，滤液再用高效液相色谱柱纯化，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈溶液，梯度 洗脱，循环纯化，合并主峰溶液后减压浓缩，得到含有乙腈的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主 链水溶液。
步骤(6)所述的偶连索玛鲁肽谷氨酰胺脂肪侧链所用的碱选自N,N-二异丙基乙基胺、 N-甲基吗啉、三乙胺中的一种，优选N,N-二异丙基乙基胺。反应pH为9.0～11.0，优选为9.5～10.5。
步骤(6)所述的酸性裂解试剂为三氟乙酸、乙腈组成的混合物，三氟乙酸：乙腈＝70～ 90:10～30体积比。
(7)所述索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品的纯化方法，高效液相色谱柱参数为：色谱填 料为10微米的反相C18固定相，色谱柱直径为50毫米，长度为250毫米，步骤如下：
称取索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品加入到水/乙腈(体积比5/1)中搅拌溶解，微孔滤膜 过滤，滤液用高效液相色谱柱纯化，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈溶液，梯度洗脱， 循环纯化，合并主峰溶液减压浓缩，冷冻干燥得到索玛鲁肽氨基端甲醛化物。
本发明另一目的在于提供一种安全性高、疗效好的药物组合物，所述药物组合物含 有索玛鲁肽或其药学上可接受的盐，还包含除活性成分以外的其它相关物质，所述相关物质的含量总和不高于0.5％。
进一步，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含有索玛鲁肽或其药学上可接 受的盐，以及除活性成分以外的其它相关物质的含量总和不高于0.5％，且所含式II所 示结构化合物(又称索玛鲁肽氨基端甲醛化物)的含量不高于0.1％。
进一步，本发明提供的药物组合物是一种索玛鲁肽注射剂，所述注射剂中含有索玛鲁 肽或其药学上可接受的盐，除活性成分以外的其它相关物质的含量总和不高于0.5％， 且含式II所示结构化合物(又称索玛鲁肽氨基端甲醛化物)的含量不高于0.1％。
术语说明：
侧链保护基团：指与氨基酸的侧链(即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基)偶联的化学部分，其有助于防止侧链的一部分与多肽合成、加工等步骤中使用的化学物质反应。
缩合剂：能引起缩合反应的试剂，在多肽合成中，尤指能促进氨基与羧基偶联形成肽 键的试剂。
活化助剂：在多肽缩合反应中，能够协助缩合剂更好的促进缩合反应的试剂，如：抑 制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。
所述的偶联是在活化助剂和缩合剂存在下进行的固相偶联反应。
Fmoc是指芴甲氧羰酰基；pbf是指2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；OtBu是指 叔丁氧基；Boc是指叔丁氧基羰基；tBu是指叔丁基。
附图说明
图1、索玛鲁肽氨基端甲醛化物与索玛鲁肽药品的活性对比。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步说明。但是应当理解，这些实施例仅仅是用于更 详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求的保护范围。
实施例1、(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物{(S)-3，5-双(叔丁氧羰基)-4,5,6,7-四氢-3H- 咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸}的制备
称取(S)-5-叔丁基酯-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸17g加入到纯化水 510ml中，加入三乙胺15ml搅拌溶清；称取(Boc)2O21.25g溶于1,4-二氧六环510ml中，滴加至上述体系，滴加完毕后室温搅拌反应。反应结束后向体系内加入纯化水 510ml和甲基叔丁基醚340ml搅拌分液，水相依次再用甲基叔丁基醚、乙酸乙酯洗涤； 水相用硫酸调至pH3，然后用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液用饱和食盐水洗涤， 然后加入无水硫酸钠干燥，抽滤除去干燥用的硫酸钠，然后减压浓缩得(S)-(Boc)2-组 氨酸甲醛化物22.0g，收率94.14％。m/z:366.16[M-H]-.1H-NMR(400MHz，d6-DMSO): δ＝12.98(br,2H)；5.13～5.02(m,1H)；4.82～4.78(m,1H)；4.04～4.02(m,1H)；3.06～3.02 (m,1H)；2.91～2.87(m,1H)；1.57(s,9H)；1.45～1.40(m,9H).
Figure RE-GDA0002361988570000071
实施例2、氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-2-
Chlorotrityl树脂的制备
称取Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl树脂160g(荷载量0.31mmol/g，50mmol)加入到固相反 应器中，然后加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液1500ml，25～30℃搅拌反应30分钟， 反应完毕后抽滤，将树脂用1000ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次；接下 来把Fmoc-Arg(Pbf)-OH 97.32g(分子量：648.8，150mmol)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)20.27g(分子量：135.1，150mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺500ml中，然后转移到固相 反应器内，再向固相反应器中加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)18.93g(分子量：126.2，150mmol)，25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用1000mlN,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤3次。重复以上步骤，按照索玛鲁肽的序列逐一 与相应的Fmoc保护氨基酸偶联，保护氨基酸和缩合剂当量与前述Fmoc-Arg(Pbf)-OH相同。
依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物。
制得氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-2-Chlorotrityl树脂， 其结构如下：
(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2-Chlorotrityl树脂
实施例3、氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-Wang树脂的 制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂125.0g(荷载量0.4mmol/g,50mmol)加入到固相反应器中， 然后加入20％的哌啶N,N-二甲基甲酰胺溶液1500ml，25～30℃搅拌反应30分钟，反应完毕 后抽滤，将树脂用1000ml N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤共6次；接下来把Fmoc-Arg(Pbf)-OH 97.32g(分子量：648.8，150mmol)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)20.27g(分子量：135.1，150mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺500ml中，然后转移到固相反应 器内，再向固相反应器中加入N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)18.93g(分子量：126.2，150mmol)， 25～35℃反应约2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准，将树脂用1000ml N,N-二甲基 甲酰胺洗涤，抽滤，重复洗涤3次。重复以上步骤，按照索玛鲁肽的序列逐一与相应的Fmoc 保护氨基酸偶联，保护氨基酸和缩合剂当量与前述Fmoc-Arg(Pbf)-OH相同。
依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Aib-OH、(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物。
制得氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-Wang树脂，其结构 如下：
(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂
实施例4、索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品的制备
将实施例2制备的氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽 -2-Chlorotrityl树脂40g加入到1000ml圆底烧瓶中；配制裂解试剂400ml，其中三氟乙酸350ml，苯酚10ml，苯甲硫醚20ml，1,2-乙二硫醇10ml，水10ml，预冷至0℃；将裂解试 剂加入侧链全保护索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-树脂中，升至20～30℃反应2小时，过 滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入1L预冷却的 甲基叔丁基醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰的甲基叔丁基醚洗涤滤饼5 次，真空干燥得到粗肽12.60g。粗肽纯度25.28％。
实施例5、索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品的制备
将实施例3制备的侧链全保护索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-Wang树脂40g加入到 1000ml圆底烧瓶中；配制裂解试剂400ml，其中三氟乙酸350ml，苯酚10ml，苯甲硫醚20ml，1,2-乙二硫醇10ml，水10ml，预冷至0℃；将裂解试剂加入侧链全保护索玛鲁肽氨 基端甲醛化物主链肽-树脂中，升至20～30℃反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤 树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入1L预冷却的甲基叔丁基醚内，出现白色沉 淀，静置1小时后，抽滤，并用冰的甲基叔丁基醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到粗肽11.30g。 粗肽纯度24.40％。
实施例6、索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链的纯化
称取实施例4制备的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品粉末10.0g，采用适量水溶解， 溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
高效液相色谱法进行纯化时的条件，色谱柱：以10um的八烷基硅烷键合硅胶为固定相， 柱子直径和长度为：50mm×250mm。以0.1％三氟乙酸-乙腈溶液为流动相进行纯化，洗脱的 流速60ml/min，采用梯度洗脱，循环进样方式上样，将上述处理的样品溶液上样于色谱柱 中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并合格的主峰溶液，在小于40℃ 水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链溶 液。
实施例7、索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品的制备
将实施例6制备的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链溶液用N,N-二异丙基乙基胺调至pH10.0，滴加化合物Ⅲ的乙腈溶液，反应结束后滴加25％的乙酸水溶液调至pH5.6，析出固体，抽滤并用乙腈洗涤，抽干。将上述抽干得到的固体加入到三氟乙酸/乙腈(体积比4/1)混合溶液中搅拌，反应结束后将反应液加至甲基叔丁基醚中析晶，抽滤并用甲基叔丁基醚洗涤，抽干，干燥后得索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品。
实施例8、索玛鲁肽氨基端甲醛化物纯品的制备
称取实施例7制备的索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品粉末2.5g，用适量水/乙腈(体积比 3/1)中搅拌溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
高效液相色谱法进行纯化时的条件，色谱柱：以10um的八烷基硅烷键合硅胶为固定相， 柱子直径和长度为：50mm×250mm。以0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈溶液为流动相进行一级纯 化，洗脱的流速60ml/min，采用梯度洗脱，循环进样方式上样，将上述处理的样品溶液上 样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并合格的主峰组份 溶液，在小于40℃水浴条件下减压浓缩，用旋转蒸发仪蒸去大部分乙腈，得索玛鲁肽氨基 端甲醛化物溶液。冷冻干燥得索玛鲁肽氨基端甲醛化物1.1g。m/z:1374.03[M/3-H]-.
实施例9、索玛鲁肽氨基端甲醛化物与索玛鲁肽药品的活性对比
1)样品信息
样品名称 母液浓度
索玛鲁肽注射液 1.34mg/ml
索玛鲁肽氨基端甲醛化物 1.34mg/ml
2)细胞信息
细胞名称：HEK 293/GLP-1R/F3；组织学来源：人胚肾上皮细胞(稳转人GLP-1R)；细胞来源：齐鲁制药研究院生物所提供。
3)给药体系：
Figure BDA0002330900310000101
1.HEK293/GLP-1R/F3细胞，5×104/孔，双复孔，37℃±2℃，5％±1％CO2培养箱中孵育4 小时±15分钟；
2.4小时后取出，每孔加入
Figure BDA0002330900310000102
Luciferase Assay System，振荡40分钟±10分钟； 在酶标仪上进行读板(发光，620/40nm)。
3.测得Luminescence值，计算Mean，SD；用GraphPad Prism7软件作图和计算EC50值。
4.实验结果
索玛鲁肽氨基端甲醛化物 索玛鲁肽注射液
EC<sub>50</sub> 0.002622 0.1884
R<sup>2</sup> 0.6138 0.9239
从说明书图1及上述表格可以看出，与索玛鲁肽药品对比，索玛鲁肽氨基端甲醛化物 完全失去了与索玛鲁肽分子相对应的生物学活性。因此，索玛鲁肽药品的质量控制中有必 要严格限制索玛鲁肽氨基端甲醛化物的存在。

Claims (12)

1.一种索玛鲁肽氨基端甲醛化物，具有式II结构：
Figure FDA0002330900300000011
2.权利要求1所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物的制备方法，所述方法包括：固相多肽合成法制备侧链全保护索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-树脂，侧链全保护索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-树脂的裂解，索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品的纯化，索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品的制备，索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品的纯化及冷冻干燥。
3.根据权利要求2所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)以Fmoc-Gly-Wang树脂或Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl树脂为原料，加入氨基脱保护试剂，脱除所述树脂上的Fmoc保护基；
(2)将步骤(1)脱除Fmoc保护基的树脂在活化助剂和缩合剂存在下采用固相合成逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，每一个偶联反应均以茚三酮检测阴性为反应终点，每一轮Fmoc氨基酸偶联反应完毕后都使用氨基脱保护试剂脱除Fmoc保护基，然后再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到氨基酸侧链官能团全保护[2-31]-索玛鲁肽主链肽-树脂：
Fmoc-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂
(3)将步骤(2)制备得到的氨基酸侧链官能团全保护[2-31]-索玛鲁肽主链肽-树脂用氨基脱保护试剂脱除Fmoc保护后，再与(S)-(Boc)2-组氨酸甲醛化物(式Ⅲ)在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，得到氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-树脂；
Figure FDA0002330900300000021
(4)经酸性裂解试剂裂解同步除去氨基酸侧链官能团全保护的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链肽-树脂上的树脂和保护基团，经沉淀，得到索玛鲁肽氨基端甲醛化物的主链粗品；
(5)将上述步骤(4)得到的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品经反相高效液相色谱进行纯化；
(6)将上述步骤(5)经纯化得到的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链与索玛鲁肽谷氨酰胺脂肪侧链进行偶联得到带有保护基的索玛鲁肽氨基端甲醛化物，并用酸性裂解试剂脱去谷氨酰胺脂肪侧链上的两个叔丁基保护基，得到索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品；
带有两个叔丁基保护基的索玛鲁肽谷氨酰胺脂肪侧链的活性酯具有式(Ⅳ)结构：
Figure FDA0002330900300000022
(7)将上述步骤(6)所得到的索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品经过反相高效液相色谱进行纯化，合并纯化后的组分，经过冷冻干燥得到索玛鲁肽氨基端甲醛化物纯品。
4.根据权利要求3所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述氨基脱保护剂为10～30％(V/V)哌啶(PIP)/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，优选为20％；所述氨基脱保护剂用量为每毫摩尔投料树脂20～40ml，优选为每毫摩尔投料树脂30ml；脱保护反应时间为20～50分钟，优选为30～40分钟。
5.根据权利要求3所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物的制备方法，其特征在于：步骤(2)和(3)所述缩合试剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N，N，N’，N-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)中的一种或多种；优选为N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)中的一种或多种；所述缩合试剂的摩尔用量为树脂中氨基总摩尔数的2～6倍，优选为2.5～3.5倍；
步骤(2)和(3)所述活化助剂选自1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲脲六氟磷酸酯(HBTU)至少中的一种；活化助剂用量为氨基树脂中氨基总摩尔数的2～6倍，优选2.5～3.5倍；
步骤(2)和(3)的偶联反应的反应时间为60～150分钟，优选为90～120分钟。
6.根据权利要求3所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物的制备方法，其特征在于：步骤(4)所使用的酸性裂解试剂为：三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯甲硫醚、乙二硫醇和水组成的混合物，三氟乙酸：苯酚：苯甲硫醚：乙二硫醇：水＝90～95:0～5:0～5:0～5:0～5体积比；切肽试剂与树脂的体积重量比为5-20ml/g。
7.根据权利要求3所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物的制备方法，其特征在于：步骤(5)所述索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品的纯化方法，高效液相色谱柱参数为：色谱填料为10微米的反相C18固定相，色谱柱直径为50毫米，长度为250毫米，步骤如下：
称取索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链粗品加入到适量水中进行超声溶解，然后进行微孔滤膜过滤，滤液再用高效液相色谱柱纯化，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈溶液，梯度洗脱，循环纯化，合并主峰溶液后减压浓缩，得到含有乙腈的索玛鲁肽氨基端甲醛化物主链水溶液。
8.根据权利要求3所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物的制备方法，其特征在于：步骤(6)所述的偶连索玛鲁肽谷氨酰胺脂肪侧链所用的碱选自N,N-二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉、三乙胺中的一种，优选N,N-二异丙基乙基胺；反应pH为9.0～11.0，优选为9.5～10.5；
步骤(6)索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品的制备中酸性裂解剂为三氟乙酸、乙腈组成的混合物，三氟乙酸：乙腈＝70～90:10～30体积比，优选80:20。
9.根据权利要求3所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物的制备方法，其特征在于：步骤(7)所述索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品的纯化方法，高效液相色谱柱参数为：色谱填料为10微米的反相C18固定相，色谱柱直径为50毫米，长度为250毫米，步骤如下：
称取索玛鲁肽氨基端甲醛化物粗品加入到水/乙腈(体积比5/1)中搅拌溶解，微孔滤膜过滤，滤液用高效液相色谱柱纯化，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈溶液，梯度洗脱，循环纯化，合并主峰溶液减压浓缩，冷冻干燥得到索玛鲁肽氨基端甲醛化物。
10.权利要求1所述的索玛鲁肽氨基端甲醛化物在制备药物标准品和对照品中的应用。
11.一种安全性高的药物组合物，所述药物组合物含有索玛鲁肽或其药学上可接受的盐和含量不高于0.5％的其它相关物质；且权利要求1所述式II化合物的含量不高于0.1％。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其为索玛鲁肽注射剂。
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