CN113061644A - 一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置及其应用 - Google Patents

Abstract

一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置及其应用，属于食品安全技术领域。为了解决利用传统微生物学方法以及分子生物学方法检测克罗诺杆菌中存在的问题，本发明提供了一种纸基检测装置，所述纸基检测装置的检测原理为克罗诺杆菌经超声破碎处理可产生胞内酶α‑葡萄糖苷酶，可在经底物XαGlc修饰的纸基检测装置上发生特异性酶‑底物反应，进而能够在纸基装置上快速、直观对克罗诺杆菌进行定性与定量。本发明获得的纸基检测装置具有制作方法简单、成本低以及装置灵敏度高等特点，可用于实时检测食品及食品加工过程中的克罗诺杆菌污染，尤其是婴幼儿配方奶粉生产中的克罗诺杆菌污染。

Description

一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置及其应用，属于食品安全技术领域。

背景技术

近年来，随着一系列涉及食源性致病菌的奶粉召回和重大感染事件的爆发，克罗诺杆菌的污染问题引起了全世界的关注。克罗诺杆菌能够污染婴幼儿配方乳粉(PIF)引起新生儿严重的菌血症、坏死性小肠结肠炎以及脑膜炎等疾病，与其他食源性致病菌相比，该菌感染率不高，但对于特殊人群有高达40％—80％致死率。因此预防和检测克罗诺杆菌至关重要。

克罗诺杆菌隶属于肠杆菌科，为能运动、周生鞭毛、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌为条件性致病菌，对营养要求不高，基础的肉汤培养基即可满足生长繁殖的需要。克罗诺杆菌属的α-葡萄糖苷酶是区别于肠杆菌科其他菌属的一个重要特征，可分解5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷特异性酶底物，呈现蓝绿色易于辨别。

目前，对克罗诺杆菌的检测方法主要有传统微生物学法以及新兴分子生物学法，如聚合酶链式扩增反应(PCR)和等温扩增技术等。传统的微生物学方法耗时长且检测效率低，无法满足对于致病菌快速、方便、高通量以及高灵敏度检测的要求，因此迫切需要一种操作简单、快速的检测技术。新兴的分子技术由于扩增的核酸可能来自死亡细胞，可能会造成结果不准确等问题。其中一些检测方法还存在着仪器昂贵，需要专业技术人员操作等问题。大多数基于开发克罗诺杆菌特异性免疫传感器的研究都是使用自己研制的抗体，但制备过程非常复杂和困难，目前还没有针对这种细菌的商业抗体。因此，迫切需要一种更简单、经济、快速检测的活菌检测分析系统。

微流体纸基分析装置由于其价格便宜、便携、易于检测等优点为发展中国家或资源匮乏地区提供了一种很好的替代技术，将会是未来快速检测小型化、便携化的必然趋势。目前对于在纸基装置上对细菌的特异性检测研究较少，还没有利用该原理在纸基上检测克罗诺杆菌的报道。

发明内容

为了解决利用传统微生物学方法以及分子生物学方法检测克罗诺杆菌中存在的问题，本发明提供了一种更简单、经济、快速地检测克罗诺杆菌的纸基检测装置，所述纸基检测装置以Whatman No.1滤纸作为纸基材料，通过PVC胶板处理及5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰获得。

在本发明的一个实施例中，所述PVC胶板处理Whatman No.1滤纸的方法为：

S1、将PVC胶板切割成若干个边长为1cm×1cm的方形底板；

S2、将Whatman No.1滤纸用圆形打孔器进行打孔，打孔下来的圆形滤纸留存备用；

S3、用同样孔径尺寸的圆形打孔器在切割后的底板区域中心进行手动打孔；

S4、将一张同样形状大小的未打孔的PVC胶板作为底板，揭去底板和S3获得的打过孔的PVC胶板涂有黏胶的一侧保护薄膜，压紧对贴粘合，把S2获得的同孔径的滤纸放置在暴露的带有黏胶的孔中，用力压制使三者充分粘合，装置制作完成。

进一步地限定，所述打孔器的孔径为4mm-8mm。

在本发明的一个实施例中，所述5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰方法为：将柠檬酸-磷酸盐缓冲液与DMF按照1:1的体积比混合，用于稀释5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液，再向经PVC胶板处理后的滤纸上滴加10μL稀释后的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液，干燥后完成修饰过程。

进一步地限定，所述稀释后的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液浓度为0.5mM～10mM。

进一步地限定，所述柠檬酸-磷酸盐缓冲液中柠檬酸溶液浓度为0.1M，磷酸氢二钠溶液浓度为0.2M。

进一步地限定，所述纸基检测装置的承载温度为-20℃～80℃，加样量为8μL～20μL。

本发明还提供了利用所述的纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法，具体步骤如下：

步骤一、将克罗诺杆菌菌液离心后，用柠檬酸-磷酸缓冲液将菌体沉淀洗涤2～3次，然后加入与原菌液相同体积的柠檬酸-磷酸缓缓冲液重悬菌体；

步骤二、将重悬后的菌体进行超声，每超声10s，暂停15s为一个循环，共循环3～5次，超声参数为130W，22kHz，全程进行冰水浴；

步骤三、取8μL～20μL步骤二获得的上清液滴入纸基检测装置的加样孔，等待显色。

进一步地限定，步骤一中的柠檬酸-磷酸缓冲液的pH为6.0～7.5；步骤三所述显色反应在37℃条件下进行。

本发明还提供了所述的纸基检测装置在实时检测食品及食品加工过程中克罗诺杆菌污染中的应用。

有益效果

本发明的原理在于，克罗诺杆菌经超声破碎处理可产生胞内酶α-葡萄糖苷酶，可与纸基检测装置修饰的底物XαGlc发生特异性酶-底物反应。

1)本发明首次构建针对克罗诺杆菌的纸基检测装置，制作方法简单、成本低以及装置精密度高，为检测克罗诺杆菌提供新思路，为纸芯片检测技术在致病菌检测中的应用提供理论基础。同时，本发明具有灵敏、快速以及准确等优点，在乳制品生产以及乳制品安全保障方面具有重要意义。

2)本发明利用酶与底物特异性反应的原理实现对克罗诺杆菌的特异性检出，避免了假阳性的产生，同时，纸基材料的应用大大降低了该检测装置的成本，避免其他检测方式重复利用带来的交叉污染等影响。

3)利用本发明建立的方法可用于实时检测食品及食品加工过程中克罗诺杆菌，尤其是对婴幼儿配方奶粉生产中的克罗诺杆菌污染。

附图说明

图1.纸基检测装置PVC处理方法示意图；

图2.蜡笔、马克笔以及PVC胶板三种不同处理方式下的纸基检测装置的重现性与精密度的比较结果；

图3.纸基检测装置底物修饰浓度的检测结果；

图4.超声破碎时间对检测效果的影响；

图5.显色反应温度对检测效果的影响；

图6.显色反应干燥时间对检测效果的影响；

图7.反应pH对检测效果的影响；

图8.纸基检测装置灵敏度考察结果；

图9.纸基检测装置重现性考察结果；

图10.纸基检测装置稳定性考察结果；

图11.纸基检测装置实用性考察结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做出进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例所用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规的材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得，所用各种菌株均来源于东北农业大学乳品重点实验室。

实施例一、纸基检测装置的制备方法

(1)纸基处理方式的选择

以Whatman No.1滤纸为纸基材料，分别比较蜡笔、马克笔以及PVC胶板三种不同处理方式下的纸基检测装置的重现性与精密度。

1.蜡笔处理

利用灰色蜡笔在Whatman No.1滤纸沿着圆形部件进行外围的图案绘制，手绘图案后进行加热处理，使其完全浸透滤纸，形成疏水区域。加热条件为：加热温度120℃，加热时间5min。干燥后对装置进行图像扫描与分析。

2.马克笔

利用办公常用的油性笔(马克笔)在滤纸上进行图案的绘制，同样沿着已画好的圆形曲线进行临摹，再将滤纸翻至背面沿着已画好的线条进行再次临摹。正反两面都要绘上油性笔墨，并确保笔油相互浸透纸张。干燥后进行图像扫描与分析。

3.PVC胶板

将PVC胶板用台式切纸刀切割成若干个所需边长为1cm×1cm的方形底板，留存备用；将Whatman No.1滤纸用圆形打孔器进行打孔，打孔下来的圆形滤纸留存备用；再用同样孔径尺寸的圆形打孔器在切割后的底板区域中心进行手动打孔，然后将同样形状大小的未打孔的PVC胶板作为底板，揭去两个PVC胶板涂有黏胶的一侧保护薄膜，压紧对贴粘合，把同孔径的滤纸放置在暴露的带有黏胶的孔中，用力压制使三者充分粘合，装置制作完成。制作示意图如图1。

蜡笔、马克笔以及PVC胶板三种不同处理方式下的纸基检测装置的重现性与精密度的比较结果如图2，根据比较结果选用效果较好的PVC胶板处理纸基材料。

(2)利用上述PVC胶板处理方式制作纸基检测装置，分别评价装置孔径大小、加样量以及耐受温度的功能性。

利用实施例1中PVC胶板处理方式制作纸基检测装置，分别评价装置孔径大小、加样量以及耐受温度的功能性。

①装置孔径的影响

基于不同孔径的打孔器对滤纸进行打孔，直径分别为4mm、5mm、6mm、7mm、8mm，通过滴加适宜体积的红色食品染料进行灰度值分析，确定最优孔径的选择。

在圆孔直径分别为4mm、5mm、6mm、7mm、8mm的微斑装置中滴加相同体积的红色染料，最终确定直径为6mm的反应孔为最佳。

②装置加样量的影响

针对每个孔径进行装置反应体系加样量的最佳范围的确定。添加量从1μL-30μL梯度添加，最终通过纸基装置的承载能力与浸透量，确定纸基装置所承载的最佳样品添加量的范围。梯度添加，最终确定在8μL-20μL时效果最好。

③耐受温度的影响

将基于PVC底板制作而成的纸基检测装置，放置于-20℃、4℃、25℃、37℃、80℃这几个具有代表性的温度中，考察装置在不同温度下的承受能力，是否仍然可以进行检测。

结果表明。将制作好的装置放置于-20℃、4℃、25℃、37℃、80℃这5个具有代表性的温度下一段时间后滴加试剂，试剂仍能够快速流通且装置无任何破损开裂的现象发生，说明装置的温度承受范围较广，利于各种恶劣环境下的现场即时检测的需求。

(3)基于上述获得的优选方案，对装置进行底物修饰，探究底物浓度对检测结果的影响。

配制浓度不同的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷(XαGlc)溶液，分别为：0.5mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、6.0mM、7.0mM、8.0mM、9.0mM、10.0mM，各取10μL在纸基装置上进行滴加修饰。干燥后，用适量的α-葡萄糖苷酶进行检测及量化。其检测结果如图3所示，随着底物浓度的增加，显色反应的颜色逐渐加深；当底物XαGlc的浓度达到8mM时，反应颜色最深，灰度值达到最大约为72，随后底物浓度再增加，检测结果灰度值几乎不变，由此可以确定8mM时底物与α-葡萄糖苷酶反应完全并处于最佳状态，最终选择8mM的底物浓度为最佳修饰浓度。

综上所述，优化后的纸基检测装置的制备方法如下：

步骤一、PVC胶板处理：

S1、将PVC胶板切割成若干个边长为1cm×1cm的方形底板；

S2、将Whatman No.1滤纸用直径6mm的圆形打孔器进行打孔，打孔下来的圆形滤纸留存备用；

S3、用同样孔径尺寸的圆形打孔器在切割后的底板区域中心进行手动打孔；

S4、将一张同样形状大小的未打孔的PVC胶板作为底板，揭去底板和S3获得的打过孔的PVC胶板涂有黏胶的一侧保护薄膜，压紧对贴粘合，把S2获得的同孔径的滤纸放置在暴露的带有黏胶的孔中，用力压制使三者充分粘合，装置制作完成。

步骤二、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰

将柠檬酸-磷酸盐缓冲液与DMF按照1:1的体积比混合，用于将5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的浓度稀释至8mM，再向经PVC胶板处理后的滤纸上滴加10μL稀释后的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液，干燥后完成修饰过程。所述柠檬酸-磷酸盐缓冲液中柠檬酸溶液浓度为0.1M，磷酸氢二钠溶液浓度为0.2M。

获得的纸基检测装置的承载温度为-20℃～80℃，加样量为8μL～20μL。

实施例2、利用纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法

(一)利用纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法

(1)菌株的活化与培养

以阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544作为实验的标准菌株，将该菌按照2％接种量接种于TSB培养基中，37℃、200r/min条件下培养12h后三区划线于TSA平板上，37℃培养12-16h后长出单菌落，挑单菌落接种于TSB培养基中进行二次活化，用于后续实验。

(2)克罗诺杆菌属的特异性酶的获取

为了能够获取克罗诺杆菌属的特异性酶即α-葡萄糖苷酶，需要对菌体细胞进行破碎处理。为避免在超声破碎中对α-葡萄糖苷酶造成失活等影响，需要对超声处理的条件进行优化研究，已达到最佳的检测效果。超声前菌体的准备：将阪崎克罗诺杆菌浓度为10⁹CFU/mL的菌液离心后，用柠檬酸-磷酸缓冲液将菌体沉淀洗涤2-3次，然后按原菌液体积加入缓冲液重悬菌体。随后进行不同时间的超声处理，经预实验研究后确定超声参数为130W，22kHz，全程进行冰水浴。

对超声时间进行优化超声时间分别为25s、50s、75s、100s、125s、150s、175s(本实验以超声破碎的总时间为自变量)，并且全程进行冰水浴。超声后分别吸取20μL滴加到同浓度且足量的XαGlc底物修饰的装置中进行检测并量化，结果如图4。

结果表明，超声总时间在75s～125s(循环3～5次)这一区间时，灰度值较大，颜色也较深，有明显的显色结果，说明超声破碎较完整。而超声低于75s或者高于125s时显色反应不明显，说明低于75s时破碎不完全，而高于125s时阪崎克罗诺杆菌的部分α-葡萄糖苷酶已失活，超声175s时已经完全失活。在超声总时间为100s时灰度值达到最大，颜色最深，说明适用于本检测体系的最佳超声总时间为100s。

(3)取上述超声获得的上清液滴入纸基检测装置的加样孔，等待显色。

①显色反应温度

将浓度为8mM的XαGlc底物溶液分别吸取10μL进行纸基检测装置的修饰。用菌液浓度为10⁹CFU/mL的阪崎克罗诺杆菌超声处理后进行滴加，然后分别放置在4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、80℃的不同温度条件使其进行酶-底物的显色反应，并实时观察检测结果以及纸基装置颜色固定所需最短时间，扫描后进行灰度值分析，结果如图5。

结果表明，37℃以下反应颜色都要比高温条件下深，且25℃和37℃颜色差异不大，但反应装置的固色时间有显著差异。本实验在探究温度的同时也测定了装置所需的最短干燥时间。结合温度与颜色固定时间可得出37℃时比色反应效果最佳且装置的干燥固定时间最适宜为1h，4℃与25℃的干燥时间过长，不符合本研究的检测时间需求，故选择37℃为最适反应温度。

②干燥时间

在温度优化的实验中，对于干燥时间也进行了测定，由于在装置未干燥的情况下不能放入扫描仪中进行扫描，所以针对最短干燥时间以及时间长短对显色结果的影响程度也进行了研究，结果如图6。

结果表明，此过程是一个从绿色到靛蓝色的变化过程，当60min以后颜色固定已基本完成且纸基装置干燥完全，还可以得出在装置干燥后颜色在一定时间内不会发生变化，说明干燥后显色结果较稳定，易于数字图像的读取。

③反应PH

配制9个不同pH的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH值分别为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，用于纸基芯片上的阪崎克罗诺杆菌的检测，扫描检测结果后形成数字图像进行量化分析。结果如图7。

结果表明，此酶促反应的适宜pH范围接近2个单位，pH 6.0～7.5都适宜本实验的检测条件，但在pH值为6.5时，灰度值达到最大，反应颜色最深，所以本研究的最优pH值为6.5。

综上所述，得到优化后的用纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法如下：

步骤一、将克罗诺杆菌菌液离心后，用pH为6.5的柠檬酸-磷酸缓冲液将菌体沉淀洗涤2～3次，然后加入与原菌液相同体积的pH为6.5柠檬酸-磷酸缓缓冲液重悬菌体；

步骤二、将重悬后的菌体进行超声，每超声10s，暂停15s为一个循环，共循环4次，超声参数为130W，22kHz，全程进行冰水浴；

步骤三、取8μL～20μL步骤二获得的上清液滴入纸基检测装置的加样孔，等待显色，显色反应在37℃条件下进行。

(二)纸基检测装置灵敏度考察

基于实施例1建立纸基检测装置及实施例2获得的利用所述纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法，以阪崎克罗诺杆菌ATCC29544为例，将纯培养物梯度稀释为10⁹CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL、10²CFU/mL、10CFU/mL浓度的纯菌液，以8mM的XαGlc为底物，在37℃，pH为6.5的条件下，反应1h后进行图像扫描，然后将图片导入Image J图像软件进行灰度值分析，结果如图8。

结果表明，在菌液浓度为10¹～10⁵CFU/mL时，没有明显颜色变化；当阪崎克罗诺杆菌浓度为10⁶CFU/mL时有微弱的显色，灰度值达到20以上，但并不是特别明显；浓度达到10⁷CFU/mL时，可以看到反应结果呈现浅蓝色；当浓度达到10⁸CFU/mL时，肉眼明显可以看到反应所形成的靛蓝色；而菌液浓度达到10⁹CFU/mL时，形成很深的靛蓝色，此时灰度值最大。可知纯菌培养后，若量化后检测限可达到10⁶CFU/mL。

(三)纸基检测装置特异性考察

基于实施例1建立纸基检测装置及实施例2获得的利用所述纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法，选取了克罗诺杆菌属的全部7个菌种和非克罗诺杆菌属的12个菌种，共30个菌株进行了特异性实验。通过改良的选择性增菌肉汤与特异性酶反应结合测定的方法，来验证本实验方法的特异性。特异性实验是通过纯培养使菌液浓度达到10⁹CFU/mL时进行检测。实验重复3次，确定检出结果，结果如表1所示。

表1.纸基检测装置特异性考察结果

(四)纸基检测装置重现性考察

基于实施例1建立纸基检测装置及实施例2获得的利用所述纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法，分别随机选取了6个同一批次和不同批次制备的纸基检测装置，对检测方法的组内差异和组间差异进行了考察。一般认为相对标准偏差小于5％可说明其重现性良好，所以通过平均灰度值计算得到相应的相对标准偏差RSD值与5％进行比较，确定其是否满足理论要求，结果如图9。

结果表明，通过计算可知，组内差异与组间差异的检测结果RSD值分别为2.65％和4.67％，两者都小于5％；一般认为相对标准偏差小于5％可说明其重现性良好。本实验方法和检测装置都符合理论要求，并且通过两者的RSD值也可以看出组内差异性比组间差异性小，符合理论要求。

(五)纸基检测装置稳定性考察

基于实施例1建立纸基检测装置及实施例2获得的利用所述纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法，分别选取4℃和室温这两种常见的贮存温度条件，保持其他条件一致，每7天(一周)进行一次测量，连续6周，对纸基检测装置的稳定性进行测试与分析，结果如图10。

结果表明，贮藏条件为4℃时比室温更易于保存，贮存时间较长。室温条件下第3周测量时装置稳定性已出现明显的下降，说明底物在贮存期可能出现了氧化降解现象，稳定性降低。而在4℃时前5周都保持良好的稳定性，在第6周时才出现平均灰度值的明显降低，稳定性开始下降。所以可得出，该纸基检测装置常温可保存2周，4℃贮藏条件下可保存约一个月且装置稳定性良好，检测结果更准确。

(六)纸基检测装置实用性考察

为了评估此检测方法的实用性，我们采取了器壁表面规范的涂抹采样，将活的致病菌接种到面积为100cm²的无菌正方形钢板表面并用纸基装置进行检测。在每个钢板表面的若干个10cm²的正方形区域上用固定的标记物进行标记。在TSA上通过平板涂布确定菌体的初始浓度随后用缓冲液进行连续地梯度稀释将实验区域进行涂抹，使其最终实验区域的菌液浓度分别为10¹CFU/cm²、10²CFU/cm²和10³CFU/cm²并设置空白对照组和无菌对照组。将实验样品放置在无菌的生物安全柜中干燥数小时，待样品干燥后，用Phast Swab的采样棉签在每10cm²进行彻底擦拭；擦拭后的棉签放置在Phast Swab的含有2mL的改良CSB增菌培养基的容量器中，放置在37℃的培养箱中进行震荡富集。将样品分别在不同的富集时间0h、3h、6h、8h、10h、12h进行检测并同时接种于CCI选择性琼脂进行方法验证，扫描检测结果进行灰度值分析并确定最低检测限，结果如图11。

结果表明，可肉眼观测到明显的显色反应是菌液浓度为10²CFU/cm²的初始菌液浓度，8h后可检测出阪崎克罗诺杆菌，并且可以明显观察到右边最先分离的数据点与左边对应的检测点相对应，可得出在实际样品的表面涂抹实验中，最短检测时间为8h，其对应的检测限10²CFU/cm²。而最低检测限可达到10CFU/cm²，但检测时间需要10h。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种检测克罗诺杆菌的纸基检测装置，其特征在于，所述纸基检测装置以WhatmanNo.1滤纸作为纸基材料，通过PVC胶板处理及5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰获得。

2.根据权利要求1所述的纸基检测装置，其特征在于，所述PVC胶板处理Whatman No.1滤纸的方法为：

S1、将PVC胶板切割成若干个边长为1cm×1cm的方形底板；

S2、将Whatman No.1滤纸用圆形打孔器进行打孔，打孔下来的圆形滤纸留存备用；

S3、用同样孔径尺寸的圆形打孔器在切割后的底板区域中心进行手动打孔；

S4、将一张同样形状大小的未打孔的PVC胶板作为底板，揭去底板和S3获得的打过孔的PVC胶板涂有黏胶的一侧保护薄膜，压紧对贴粘合，把S2获得的同孔径的滤纸放置在暴露的带有黏胶的孔中，用力压制使三者充分粘合，装置制作完成。

3.根据权利要求2所述的纸基检测装置，其特征在于，所述打孔器的孔径为4mm-8mm。

4.根据权利要求1所述的纸基检测装置，其特征在于，所述5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液的修饰方法为：将柠檬酸-磷酸盐缓冲液与DMF按照1:1的体积比混合，用于稀释5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液，再向经PVC胶板处理后的滤纸上滴加10μL稀释后的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液，干燥后完成修饰过程。

5.根据权利要求4所述的纸基检测装置，其特征在于，所述稀释后的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷溶液浓度为0.5mM～10mM。

6.根据权利要求4所述的纸基检测装置，其特征在于，所述柠檬酸-磷酸盐缓冲液中柠檬酸溶液浓度为0.1M，磷酸氢二钠溶液浓度为0.2M。

7.根据权利要求1所述的纸基检测装置，其特征在于，所述纸基检测装置的承载温度为-20℃～80℃，加样量为8μL～20μL。

8.利用权利要求1所述的纸基检测装置检测克罗诺杆菌的方法如下：

步骤一、将克罗诺杆菌菌液离心后，用柠檬酸-磷酸缓冲液将菌体沉淀洗涤2～3次，然后加入与原菌液相同体积的柠檬酸-磷酸缓缓冲液重悬菌体；

步骤二、将重悬后的菌体进行超声，每超声10s，暂停15s为一个循环，共循环3～5次，超声参数为130W，22kHz，全程进行冰水浴；

步骤三、取8μL～20μL步骤二获得的上清液滴入纸基检测装置的加样孔，等待显色。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤一中的柠檬酸-磷酸缓冲液的pH为6.0～7.5；步骤三所述显色反应在37℃条件下进行。

10.权利要求1所述的纸基检测装置在实时检测食品及食品加工过程中克罗诺杆菌污染中的应用。

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