CN113046391A - 一种crbn基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰技术领域，特别涉及一种CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法和用途。一种CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，所述构建方法包括：将肿瘤细胞引入人源化小鼠中，所述人源化小鼠的CRBN基因包括I391V突变。本发明构建的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型不仅可用于免疫调节药物药效的评估，对药物开发的临床效果也具有重要的指导意义。同时也是IMiDs类药物安全性评价的理想小鼠肿瘤细胞模型，可对IMiDs类药物的毒理学进行临床前体评价，填补了市场空白。

Description

一种CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法和用途
技术领域
本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰技术领域，特别涉及一种CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法和用途。
背景技术
Immunomodulatory drugs(IMiDs)是指沙利杜安(Thalidomide)及其结构和功能类似物，是免疫系统的有效调节剂。从上个世纪60年代至今，Thalidomide及其类似物，先后被发现可以用来治疗麻风病，多发性骨髓瘤，骨髓异常增生等疾病。这类药物治疗这些疾病的机制大致上可以分为两类，一类是同通过免疫调节作用，另一类就是通过靶向CRL4-CRBNE3泛素连接酶来促进一些对肿瘤存活至关重要的蛋白的泛素化降解，如IKZF1，IKZF3和CK1α。
目前IMiDs类药物的免疫调节作用包括抗炎症作用，增强NK细胞活性和共刺激T细胞。目前这些免疫调节作用的靶点尚不明确，已有的文章提出IMiDs类药物共刺激T细胞的作用是通过靶向CRL4-CRBN E3泛素连接酶来介导IKZF1/3蛋白的泛素化降解，进而促进IL2的分泌，共刺激T细胞。在基于T细胞免疫的免疫疗法高速发展的今天，即使已经有一些文献报道了IMiDs可以通过非直接杀伤肿瘤细胞的方式在一些实体瘤中发挥治疗效果，并可能它的免疫调节作用有关，IMiDs类药物对于T细胞的共刺激作用并没有得到很好的开发应用。阻碍IMiDs类药物作为免疫治疗药物或者佐剂的最大障碍在于缺少合适的临床前动物模型。IMiDs类药物的直接作用靶点CRBN蛋白在人和鼠之间存在着一些差别，尤其是在这类药物的结合位点附近。这些差别使得小鼠的CRBN无法响应IMiDs类药物的处理。
有文献报道将小鼠CRBN基因中第391位的异亮氨酸突变为缬氨酸可以使得小鼠的CRBN对IMiDs类药物产生响应。所以构建合适的人源化小鼠有利于促进已有的IMiDs类药物，包括Lenalidomide和Pomalidomide作为免疫治疗药物或者佐剂的临床前研究。与此同时，新的IMiDs类药物正在源源不断产生，因此构建好的人源化动物肿瘤细胞模型将会促进这些老药和新药的临床前研究。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明提供一种CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法和用途，用于解决现有技术中存在的问题。
为了实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过包括采用如下技术方案获得。
本发明的目的之一在于提供一种CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，所述构建方法包括：
将肿瘤细胞引入人源化小鼠中，所述人源化小鼠的CRBN基因包括I391V突变。
优选地，所述肿瘤细胞选自结肠癌细胞、黑色素瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞和淋巴癌细胞中的一种。
优选地，所述肿瘤细胞来源于小鼠。
优选地，所述肿瘤细胞经皮下注射或尾静脉注射被引入人源化小鼠中。
优选地，所述肿瘤细胞为过表达抗原的肿瘤细胞，优选的，所述抗原选自OVA、NY-ESO-1、HER2中的一种或几种。
更优选地，所述过表达抗原的肿瘤细胞的构建方法包括：在所述肿瘤细胞的基因组中整合用于编码所述抗原的多核苷酸，优选的，通过病毒包装将所述抗原的编码基因包装到慢病毒中，侵染所述肿瘤细胞。
优选地，所述肿瘤细胞为人源化肿瘤细胞，所述人源化肿瘤细胞为包括CRBNI391V突变的肿瘤细胞。
优选地，所述人源化小鼠的构建方法包括：
1)在小鼠受精卵细胞中引入所述CRBN基因I391V突变；
2)育种和/或筛选以提供所述人源化小鼠。
本发明的目的之二在于提供一种由上述所述构建方法构建的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型。
本发明的目的之三在于提供一种筛选免疫调节药物的方法，包括：
将免疫调节药物施用于如上述所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型；
优选的，还可以包括：
通过被施用免疫调节药的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的变化，筛选免疫调节药的候选药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明构建了一套评估IMiDs类药物(如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)作为免疫治疗药物或者佐剂的临床前研究平台，可以应用于探索已有IMiDs类药物的免疫治疗潜力，也可以用于探索新开发的IMiDs类药物。
与现有的直接通过临床实验评估这类药物的免疫治疗潜力相比，本发明提供的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型中将会节省大量的非必要成本，同时也可以提高探索的效率。
附图说明
图1显示为本发明CRBN基因第11外显子突变前后的图。
图2显示为本发明两条sgRNA的体外切割效率图。
图3显示为本发明实施例5中F0代小鼠的基因图。
图4显示为本发明实施例5中野生型小鼠、杂合子小鼠和纯合子小鼠的基因图。
图5显示为本发明实施例5中基因编辑对小鼠发育的影响图。
图6显示为本发明实施例7中MC38-OVA模型给药Lenalidomide后肿瘤的生长情况图。
图7显示为本发明实施例7中CD28-KO CRBNI391V杂交小鼠的T细胞CD28的缺失FACS验证图。
图8显示为本发明实施例7中Lenalidomide对CD28-KO CRBNI391V杂交小鼠的药效图。
图9显示为本发明实施例7中Lenalidomide和PD-1抗体联用对CD28-KO CRBNI391V杂交小鼠的药效图。
图10显示为本发明实施例8中T细胞激活实验中CD69表达结果图。
图11显示为本发明实施例8中T细胞毒性试验中MC38-OVA细胞活性图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodicupdates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1针对CRBN基因的CRISPR-Cas9表达系统的构建
如图1所述，CRBN基因第11外显子的碱基突变，其中_表示为插入的突变，
Figure BDA0002987003290000041
表示为同义突变。
1.1、根据CRBN第11外显子突变后序列，进行sgRNA的设计并获得sgRNA的序列
(1)设计sgRNA序列
通过苏州金唯智生物技术有限公司设计得到的两条sgRNA序列如下：
sgRNA-2：TCACGAGAAGCCTAGTACAA(SEQ ID No.2)
sgRNA-3：AAGATCTGTGCAAGCCATAT(SEQ ID No.3)
(2)CRISPR寡核苷酸链的合成
通过苏州金唯智生物技术有限公司合成2对CRISPR寡核苷酸链，分别如下所示：
第一对：
sgRNA-2oligo 1：5’–CACCGTCACGAGAAGCCTAGTACAA–3’；
sgRNA-2oligo 2:5’–AAAACTTGTACTAGGCTTCTCGTGAC–3’；
第二对：
sgRNA-3oligo 1：5’–CACCGAAGATCTGTGCAAGCCATAT–3’；
sgRNA-3oligo 2：:5’–AAACATATGGCTTGCACAGATCTTC–3’；
(3)sg RNA olligo退火
将sgRNA oligo序列进行磷酸化后梯度降温退火。具体步骤为：将合成的sgRNA-2oligo1和sgRNA-2oligo 2或sgRNA-3oligo1和sgRNA-3oligo 2，分别与10×T4 LigationBuffer混合后再加入水补齐体系，然后37℃孵育30min，再95℃，变性5min，之后在以5℃/min的速率降温至25℃，得到退火产物。
表1退火反应体系
1μL oligo 1(100μM)
1μL oligo 2(100μM)
1μL 10×，T4 Ligation Buffer(NEB)
7μL ddH<sub>2</sub>O
10μL Total
1.2、sgRNA载体质粒的构建：
(1)PX459质粒的切割
使用FastAP/FastDigest BbsI酶切PX459质粒，37℃，3h；反应体系如下：
表2酶切PX459质粒的反应体系
1μg PX459
1μl FastDigest BbsI(Fermentas)
1μl FastAP(Fermentas)
2μl 10×，FastDigest Buffer
Xμl ddH<sub>2</sub>O
20μl Total
PX459质粒经酶切后，使用回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作。
(2)退火产物与PX459的连接
用T4 DNA酶将退火产物与酶切后的PX459质粒进行连接，获得重组质粒。连接反应体系如表3，连接条件为16℃过夜。
表3连接反应体系
50ng BbsI digested plasmid
1μl annealed oligo duplex(1:200dilution)
2μL 10×，T4 DNA ligase Buffer(NEB)
XμL ddH<sub>2</sub>O
1μL T4 DNA ligase
20μL Total
(4)转化至感受态细胞
连接sgRNA的质粒转化至感受态细胞DH5α中，经测序无误后，获得构建好的重组质粒PX459-sgRNA-2和重组质粒PX459-sgRNA-3。
实施例2sgRNA和Cas9mRNA体外转录
本实施例中，进行sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录
利用T7-Cas9 PCR和T7-sgRNA PCR产物进行以T7启动子介导的体外转录，即以T7启动子作为体外转录的启动子，利用RNA聚合酶在体外实现从DNA到mRNA的转录过程。2.1、Cas9 mRNA的PCR
用MEGAshortscript T7 kit(Thermo Fisher,AM1354)体外转录T7-sgRNA PCR产物，T7-sgRNA PCR引物见表4，PCR的反应体系见下表5，PCR反应条件见表6。并回收PCR产物。
表4 T7-sgRNA PCR引物
引物名称 引物序列(5’—3’)
gRNA-F taatacgactcactataggTCACGAGAAGCCTAGTACA
gRNA-R AAAAGCACCGACTCGGTGCC
表5 PCR反应体系
Figure BDA0002987003290000061
表6 PCR反应条件
温度 时间 循环次数
98℃ 3min 1
98℃ 30s 29
60℃ 30s 29
72℃ 30s 29
72℃ 3min
2.2、Cas9mRNA的PCR
用MEGAshortscript T7 kit(Thermo Fisher,AM1354)体外转录T7-Cas9 PCR产物。T7-Cas9PCR产物见表7，PCR的反应体系见下表8，PCR反应条件见表9。并回收PCR产物。
表7 T7-Cas9 PCR引物
Figure BDA0002987003290000062
Figure BDA0002987003290000071
表8 PCR反应体系
Figure BDA0002987003290000072
表9 PCR反应条件
温度 时间 循环次数
98℃ 3min 1
98℃ 30s 29
58℃ 30s 29
72℃ 30s 29
72℃ 3min
2.3、转录sgRNA和Cas 9mRNA
将步骤2.1和2.2的PCR产物分别置于转录体系，在37℃反应4h，之后加入1μLTURBO DNase，37℃反应15min。之后利用MEGAclearTMKit(Thermo Fisher)分别回收转录产物备用。
表10转录反应体系
2μL T7 10X Reaction Buffer
2μL T7 ATP Solution(75mM)
2μL T7 CTP Solution(75mM)
2μL T7 GTP Solution(75mM)
2μL T7 UTP Solution(75mM)
～1μL (optional)Labeled ribonucleotide
XμL template DNA(final concentration 100μM)
2μL T7 enzyme mix
20μL Total
实施例3人源化修复模板ssRNA
本实施例中，通过苏州金唯智生物技术有限公司设计Cas9切割后CRBN基因修复的模板ssRNA，190nt，序列如下SEQ ID No.1，具体为：
Figure BDA0002987003290000081
其中，代表I391V的突变，
Figure BDA0002987003290000082
是引入的同义突变。
实施例4sgRNA切割效率评估
本实施例中，评估sgRNA-2和sgRNA-3体外切割效率，具体步骤和结果如下：
将转录好的sgRNA和Cas9 mRNA利用显微注射技术注射到受精3.5天的小鼠受精卵(sgRNA终浓度为10ng/μL,Cas9 mRNA终浓度为10ng/μL)。
培养至囊胚阶段后收样，进行鉴定。鉴定引物为：Primer F：GCTGGAGCCAACAGCAACATA；Primer R：TGGAATTGTGGGTAACAGAGCAG。
采用流式细胞仪分析样品种敲出CRBN的细胞比例，检测结果如图2，sgRNA-2和sgRNA-3的切割效率见下表11。
表11 sgRNA-2和sgRNA-3体外切割效率
Figure BDA0002987003290000083
从表11和图2可知，sgRNA-3具有更高的切割效率，后续试验将以sgRNA-3进行基因敲除的细胞系。
实施例5生产F0代小鼠
本实施例中，利用sgRNA-3、Cas9 mRNA和ssDNA生产F0代小鼠，并进行鉴定和筛选，包括如下步骤：
5.1、生产F0代小鼠
取受精3.5d的小鼠受精卵，利用显微注射仪将Cas9 mRNA、sg RNA、ss DNA的混合物(sgRNA终浓度为10ng/μL；Cas9 mRNA终浓度为10ng/μL；ssDNA终浓度为10ng/μL)，注射至小鼠受精卵细胞质中。然后在体外利用KSOM小鼠胚胎培养基(Millipore)，在5％CO2培养箱中，37℃，将受精卵培养至两细胞期。之后移植入假孕0.5天的ICR雌鼠子宫内，等待19-21天，可以得到F0代小鼠。
5.2、F0代小鼠的鉴定
以F0代小鼠的基因组DNA为模板，设计鉴定引物，进行扩增，对获得的PCR产物进行测序，引物序列如下表12。其中，F0代小鼠的鉴定引物如下
表12 F0代小鼠的鉴定引物
GCTGGAGCCAACAGCAACATA
TGGAATTGTGGGTAACAGAGCAG
5.3、F0代小鼠的筛选
将鉴定无误后的F0代小鼠与野生型小鼠交配，得到F1代小鼠；再经F1代小鼠杂合子相互交配，得到纯合的突变型小鼠，即人源化CRBNI391V小鼠。其中F0代小鼠的基因如图3所示，经再繁育过程中得到了野生型，杂合子和纯合子，如图4所示。
小鼠基因型检测如图4所示，测序结果表明人源化小鼠CRBN编码391位氨基酸的碱基发生了变化，对应的氨基酸从I变成了V。
并进一步，评估了基因编辑对小鼠发育的影响，评估结果如图5和表13。结果表明，基因编辑不会影响小鼠发育。小鼠的出生比率符合孟德尔遗传定律。如下表：
表13基因编辑对小鼠发育的影响
CRBN<sup>+/+</sup> CRBN<sup>I391/+</sup> CRBN<sup>I391V/I391V</sup> Total
Expected 15.5 31 15.5 62
Observer 16 33 13 62
实施例6构建MC38-OVA克隆细胞
本实施例中，构建对IMiDs类药物有增强T细胞免疫响应的体内MC38-OV克隆细胞，具体包括如下步骤：
6.1、构建重组载体pLenti 6.3-OVA
(1)设计鸡卵白蛋白OVA(Ovalbumin)序列
先通过苏州金唯智生物技术有限公司合成OVA，序列如SEQ ID No4，具体如下所示：ATGGGCTCCATCGGCGCAGCAAGCATGGAATTTTGTTTTGATGTATTCAAGGAGCTCAAAGTCCACCATGCCAATGAGAACATCTTCTACTGCCCCATTGCCATCATGTCAGCTCTAGCCATGGTATACCTGGGTGCAAAAGACAGCACC AGGACACAGATAAATAAGGTTGTTCGCTTTGATAAACTTCCAGGATTCGGAGACAGTATTGAAGCTCAGTGTGGCACATCTGTAAACGTTCACTCTTCACTTAGAGACATCCTCAACCAAATCACCAAACCAAATGATGTTTATTCGTTCAGCCTTGCCAGTAGACTTTATGCTGAAGAGAGATACCCAATCCTGCCAGAATACTTGCAGTGTGTGAAGGAACTGTATAGAGGAGGCTTGGAACCTATCAACTTTCAAACAGCTGCAGATCAAGCCAGAGAGCTCATCAATTCCTGGGTAGAAAGTCAGACAAATGGAATTATCAGAAATGTCCTTCAGCCAAGCTCCGTGGATTCTCAAACTGCAATGGTTCTGGTTAATGCCATTGTCTTCAAAGGACTGTGGGAGAAAACATTTAAGGATGAAGACACACAAGCAATGCCTTTCAGAGTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTACCAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTTCCATTTGCCAGTGGGACAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAACCTCACATCTGTCTTAATGGCTATGGGCATTACTGACGTGTTTAGCTCTTCAGCCAATCTGTCTGGCATCTCCTCAGCAGAGAGCCTGAAGATATCTCAAGCTGTCCATGCAGCACATGCAGAAATCAATGAAGCAGGCAGAGAGGTGGTAGGGTCAGCAGAGGCTGGAGTGGATGCTGCAAGCGTCTCTGAAGAATTTAGGGCTGACCATCCATTCCTCTTCTGTATCAAGCACATCGCAACCAACGCCGTTCTCTTCTTTGGCAGATGTGT TTCCCCTTAA
其中，_代表最终表达在肿瘤细胞中的片段。
(2)慢性病毒载体pLenti6.3-CMV-MCS和VOA片段的连接
用BamHI-HF/XhoI酶对慢性病毒载体pLenti6.3-CMV-MCS(from WuXi Apptec.)进行酶切，37℃孵育4小时，利用Zymoclean Gel DNA Recovery kit(ZYMO D4002)回收切割产物；其中，BamHI-HF/XhoI酶选自NEB公司。然后将VOA基因克隆入经酶切后的慢性病毒载体pLenti6.3-CMV-MCS中，在Quick ligase的连接下，于25℃中恒温孵育连接30min。
表14酶切反应体系
2μg pLenti6.3-CMV-MCS
0.5μL BanHI-HF(NEB)(20000U/mL)
0.5μL XhoI(NEB)(20000U/mL)
5μL CutSmart buffer(NEB)(10×)
50μL total
表15连接反应体系
100ng Vector
50ng Insetrt
10μL 2×Quick ligase buffer(NEB)
1μL Quick ligase(NEB)
XμL ddH<sub>2</sub>O
21μL Total
(3)转化至感受态细胞
将连接产物转入Endura感受态细胞中，经测序无误后，即获得正确的重组载体pLenti6.3-OVA。
6.2、包装病毒
将88.4μL Lipofectamine 2000(选自Invitrogen，编号11668019)和2.5mL opti-MEM(选自Gbico)混合均匀后5min，加入重组载体pLenti6.3-OVA 15μg、pvSVG质粒7.5μg、psPAX2质粒11.25μg和2.5mL opti-MEM(选自Gbico)，25℃孵育25min，得到混合物。在T150Flask中接种2.8×107/mL的人胚肾细胞293FT中，孵育25min。然后将混合物加入到T150Flask中与293FT细胞混匀，充分混匀育。12h后更换为含有10％FBS的DMEM新鲜培养基(Gibco，1X anti-anti)。继续培养，在48h～72h之间内收集细胞培养上清，获得含有慢病毒的上清。
6.3、病毒感染获得MC38-OVA克隆细胞
在浓度为0.5×106/mL的MC38细胞中加入1mL步骤6.2中制备获得的含有慢病毒的上清液以及1mLDMEM新鲜培养基，然后加入6μg/mL polybrene(购买自Sigma)。培养24h后，更换为2mL含有10％FBS的DMEM新鲜培养基(Gibco，1X anti-anti)。之后利用无限稀释法得到稳定表达OVA蛋白的MC38单克隆细胞，即MC38-OVA克隆细胞。
实施例7构建CRBN人源化肿瘤细胞
本实施例中，利用脂质体转染技术将实施例1获得的PX459-sgRNA-3和实施例3获得的人源化修复模板ssDNA导入实施例6中的MC38-OVA克隆细胞中。包括如下步骤：
将16μL Lipofectamine 2000(选自Invitrogen，编号11668019)和0.5mL opti-MEM(选自Gbico)混合均匀后5min，加入2μg重组载体PX459-sgRNA-3、2μg人源化修复模板ssDNA和2.5mL opti-MEM(选自Gbico)，25℃孵育25min，得到混合物。将孵育好的混合物，加入到先前准备好的0.5×106/mL的MC38-OVA克隆细胞中。24小时之后换液。
72小时之后开始准备挑取单克隆。利用无限稀释法，得到若干个CRBN被编辑过的MC38-OVA单克隆细胞。对这些单克隆利用如下的引物进行鉴定，获得CRBN人源化肿瘤细胞。
5’-GCTGGAGCCAACAGCAACATA-3’
5’-TGGAATTGTGGGTAACAGAGCAG-3’
实施例8构建CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型
构建CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型，有二种方法，其中一种为将实施例7获得CRBN人源化肿瘤细胞接种至实施例5获得的CRBN小鼠模型中；另外一种为将实施例6获得的MC38-OVA克隆细胞直接接种至实施例5获得的CRBN小鼠模型中，经研究发现，lenalidomide药物可以通过作用于小鼠的免疫系统来抑制肿瘤生长。本申请实施例中采用将实施例6获得的MC38-OVA克隆细胞直接接种至实施例5获得的CRBN人源化小鼠模型中。8.1、MC38-OVA克隆细胞性能评估
测试实施例6获得的MC38-OVA克隆细胞对OT-1T细胞的刺激作用。结果如下：
表16
Figure BDA0002987003290000111
Figure BDA0002987003290000121
表中，CD69是T细胞早期激活的marker。
选择了对OT-1T细胞刺激能力最强的MC38-OVA-31细胞进行CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型。
准备MC38-OVA-31克隆细胞(2×106cells/mouse)，收集后用PBS清洗一遍，之后重悬到4℃的PBS中，全程保证无菌操作。之后将细胞悬液注射到野生型小鼠和人源化CRBNI391V小鼠皮下(100μL/mouse)。
等待4-5天，期间每天观察小鼠状态以及皮下肿瘤生长情况。第4-5天，用游标卡尺测量肿瘤大小，以肿瘤水平最长轴为长轴(D)，与之垂直的轴为短轴(d)，肿瘤的体积公式为V＝D×d×d/2。
实施例9在CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型中评估Lenalidomide
本实施例，在实施例8构建的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型中评估Lenalidomide对肿瘤生长的影响。
9.1、给药
实施例8中构建的体内肿瘤模型中，当肿瘤的体积达到60-100mm3时，开始用Lenalidomide处理。Lenalidomide溶解在0.5％CMC-Na中(10mg/mL)，给药方式为灌胃给药(5uL/g)，给药剂量为50mpk，每天一次。肿瘤生长情况如下，如图6。
结果显示，Lenalidomide可以在人源化CRBNI391V小鼠模型中抑制MC38-OVA肿瘤细胞的生长，但是无法在野生型小鼠中发挥抗肿瘤作用。这一点说明Lenalidomide这类药物可以通过人源化CRBN发挥抗肿瘤作用。同时，如果在人源化CRBNI391V小鼠模型中清除了T细胞，Lenalidomide也无法抑制肿瘤生长。由此，可判断出Lenalidomide可以靶向人源化的CRBN，作用于T细胞发挥抗肿瘤效果。
9.2、在T细胞表面共刺激受体CD28缺失的情况下，Lenalidomide对肿瘤生长的影响
将人源化CRBNI391V小鼠和CD28-KO小鼠(from Wang Haopeng,ShanghaitechUniversity)进行杂交，得到CD28-KO CRBNI391V杂交小鼠，利用杂交小鼠模拟了人衰老过程中T细胞表面抗体CD28的缺失以及肿瘤微环境中T细胞CD28的缺失。
杂交小鼠CD28的缺失通过FACS验证过，结果如图7。
在CD28-KO CRBNI391V杂交小鼠体内构建MC38-OVA肿瘤模型，并测试Lenalidomide的药效，测试结果详见图8。
从图8中我们可以看到，CD28的缺失会使得MC38肿瘤细胞生长更快，而Lenalidomide可以通过靶向人源化CRBNI391V发挥抗肿瘤效果。由此证明，Lenalidomide靶向人源化CRBN后在老年人以及肿瘤微环境中CD28缺陷的条件下促进抗肿瘤免疫的潜力。
9.3、Lenalidomide和PD-1抗体联用
实施例8中构建的体内肿瘤模型，当肿瘤体积达到60-100mm3时，开始用Lenalidomide和PD-1抗体联合处理。给药方案为：Lenalidomide，50mpk，每天一次；anti-PD1，5mpk，每两天一次。肿瘤生长曲线见下图9。
从图9中可以看出，CD28的缺失的确会使得anti-PD1失效，而Lenalidomide的处理可以恢复anti-PD1的对肿瘤生长的抑制效果，两种药物联合使用更进一步抑制了肿瘤生长。
实施例10体外细胞测试
本实施例中，利用体外实验体系快速评估IMiDs类药物对T细胞的共刺激作用以及增强T细胞毒性的作用，具体如下：
10.1、T细胞激活实验
(1)分离CD8+T细胞
从人源化CRBNI391V小鼠或野生型小鼠的脾脏细胞中提取CD8+T细胞。
(2)根据Stemcell‘Mouse CD8+T cell isolation kit’(Stemcell,#19853)提供的说明书提取CD8+T细胞。
(3)T细胞激活步骤及结果
A)、准备一块96孔板，加入含有anti-mu CD3e抗体(0.2ug/ml，BD Biosciences,550275)的PBS，50μL/well，4℃过夜，获得了包被anti-CD3e抗体的96孔板。
B)、将根据步骤10.1分离得到CD8+T细胞先用Lenalidomide处理2h，之后加入包被anti-CD3e抗体的96孔板中，CD8+T细胞的浓度为0.2million cells/well。
C)、在二氧化碳培养箱中37℃培养24h后，取T细胞进行CD69(Biolegend，310906)和CD25(Biolegend，104508)染色，之后利用FACS检测CD69和CD25的表达。
从图10中可以看出，Lenalidomide处理后的人源化CRBNI391V小鼠的T细胞高表达CD69，但是野生型的T细胞不会，这说明Lenalidomide可以很好的激活人源化CRBNI391V小鼠中CD8+T细胞，但是无法刺激野生型小鼠的CD8+T细胞。由此，说明构建的模型是准确的系统，可以用来评估IMiDs类药物通过靶向CRBN共刺激T细胞的潜力。
10.2、T细胞毒性试验
(1)将人源化CRBNI391V小鼠和OT-1小鼠杂交，获得CRBNI391V OT-1小鼠
人源化CRBNI391V小鼠和OT-1小鼠的杂交在南方模式动物中心进行。基因型鉴定的引物为：
CRBN F：GCTGGAGCCAACAGCAACATA；
CRBN R:TGGAATTGTGGGTAACAGAGCAG。
TCRa-F：CAG CAG CAG GTG AGA CAAAGT
TCRa-R：GGC TTT ATA ATT AGC TTG GTC C
TCRb-F：AAG GTG GAG AGA GAC AAA GGA TTC
TCRb-R：TTG AGA GCT GTC TCC
(2)分离CD8+T细胞
从CRBNI391V OT-1小鼠或OT-1小鼠的脾脏细胞中提取CD8+T细胞。
(3)T细胞毒性试验步骤及结果
A)将前面获得的MC38-OVA克隆细胞铺到96孔板中(1500cells/well)。
B)将分离获得的CRBNI391V OT-1小鼠的CD8+T细胞后，先用Lenalidomide处理2h。
C)将步骤B)中处理后的CD8+T细胞加入到含有MC38-OVA克隆细胞的96孔板中(6000cells/well，effector：target＝4：1)。
D)培养72h后，用PBS洗去悬浮的T细胞和死细胞。利用CCK8 kit(Yeasen40203ES60)测量剩余的MC38-OVA活性。
从图中11可以看出，Lenalidomide本身对于MC38-OVA细胞没有毒性，也无法作用于野生型的OT-1CD8+T细胞增强其细胞毒性。但可以看到，Lenalidomide可以增强CRBNI391VOT-1T细胞的细胞毒性。由此表明，这个系统可以用来评估IMiDs类药物对CD8+T细胞细胞毒性的增强作用。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Figure BDA0002987003290000151
Figure BDA0002987003290000161
Figure BDA0002987003290000171
序列表
<110> 上海科技大学
<120> 一种CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法和用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 190
<212> DNA
<213> SEQ ID No.1(Artificial Sequence)
<400> 1
atctcacgag aagcctagta caaaggctaa aaataggttt taacttatat ctttccttca 60
ttttataggt atgcatggac cgttgcgcaa tgcaagatat gtgctagcca cattggatgg 120
aaatttacag ccacaaaaaa agacatgtca cctcaaaaat tttggggctt aactcgctct 180
gctctgttac 190
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> SEQ ID No.2(Artificial Sequence)
<400> 4
tcacgagaag cctagtacaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> SEQ ID No.3(Artificial Sequence)
<400> 4
aagatctgtg caagccatat 20
<210> 5
<211> 1161
<212> DNA/RNA
<213> SEQ ID No.4(Artificial Sequence)
<400> 5
atgggctcca tcggcgcagc aagcatggaa ttttgttttg atgtattcaa ggagctcaaa 60
gtccaccatg ccaatgagaa catcttctac tgccccattg ccatcatgtc agctctagcc 120
atggtatacc tgggtgcaaa agacagcacc aggacacaga taaataaggt tgttcgcttt 180
gataaacttc caggattcgg agacagtatt gaagctcagt gtggcacatc tgtaaacgtt 240
cactcttcac ttagagacat cctcaaccaa atcaccaaac caaatgatgt ttattcgttc 300
agccttgcca gtagacttta tgctgaagag agatacccaa tcctgccaga atacttgcag 360
tgtgtgaagg aactgtatag aggaggcttg gaacctatca actttcaaac agctgcagat 420
caagccagag agctcatcaa ttcctgggta gaaagtcaga caaatggaat tatcagaaat 480
gtccttcagc caagctccgt ggattctcaa actgcaatgg ttctggttaa tgccattgtc 540
ttcaaaggac tgtgggagaa aacatttaag gatgaagaca cacaagcaat gcctttcaga 600
gtgactgagc aagaaagcaa acctgtgcag atgatgtacc agattggttt atttagagtg 660
gcatcaatgg cttctgagaa aatgaagatc ctggagcttc catttgccag tgggacaatg 720
agcatgttgg tgctgttgcc tgatgaagtc tcaggccttg agcagcttga gagtataatc 780
aactttgaaa aactgactga atggaccagt tctaatgtta tggaagagag gaagatcaaa 840
gtgtacttac ctcgcatgaa gatggaggaa aaatacaacc tcacatctgt cttaatggct 900
atgggcatta ctgacgtgtt tagctcttca gccaatctgt ctggcatctc ctcagcagag 960
agcctgaaga tatctcaagc tgtccatgca gcacatgcag aaatcaatga agcaggcaga 1020
gaggtggtag ggtcagcaga ggctggagtg gatgctgcaa gcgtctctga agaatttagg 1080
gctgaccatc cattcctctt ctgtatcaag cacatcgcaa ccaacgccgt tctcttcttt 1140
ggcagatgtg tttcccctta a 1161

Claims (10)

1.一种CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将肿瘤细胞引入人源化小鼠中，所述人源化小鼠的CRBN基因包括I391V突变。
2.如权利要求1所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自结肠癌细胞、黑色素瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞和淋巴癌细胞中的一种。
3.如权利要求1所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞来源于小鼠。
4.如权利要求1所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞经皮下注射或尾静脉注射被引入人源化小鼠中。
5.如权利要求1所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为过表达抗原的肿瘤细胞，优选的，所述抗原选自OVA、NY-ESO-1、HER2中的一种或几种。
6.如权利要求5所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述过表达抗原的肿瘤细胞的构建方法包括：在所述肿瘤细胞的基因组中整合用于编码所述抗原的多核苷酸，优选的，通过病毒包装将所述抗原的编码基因包装到慢病毒中，侵染所述肿瘤细胞。
7.如权利要求1所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为人源化肿瘤细胞，所述人源化肿瘤细胞为包括CRBN I391V突变的肿瘤细胞。
8.如权利要求1所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述人源化小鼠的构建方法包括：
1)在小鼠受精卵细胞中引入所述CRBN基因I391V突变；
2)育种和/或筛选以提供所述人源化小鼠。
9.一种由权利要求1～8任一所述构建方法构建的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型。
10.一种筛选免疫调节药物的方法，包括：
将免疫调节药物施用于如权利要求9所述的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型；
优选的，还可以包括：
通过被施用免疫调节药的CRBN基因人源化动物肿瘤细胞模型的变化，筛选免疫调节药的候选药物。
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