CN113046315A - 一种外周血自然杀伤细胞体外诱导获得蜕膜样自然杀伤细胞的方法 - Google Patents

一种外周血自然杀伤细胞体外诱导获得蜕膜样自然杀伤细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种从外周血自然杀伤细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的方法，包括：将外周血自然杀伤细胞在体外进行两个阶段的培养，其中阶段I培养时间为3‑5天，优选4天，阶段II培养时间为3‑5天，优选4天，在培养的第0天使用添加TGF‑β1、hCG和IL‑15的新鲜基础培养基培养启动培养，在阶段I结束后用添加TGF‑β1、hCG和IL‑15的新鲜基础培养基进行半量换液进行阶段II培养，阶段II培养结束后，得到蜕膜样自然杀伤细胞。

Description

一种外周血自然杀伤细胞体外诱导获得蜕膜样自然杀伤细胞 的方法
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，具体而言，涉及将将外周血来源的自然杀伤细胞(Natural killer，NK)体外诱导，获得蜕膜样自然杀伤细胞的方法。
背景技术
正常妊娠是一个复杂的过程：胎儿与母体半基因不合，在妊娠过程中需要不断与母体“对话”，相互适应。作为母体的半同种移植物，胚胎的植入与胎儿的生长发育受到母体免疫系统的精密调控。在人母胎界面存在多种免疫细胞。早孕时期，免疫细胞占蜕膜组织中的30％～40％，其中蜕膜自然杀伤(decidual natural killer,dNK)细胞大量存在，所占比例高达70％。
蜕膜NK细胞与外周血NK(peripheral blood NK,pNK)细胞在表型、功能及调节机制等方面有明显区别。与pNK细胞相比，人dNK细胞以 CD56bright CD16-NK细胞亚群为主，表现出组织驻留特性，如高表达表面分子CD49a，具有较强的分泌功能和低杀伤性等特性。
在正常妊娠过程中dNK细胞在母胎界面发挥着重要的正向调节作用，如促进滋养层细胞侵袭与螺旋动脉重塑，维持母胎界面胚胎免疫耐受，促进胎盘的形成以及胚胎生长发育等。因此，如果NK细胞在母胎界面活性功能异常，会导致病理性妊娠的发生。
目前针对妊娠障碍的治疗主要集中于药物治疗方面，细胞治疗方案仍在摸索阶段。可以预见，使用蜕膜NK细胞进行治疗会获得更好的治疗效果。同时，目前只能在早孕蜕膜组织中获得蜕膜NK细胞，限制了蜕膜 NK细胞的来源和数量，进而限制其临床应用。
发明内容
本申请针对现有技术中存在的问题和不足，提供一种自体外周血来源的NK细胞体外诱导为蜕膜样NK细胞的方法，以解决现有技术中蜕膜NK细胞来源不足、功能受限、难以产业化生产及临床应用的问题，具有广阔的应用前景。
具体而言，本申请提供了如下所示技术方案。
1.一种从外周血自然杀伤细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的方法，包括：
将外周血自然杀伤细胞在体外进行两个阶段的培养，其中阶段I培养时间为3-5天，优选4天，阶段II培养时间为3-5天，优选4天，在培养的第0天使用添加TGF-β1、hCG和IL-15的新鲜基础培养基培养启动培养，在阶段I结束后用添加TGF-β1、hCG和IL-15的新鲜基础培养基进行半量换液进行阶段II培养，
阶段II培养结束后，得到蜕膜样自然杀伤细胞。
2.项目1所述的方法，其中所述基础培养基为添加SPS Serum ProteinSubstitute，例如添加5-10％SPS Serum Protein Substitute的SCGM培养基。
3.项目1或2所述的方法，其中所述添加TGF-β1、hCG和IL-15的新鲜基础培养基中TGF-β1、hCG和IL-15的浓度分别为5-10ng/ml，10-20 IU/ml和10-20ng/ml。
4.项目1-3任一项所述的方法，其中所述阶段I培养在恒温37℃，5％ CO2，常氧，相对饱和湿度95％，细胞培养基pH值7.2-7.4的条件下进行，所述阶段II培养在恒温37℃，5％CO2，1％-2％O2，相对饱和湿度95％，细胞培养基pH值7.2-7.4的条件下进行。
5.项目1所述的方法，其中所述外周血自然杀伤细胞为自体外周血自然杀伤细胞。
6.通过项目1-6任一项的方法得到的蜕膜样自然杀伤细胞。
7.外周血自然杀伤细胞在制备蜕膜样自然杀伤细胞中的用途，优选地，所述外周血自然杀伤细胞为自体外周血自然杀伤细胞。
8.一种用于从外周血自然杀伤细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的试剂盒，其包含细胞因子TGF-β1、hCG和IL-15，以及使用说明书。
本发明使用外周血NK细胞，特别是自体外周血NK细胞经体外诱导获得蜕膜样NK细胞，为药物研发和细胞治疗解决了蜕膜NK细胞的来源问题。培养体系中无饲养细胞且使用无血清培养基，使用的培养试剂成分明确、无动物成分、质量稳定，利于开发后续临床级细胞制剂。使用自体细胞进行诱导，后续用于临床治疗发生免疫排斥反应的可能极低，安全性高，具有广阔的应用前景与价值。
附图说明
图1显示了用流式细胞术检测CD3-CD56+NK细胞分选纯度。左图显示流式细胞术检测结果代表图，圈出CD3-CD56+的NK细胞。右图显示统计结果。结论：CD3-CD56+NK细胞分选纯度达95％以上。
图2为本发明诱导自体蜕膜样NK细胞流程图。
图3显示了自体蜕膜样NK细胞表型鉴定。左图显示流式细胞术检测结果代表图，分别分析pNK、dNK、pNK-idNK表面分子CD49a、CD16、 CD39、CD9、CD103、CD151的表达情况。右图显示统计结果。结论： pNK-idNK表面分子CD49a、CD16、CD39、CD9、CD103、CD151的表达情况与dNK相似，与pNK具有显著差异。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。应当指出的是，具体实施例只是对本发明的详细说明，不应视为对本发明的限制。如无特殊说明，本文中的术语具有本领域中技术人员通常所理解的含义。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：分离外周血单个核细胞
新鲜外周血样本取自于安徽省血液中心的健康献血者。采集自愿献血者的外周血于抗凝管中，按照外周血：氯化钠注射液(安徽丰原药业股份有限公司，国药准字H34021874)＝1:1的比例稀释后分离单个核细胞。用 10ml移液管吸取样品，伸至人外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋公司，货号：LTS1077，以下简称Ficoll)液面上方0.5cm处，样品自然滑落铺至Ficoll液面上，然后轻轻将全部样品加在Ficoll上。600g，20℃离心25分钟。离心完成后，离心管出现明显分层，由下至上分别为：红细胞层，Ficoll 层，单个核细胞层(即白膜层)和血浆层。吸取白膜层，转移至新的离心管中，使用氯化钠注射液稀释，与细胞悬液体积比应大于1:1，混匀。600g， 4℃离心10分钟，弃上清。使用氯化钠注射液重悬细胞，混匀，细胞悬液即为外周血单个核细胞，计数。
实施例2：分选人外周血NK细胞
使用NK细胞分选试剂盒(Miltenyi公司，货号：130-092-657)分选 NK细胞。实施例1中获得的细胞悬液在300g，4℃离心10分钟，弃上清。根据计数结果，使用MACS缓冲液(配制方法见分选试剂盒说明书)重悬细胞沉淀：每1×107个细胞加入40μl MACS缓冲液重悬细胞。接下来，每 1×107个细胞加入10μl NK Cell Biotin-Antibody Cocktail，混匀，4℃冰箱孵育15分钟。接下来，每1×107个细胞，加入30μl MACS缓冲液和20μl NK CellMicroBead Cocktail，混匀，4℃冰箱孵育20分钟。孵育结束，当孵育体系不足1ml时，补充MACS缓冲液至体系为1ml。将LS分离柱(Miltenyi 公司，货号：130-042-401)放入磁铁中，加3ml MACS缓冲液润洗柱子，后将细胞悬液加入分离柱,收集流出液。细胞悬液即将流尽后，将3ml MACS缓冲液分三次加入分离柱。流出液即为目的细胞悬液，使用氯化钠注射液补至总体积为15ml，对细胞计数，取部分细胞使用流式细胞术检测分选纯度(见实施例3)，剩余细胞进行细胞培养。
实施例3：流式细胞术检测pNK细胞分选纯度
流式抗体标记样品的方法如下:收集细胞悬液于1.5ml EP管中，补加 1×PBS至体积为1ml，混匀后，500g，4℃，离心5分钟，弃上清；每管加入100μl的1×PBS重悬细胞，并加入偶联荧光素的流式抗体CD3-BV605 (Biolegend公司，货号：344836)，CD56-BV421(Biolegend公司，货号： 318327)。混匀后，4℃冰箱孵育30分钟；向1.5ml EP管中加入1ml 1×PBS，混匀后，500g，4℃离心5分钟，弃上清，每管加入200μl 1×PBS重悬细胞；细胞悬液经200目尼龙网布转入流式管，使用多激光流式细胞仪(BD 公司)进行检测。使用FlowJo_V10软件对实验结果进行分析。检测结果显示：分选获得的细胞中，CD3-CD56+的NK细胞比例达95％以上，分析及统计结果见图1。
实施例4：自体蜕膜样NK细胞诱导
培养第0天，实施例2中获得的NK细胞悬液在300g，4℃离心10 分钟，弃上清，使用培养基重悬。根据计数结果，调整细胞密度为每1ml 培养基培养1×106个细胞。培养所使用的基础培养基为含5％SPS Serum Protein Substitute(SAGE公司，货号：ART-3010)的SCGM培养基(CellGenix 公司，货号：20802-0500)。培养体系中所含细胞因子种类及终浓度如下： TGF-β1(PeproTech公司，货号：AF-100-21C)的终浓度为5-10ng/ml，hCG (丽珠集团丽珠制药公司，国药准字：H44020673)的终浓度为10-20IU/ml， IL-15(PeproTech公司，货号：AF-200-15)的终浓度为10-20ng/ml。细胞培养分为两个阶段。阶段Ⅰ为细胞培养的第0-3天，TGF-β1、hCG和IL-15 在pNK细胞培养的第0天同时加入基础培养基中，细胞于常规细胞培养箱中进行培养，培养条件为：恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4。阶段Ⅱ为细胞培养的第4-7天，培养的第4天对细胞进行半量换液，加入新鲜培养基的细胞因子终浓度不变，使用低氧工作站对细胞进行培养，培养条件为：O2浓度1％-2％，恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基pH值7.2-7.4。培养流程图见图2。
实施例5：蜕膜组织单个核细胞的分离
新鲜的蜕膜组织样品取自中国科学技术大学附属第一医院自愿终止妊娠的健康供者，并于手术前获得其知情同意。将收集的蜕膜组织放入细胞培养皿中，用1×PBS清洗干净，剔除带有血凝块的标本，弃去液体，使用剪刀将组织剪碎至1mm3大小，加入50ml离心管中，加入10ml浓度为 2mg/ml的胶原酶IV(Sigma公司，货号：C-5138)，在37℃，180rpm的摇床中消化40-50分钟。将消化的组织悬液使用70μm滤网过滤，以去除未消化的组织块，收集细胞悬液到新的50ml离心管中，加1×PBS至50ml。充分颠倒混匀后，4℃，300g，离心10分钟。弃去上清，细胞沉淀使用25ml 1×PBS重悬混匀。细胞悬液缓慢加在Ficoll上，在600g，20℃离心25分钟。离心完成后，离心管出现明显分层，由下至上分别为：红细胞层，Ficoll 层，单个核细胞层(即白膜层)和血浆层。吸取白膜层，转移至新的离心管中，使用1×PBS稀释(PBS与细胞悬液体积比应大于1:1)，混匀。600g， 4℃离心10分钟，弃上清。使用1×PBS重悬细胞，混匀，细胞悬液即为蜕膜单个核细胞。
实施例6：蜕膜样NK细胞的鉴定与比较
分别获取实施例4中培养至第7天的细胞、实施例1中外周血单个核细胞、实施例5中蜕膜组织单个核细胞。使用偶联荧光素的单克隆流式抗体CD45-APCCy7(BD公司，货号：557833)，CD3-BV605(Biolegend公司，货号：344836)，CD56-BV421(Biolegend公司，货号：318327)， CD49a-AlexaFluor647(Biolegend公司，货号：328310)，CD9-PE(BD公司，货号：555372)，CD151-PE(BD公司，货号：556057)，CD39-PECy7 (Biolegend公司，货号：328211)，CD16-PerCP5.5(Biolegend公司，货号：302028)，CD103-FITC(BD公司，货号：550259)对所述细胞分别进行标记，抗体标记方法同实施例3。使用多激光流式细胞仪(BD公司) 进行检测。使用FlowJo_V10软件对实验结果进行分析。检测及鉴定蜕膜样NK细胞表型，分析及统计结果见图3，首先圈出外周血单个核细胞、蜕膜单个核细胞以及诱导体系中CD45+CD3-CD56+的NK细胞，再分别分析其表型特征，可以发现诱导的蜕膜样NK细胞(pNK-idNK)与蜕膜 NK细胞(dNK)具有较高的相似性，与外周血NK细胞(pNK)具有显著差别：pNK-idNK与dNK均高表达组织居留分子CD49a、CD103以及蜕膜NK细胞特征性分子CD151、CD39、CD9，而pNK上几乎不表达这些分子。pNK高水平表达CD16，而dNK几乎不表达CD16，pNK-idNK 与dNK相似，其CD16的表达水平显著低于pNK。CD16通常被认为可以指征NK细胞的杀伤功能，因此pNK具有强大的杀伤功能，而dNK和 pNK-idNK杀伤功能很弱。
从以上结果可以得出，本发明从外周血自然杀伤细胞，特别是自体外周血自然杀伤细胞成功地体外诱导扩增出蜕膜样自然杀伤细胞，从而可以实现在体外大规模制备蜕膜样NK细胞，所述大规模制备蜕膜样NK细胞可以用于临床，例如妊娠障碍的治疗。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种从外周血自然杀伤细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的方法，包括：
将外周血自然杀伤细胞在体外进行两个阶段的培养，其中阶段I培养时间为3-5天，优选4天，阶段II培养时间为3-5天，优选4天，在培养的第0天使用添加TGF-β1、hCG和IL-15的新鲜基础培养基培养启动培养，在阶段I结束后用添加TGF-β1、hCG和IL-15的新鲜基础培养基进行半量换液进行阶段II培养，
阶段II培养结束后，得到蜕膜样自然杀伤细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基为添加SPS Serum ProteinSubstitute，例如添加5-10％SPS Serum Protein Substitute的SCGM培养基。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述添加TGF-β1、hCG和IL-15的新鲜基础培养基中TGF-β1、hCG和IL-15的浓度分别为5-10ng/ml，10-20IU/ml和10-20ng/ml。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述阶段I培养在恒温37℃，5％CO2，常氧，相对饱和湿度95％，细胞培养基pH值7.2-7.4的条件下进行，所述阶段II培养在恒温37℃，5％CO2，1％-2％O2，相对饱和湿度95％，细胞培养基pH值7.2-7.4的条件下进行。
5.权利要求1所述的方法，其中所述外周血自然杀伤细胞为自体外周血自然杀伤细胞。
6.通过权利要求1-6任一项的方法得到的蜕膜样自然杀伤细胞。
7.外周血自然杀伤细胞在制备蜕膜样自然杀伤细胞中的用途，优选地，所述外周血自然杀伤细胞为自体外周血自然杀伤细胞。
8.一种用于从外周血自然杀伤细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的试剂盒，其包含细胞因子TGF-β1、hCG和IL-15，以及使用说明书。
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