CN113045573B - 一种耐碳青霉烯类抗生素病菌的探针化合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测耐碳青霉烯类抗生素病菌的探针化合物，以及快速、实时、单细菌水平的检测和成像方法。本发明的化合物探针基于碳青霉烯酶与其底物的特异性水解反应，生成具有共振拉曼活性的产物，以此构建具有off‑on响应型拉曼探针，实现对耐药菌中碳青霉烯酶表达的实时无损连续监测。该方法信背比高，特异性好，所需样品量少，无需样品前处理，在几分钟之内即可完成检测。

Description

一种耐碳青霉烯类抗生素病菌的探针化合物及应用
技术领域
本发明涉及化合物领域，具体地说，涉及一种耐碳青霉烯类抗生素病菌的探针化合物。
背景技术
自1929年弗莱明发现青霉素以来，抗生素拯救了无数的生命，已成为人类健康的卫士。但由于抗生素的大规模使用甚至滥用，加剧了细菌基因突变，导致出现大量耐药菌种。特别是近年来越来越多的超级细菌(superbug)被发现，对人类生命健康已造成极大危害。目前，耐药性的细菌感染每年造成全球70万人死亡，大多数发生在发展中国家，预计到2050年将达到1000万人。我国颁布了《2016－2020年遏制细菌耐药国家行动计划》，旨在遏制细菌耐药，维护人民群众健康。因此，发展快速的细菌耐药性检测方法对指导抗生素临床准确使用、减少抗生素滥用具有非常重要的价值。β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染治疗中应用最广的抗生素。β-内酰胺酶(β-lactamase)的产生是80％以上病原菌耐药的主要原因。β-内酰胺酶的数量已经超过200种，常参与细菌的多重耐药。当前，碳青霉烯类抗生素是广谱性最高、抗菌活性最强的β-内酰胺类抗生素，能够耐受绝大多数β-内酰胺酶的水解。在治疗严重细菌感染中，碳青霉烯类抗生素已成为最主要的抗菌药物之一，能够有效地抑制或杀灭不同种细菌。因此，碳青霉烯类抗生素已成为严重细菌感染的最后一道防线。由于表达碳青霉烯酶的编码基因位于染色体或质粒上，可在细菌之间水平转移，加速了耐药基因的播散和进化，加之碳青霉烯类抗生素的过度使用，导致耐药菌不断增加。尤其是临床分离的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素耐药率快速增高，给临床治疗和医院感染防控带来巨大的挑战。世界卫生组织已于2017年2月将耐碳青霉烯类抗生素的菌株列入抗生素耐药“重点病原体”清单。另外，部分表达碳青霉烯酶的菌株仅表现为对碳青霉烯类抗生素敏感性减低，最低抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration,MIC)达不到耐药水平，容易引起人们的忽视。早期发现碳青霉烯酶对及时阻断细菌耐药性传播具有十分重要的意义。针对碳青霉烯等β-内酰胺类抗生素耐药菌的检测方法主要有三种：表型法、基因法和酶水解法。表型法通常是检测细菌对β-内酰胺抗生素的敏感性。该方法需要将病原菌从复杂的临床环境中分离纯化出来，再经过细菌培养，根据待测菌的生长状态来判断其药敏性，整个过程耗时数天，且缺乏专一性和灵敏性，无法及时准确地为细菌感染性疾病提供抗生素选择的实验依据；基因法虽然能够快速准确地检测到细菌中是否含有耐药基因，但只能检测耐药机制已经阐明的位点，而无法检测未知机制的耐药基因。另外，该方法不能确定含有耐药基因的菌株是否处于耐药状态，也不能提供MIC值，无法指导临床用药剂量；酶水解法利用耐药病菌产生的β-内酰胺酶能够快速水解β-内酰胺抗生素这一特点，通过比较水解前后β-内酰胺酶的底物颜色即可检测耐药菌。但颜色变化比较缓慢、灵敏度低，且受样品自身颜色的干扰，这些原因极大地限制了其应用。可以看出，表型法、基因法和酶水解法依赖复杂的样品处理，无法对耐药细菌产生的相关活性物质进行原位检测。此外，这些方法只能获取群体细菌耐药性评价的总体行为，而无法反映同一批细菌中不同个体的耐药性差异。因此，在单个细菌层次对细菌耐药性特别是碳青霉烯类耐药进行精准、快速、实时检测有助于指导临床上及时准确地使用抗生素。单细菌成像技术对研究相关活性物质在细菌耐药性发生过程中的作用机制具有重要意义。近年来，荧光成像方法被用于在单细菌水平上监测耐药菌内β-内酰胺酶的变化。荧光的方法通常需要设计特异性荧光探针底物，通过与细菌内的β-内酰胺酶发生特异性水解反应，导致β-酰胺键的断裂，引起荧光信号变化，从而实现细菌内β-内酰胺酶的检测。然而，荧光信号在复杂的生理环境中容易发生自猝灭现象，且在激发光多次照射下极易发生光漂白，难以对细菌内β-内酰胺酶的表达进行连续长时间监测。发展新型单细菌成像方法对耐药性实时动态研究具有重要意义。拉曼光谱是一种无损原位分析分子结构信息的重要手段，被广泛应用于食品安全、医学诊断、文物鉴定、石油化工等领域。与经典的荧光分析方法相比，拉曼光谱没有光漂白现象，其信号产生不受复杂生理环境的影响，无需进行样品前处理，因此非常适于原位、动态、实时分析。鉴于此，我们致力于探索可用于β-内酰胺类(特别是碳青霉烯类)耐药菌检测的拉曼探针。拉曼光谱对于分子结构的变化非常敏感，每种分子都具有特定的光谱“指纹”。我们通过分析β-内酰胺酶与其底物抗生素的水解反应发现，β-酰胺键的断裂会引起抗生素的共轭结构发生显著变化，生成具有激发光共振特性的拉曼活性分子，从而显著增强其拉曼信号，利用增强的拉曼信号可对β-内酰胺酶进行原位无损成像。鉴于此，我们在前期研究中利用拉曼光谱检测了一系列β-内酰胺类抗生素及其水解产物，发现头孢硝噻吩的拉曼信号十分微弱，而其水解产物的拉曼信号则提高了2-3个数量级。受此启发，我们拟设计合成能特异性响应碳青霉烯酶耐药菌的共振拉曼探针。相较于已报道的单细菌成像探针，该共振拉曼探针有如下优点：(1)具有off-on开关特性，从而大大降低了背景信号的干扰；(2)无需样品前处理，可对耐药菌中碳青霉烯酶的表达进行实时、原位、动态、无损连续监测；(3)灵敏度高，所需样品量少(1μL)，在几分钟之内即可完成检测，大大缩短了获取耐药性结果的时间。
专利文献CN106811192A公开了一种耐碳青霉烯类抗生素病菌的荧光探针，然而，该文献公开的方法需要将β-内酰胺类抗生素通过化学修饰上染料分子后，检测其荧光性能才能用于检测，一方面增加了化学合成的难度，从工业上来说也增加了检测成本。
基于上述问题，本发明提供了一种高灵敏性碳青霉烯类抗生素病菌的探针化合物，其具有式(I)结构的化合物：
Figure BDA0002967551910000031
其中，Cy表示5-10元芳基或者5-10元杂芳基；
其中，R1表示氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基；
其中，R2表示氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基；
其中，R3表示氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基；
其中，X表示CR4R5、NR6、O、S；
其中，R4、R5、R6各自独立地表示氢或者C1-C6烷基。
在本发明的优选技术方案中，所述的芳基或杂芳基选自苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基。
在本发明的优选技术方案中，所述的芳基或杂芳基至少被1个吸电子基团所取代。
在本发明的优选技术方案中，所述的芳基上的取代基的个数为1、2、3、4个。
在本发明的优选技术方案中，其中R1和R2各自独立地优选的为氢。
在本发明的优选技术方案中，其中X优选为CR4R5。
在本发明的优选技术方案中，其中R4优选为氢或C1-C6烷基；R5优选为氢或C1-C6烷基，更优选为甲基或乙基。
在本发明的优选技术方案中，其中R3优选为氢或C1-C6烷基，更优选为甲基或乙基。
除此之外，本发明还提供了一种制备式(I)化合物的方法，包括以下步骤：
Figure BDA0002967551910000041
步骤(I)：由化合物5与化合物6在催化剂作用下发生偶联反应制备得到中间体(A)；
步骤(II)：中间体(A)脱保护(TBS-)制备得到中间体(B)；
步骤(III)：中间体(B)进一步脱保护(PNB-)制备得到中间体式I化合物。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的步骤(I)反应是在溶剂下进行的，所述的溶剂为DMF、DMA,二氧六环，乙腈，THF中的一种或其任意组合。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的步骤(I)反应是在碱性条件下进行的，所述的碱为TEA、三乙胺，醋酸钾，碳酸钾、碳酸铯的一种或其任意组合。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的步骤(I)中所使用的催化剂选自过渡金属催化剂。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的过渡金属催化剂为钯、镍、钴、铜、铑、铂催化剂，优选为钯催化剂。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的钯催化剂选自Pd/C、Pd(OAc)2、Pd(Cl)2、Pd(PPh3)的一种或其任意组合。
在本发明的技术方案中，其中，所述的步骤(II)的脱保护是在溶剂中由中间体(A)与二氟氢化铵反应下进行的；
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的步骤(II)的溶剂选自N-甲基吡咯烷酮、DMF、氯仿、二氯化碳、DMSO、四氯化碳、乙醇中的一种或者其任意组合，优选为N-甲基吡咯烷酮、DMF的混合溶液；
在本发明的技术方案中，其中，所述的步骤(III)的脱保护是在溶剂中由中间体(A)与甲酸/三乙胺在催化剂的作用下进行的；
在本发明的优选技术方案中，所述的步骤(III)的溶剂选自甲醇、乙醇、二氯化碳、氯仿、四氯化碳、DMF、DMSO中的一种或者其任意组合，优选为无水二氯化碳；
在本发明的优选技术方案中，所述的步骤(III)的催化剂选自钯催化剂，优选为Pd/C、Pd(OAc)2、Pd(Cl)2、Pd(PPh3)的一种或其任意组合，更优选为Pd/C。
本文使用的术语“烷基”或“亚烷基”意欲包括具有指定碳原子数的支链和直链饱和脂族烃基团。例如，“C1-C6烷基”表示具有1个至6个碳原子的烷基。烷基的实例包括但不限于甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、叔丁基)和戊基(例如正戊基、异戊基、新戊基)。
术语“环烷基”是指单环或二环的环状烷基。单环的环状烷基指C3-C8的环状烷基，包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和降莰烷基。支化环烷基诸如1-甲基环丙基和2-甲基环丙基包括在“环烷基”的定义中。二环的环状烷基包括桥环、螺环或融合环的环烷基。
在本发明的优选技术方案中，其中所述的Cy表示苯基、氮杂环丁基、吖辛因基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、色满基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃基、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、咪唑并吡啶基、假吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、吲嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基(isatinoyl)、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噻唑并吡啶基、异噁唑基、异噁唑并吡啶基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、二氮杂萘基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、噁唑并吡啶基、噁唑烷基、萘嵌间二氮杂苯基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、喋啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑并吡啶基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑基、吡啶并咪唑基、吡啶并噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2-吡咯烷酮基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四唑基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻唑并吡啶基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基、三嗪基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,5-三唑基、1,3,4-三唑基和呫吨基、喹啉基、异喹啉基、酞嗪基、喹唑啉基、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、1,2,3,4-四氢喹啉基、1,2,3,4-四氢异喹啉基、5,6,7,8-四氢-喹啉基、2,3-二氢-苯并呋喃基、色满基、1,2,3,4-四氢-喹喔啉基和1,2,3,4-四氢-喹唑啉基。
在本发明的优选技术方案中，其中所述的芳基选自苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基。
在本发明的优选技术方案中，其中所述的吸电子基团选自-NO2、-CN、-SO3H、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CHO、-COOH、-C(O)R、-N+(R)3，其中，R表示(C1-C3)烷基。
在本发明的优选技术方案中，其中所述的吸电子基团选自-NO2、-CN、-SO3H、-CF3、-CHO、-COOH、-N+(CH3)3。
具体地，本发明提供了以下化合物：
Figure BDA0002967551910000071
Figure BDA0002967551910000081
Figure BDA0002967551910000091
Figure BDA0002967551910000101
Figure BDA0002967551910000111
化合物5与化合物6在催化剂作用下发生偶联反应制备得到式(I)化合物。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的反应是在溶剂下进行的，所述的溶剂为DMF、DMA,二氧六环，乙腈，THF。
在本发明的优选技术方案中，其中所述的反应是在碱性条件下进行的，所述的碱为TEA、三乙胺，醋酸钾，碳酸钾、碳酸铯。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的催化剂选自过渡金属催化剂。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的过渡金属催化剂为钯、镍、钴、铜、铑、铂催化剂，优选为钯催化剂。
在本发明的优选技术方案中，其中，所述的钯催化剂选自Pd/C、Pd(OAc)2、Pd(Cl)2、Pd(PPh3)。
进一步的，本发明还提供了一种本发明的化合物作为探针检测耐碳青霉烯类抗生素病菌中的应用。
在本发明的优选技术方案中，其中所述的检测方法包括定性和定量检测。
在本发明的优选技术方案中，其中所述的定性检测方法包括以下步骤：(1)将本发明的化合物溶解于溶剂中形成溶液，与待测样品在一定条件下形成混合物；(2)肉眼观察化合物溶液混合前后的变化。
在本发明的优选技术方案中，其中所述的定量检测方法包括以下步骤：(1)将本发明的化合物溶解于溶剂中形成溶液，与待测样品在一定条件下形成混合物；(2)通过拉曼光谱测量化合物的光学信号变化，从而确定待测样品中碳青霉烯酶或者含有碳青霉烯耐药菌的含量或浓度。
更进一步的，本发明还提供了一种试剂盒，包括本发明所述的化合物。
本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明以细菌耐药性快速检测这一国家重大需求为研究目标，发展具有off-on开关效应的共振拉曼探针，在单细菌水平实现对β-内酰胺类(特别是其中的碳青霉烯类)抗生素耐药性的特异性检测；
(2)本发明的探针无光漂白现象，检测之前无需进行样品前处理，检测条件不受复杂生理环境影响，检测结果可进行定量分析，因此是一种原位、实时、动态的细菌耐药性定量检测方法。
(3)本发明以碳青霉烯类抗生素的母核为基本骨架，设计、制备一类具有共振拉曼效应的分子探针，对碳青霉烯类耐药菌具有高度的选择性和信背比；
(4)本发明意外的发现，当本发明的分子结构中芳香环连接有吸电子基团时，相比于给电子基团，其具有更好的光谱相应；
(5)在单细菌水平实现碳青霉烯酶的原位、实时、动态、无损、快速检测与成像，为脓毒症治疗的耐药性评估和抗生素选择提供一种快速有效的方法。
附图说明
附图1：本发明实施例1-5化合物探针在有碳青霉烯酶与无碳青霉烯酶IMP-情况下的颜色变化。
附图2:碳青霉烯酶在加入本发明实施例1-5化合物前后，水解拉曼光谱图
具体实施方式
以下结合附图具体介绍本发明的具体实施方式和相关检测效果。但是需要指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
未包括制备途径时，本发明所用原料与试剂均为已知产品，可以按照本领域已知的方法合成，或者可通过购买市售产品获得。使用的市售试剂均不需进一步纯化。室温是指20-30℃。
微波反应使用
Figure BDA0002967551910000131
Initiator+微波反应器。
本发明化合物的结构是通过核磁共振(NMR)和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用(BrukerAscendTM 500型)核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3),氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。以下简写用于NMR信号的多重性：s＝单峰，brs＝宽峰，d＝二重峰，t＝三重峰，m＝多重峰。耦合常数以J值列出，以Hz测量。
LC-MS的测定使用Thermo液质联用仪(UltiMate 3000+MSQ PLUS)。HPLC的测定使用Thermo高压液相色谱仪(UltiMate 3000)。反相制备色谱使用Thermo(UltiMate 3000)反相制备色谱仪。快速柱层析使用艾杰尔(FS-9200T)自动过柱机，硅胶预装柱使用三泰
Figure BDA0002967551910000132
预装柱。薄层层析硅胶板用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
通用反应过程：
Figure BDA0002967551910000141
反应中间体5的制备
Figure BDA0002967551910000142
在氩气保护下，将化合物1(1.95g，5mmol)溶解在干燥的DMF(50mL)中并继续添加TBDMSCl(3g，20mmol)和咪唑(1.63g，30mmol)，室温搅拌反应5h。TLC检测反应完全，加200mL乙酸乙酯稀释，再依次用100mL纯净水和100mL饱和食盐水洗涤后，无水硫酸镁干燥。浓缩有机相，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)纯化，得到白色固体化合物2(2.39g，产率95％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.16(d,J＝8Hz,2H),7.48(d,J＝8Hz,2H),6.28(s,1H),5.30(s,2H),4.10-4.07(m,1H),3.82(d,J＝12Hz,2H),2.87(d,J＝8Hz,2H),1.11(d,J＝4Hz,6H),0.77(s,9H),0.03(d,J＝4Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ193.94,167.92,160.86,147.69,143.73,129.09,124.08,76.30,65.72,65.21,61.70,51.41,45.05,26.12,22.32,18.12,13.97.HRMS(ESI)m/z calcd for C23H32N4O7Si[M+H]+505.2074,found 505.2155.
Figure BDA0002967551910000143
第一阶段：向氩气保护的三口瓶中依次加入微波干燥的ZnCl2(68.5mg，0.5mmol)、化合物2(5.07g，10mmol)和Rh2(Oac)4(44.8mg，0.1mmol)，加入干燥的CH2Cl2(30mL)，加热回流120min以上。反应过程中可通过TLC监测化合物3的产率，直到化合物2完全生成化合物3为止。
第二阶段：将三口烧瓶冷却至-50℃，缓慢滴加2,2,6,6-四甲基哌啶(2.53mL，15mmol)和二异丙基乙胺(1.1mL，7.65mmol)的混合物30min以上，Tf2O(2.15mL，13mmol)60min以上。反应体系在-50℃下继续反应2h后终止反应。混合物无需萃取，直接旋干，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝6：1)层析纯化后，得到白色化合物4(2.39g，产率80％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.20(d,J＝8Hz,2H),7.61(d,J＝8Hz,2H),6.71(s,1H),5.35(s,2H),3.71(d,J＝4Hz,1H),3.28-3.26(m,2H),1.11(d,J＝8Hz,3H),0.86-0.84(m,12H),0.02(d,J＝8Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ174.67,162.01,148.95,145.79,131.24,130.18,129.90,129.38,124.67,123.37,124.49,120.98,118.19,69.10,65.24,51.14,26.68,26.37,26.23,21.68,19.02,11.12.HRMS(ESI)m/z calcd forC24H31F3N4O9SSi[M+H]+609.1505,found 609.1537.
Figure BDA0002967551910000151
在氩气保护下，向三口烧瓶中依次加入微波干燥的ZnCl2(1.54g，10mmol)、NMP(10mL)和化合物4(3.4g，5.6mmol)，反复冻抽3次，排干空气和水。继续保持氩气环境，向反应中加入三(2-呋喃基)膦(200mg)和Pd2(dba)3(200mg)，再次冻抽后进行室温搅拌。30min后，通过注射器向混合物中缓慢滴加三丁基乙烯基锡(2mL，7mmol)，将反应升温至30℃搅拌10h。终止反应，反应中加入乙酸乙酯(100mL)进行稀释，再依次使用纯净水(100mL)和饱和食盐水(100mL)洗涤后，无水硫酸镁干燥。旋转蒸干有机相，残余物通过硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝8：1)层析纯化，得到淡青色蜡状化合物5固体(2.59g，产率95％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.18(d,J＝8Hz,2H),7.70(d,J＝8Hz,2H),7.23-7.16(m,1H),5.60(d,J＝12Hz,1H),5.46(d,J＝12Hz,1H),5.35(d,1H),5.30(d,J＝4Hz,1H),4.21-4.15(m,2H),3.49(m,1H),3.35(s,1H),1.14-1.09(m,6H),0.77(s,12H),0.02(d,J＝4Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ172.99,160.46,148.38,143.38,128.44,127.85,125.33,123.13,121.27,116.94,65.06,64.71,58.59,55.10,38.44,29.03,27.52,26.17,24.60,21.10,18.10,17.25,15.96,12.61.HRMS(ESI)m/z calcd for C25H34N2O6Si[M+H]+487.2220,found 487.2269.
实施例1CRP-1化合物的制备
Figure BDA0002967551910000161
在氩气保护下，向茄型反应瓶中依次加入Pd(OAc)2(223.33mg，1mmol)和P(o-Tol)3(274mg，0.9mmol)、反复冻融3次后室温搅拌1小时，使催化剂活化。再依次加入化合物5(2.43g，5mmol)、化合物9(4.07g，20mmol)、20mL DMF和25μL三乙胺，进行3次冷冻脱气操作，最后将反应升温至80℃反应7h。终止反应，加入50mL乙酸乙酯稀释，依次用100mL 0.2molHCl溶液、100mL NaHCO3饱和水溶液和100mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。浓缩有机相，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝8：1)纯化，得到淡黄色固体化合物10(2.39g，85％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.25(d,J＝8Hz,2H),7.9(d,J＝16Hz,1H),7.72(d,J＝12Hz,2H),7.5(d,J＝8Hz,2H),7.38-7.33(m,J＝20Hz,2H),6.88(d,J＝8Hz,1H),5.5(d,J＝16Hz,1H),5.31(d,J＝8Hz,1H),4.32-4.26(m,J＝24Hz,2H),4.12(d,J＝16Hz,1H),3.74(d,J＝20Hz,1H),3.56(d,J＝24Hz,1H),8.13(d,J＝8Hz,2H),1.32-1.26(m,J＝24Hz,6H),0.9(s,9H),0.12(s,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ172.85,161.2,147.57,145.58,142.77,138.18,136.51,133.81,129.77,128.47,128.41,127.5,123.9,75.7,65.69,59.44,57.16,50.63,25.78,22.05,18.6,15.8,4.22.HRMS(ESI)m/z calcd forC31H38N2O6Si+[M+H]+563.2499,found 563.2517.
Figure BDA0002967551910000171
在氩气保护下，将化合物10(562.25mg，1mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮/DMF(1：3，15mL)的混合溶液中，再加入二氟化氢铵(56.79mg，1mmol)，室温下搅拌36h。终止反应，加30mL乙酸乙酯稀释，依次用50mL NaHCO3饱和水溶液和50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝40：1)纯化，得到淡黄色固体化合物11(358.53mg，80％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.26(d,J＝8Hz,2H),7.73(d,J＝8Hz,2H),7.51(d,J＝8Hz,2H),7.35-7.29(m,J＝24Hz,3H),6.4(d,J＝16Hz,1H),6.21(d,J＝12Hz,1H),5.88(d,J＝8Hz,1H),5.68(d,J＝16Hz,1H),8.26(d,J＝8Hz,2H),4.94(d,J＝8Hz,2H),4.04(s,1H),3.77(d,J＝20Hz,1H),3.51(d,J＝40Hz,1H),2.83(s,1H),1.32(d,J＝8Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ1.73.24,161.3,147.57,145.58,142.77,138.18,136.51,133.31,129.77,128.47,128.41,123.9,66.46,65.69,60.84,57.44,50.63.HRMS(ESI)m/z calcd for C25H24N2O6+[M+H]+449.1634,found 449.1644.
Figure BDA0002967551910000172
在氩气保护下，将化合物11(224.08mg，0.5mmol)和Pt/C(20mg)溶解到无水二氯甲烷(8mL)溶液中，再使用微量加样器将甲酸(15μL)和TEA(8μL)滴加至反应中。室温搅拌6h后终止反应，向反应物中加入20mL乙酸乙酯稀释，依次用30mL饱和NaHCO3溶液和30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋转蒸干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1)纯化，得到淡黄色的固体化合物CRP-1(109.6mg，70％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.88(d,J＝8Hz,2H),7.52(d,J＝20Hz,1H),7.35(d,J＝8Hz,1H),7.14(d,J＝8Hz,1H),6.69(d,J＝32Hz,2H),7.88(d,J＝8Hz,2H),6.5(d,J＝8Hz,2H),5.02(s,1H),7.88(d,J＝8Hz,2H),4.24(d,J＝12Hz,1H),4.04(d,J＝8Hz,1H),3.8(d,J＝8Hz,1H),2.05(d,J＝8Hz,1H),1.33(m,J＝16Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.24,161.88,140.12,137.9,136.51,133.81,129.77,128.99,128.47,127.5,66.46,60.84,57.44,50.63,22.39,15.8.HRMS(ESI)m/z calcd for C18H19NO4+[M+H]+314.1314,found 314.5495.
实施例2CRP-2的制备
Figure BDA0002967551910000181
在氩气保护下，向茄型反应瓶中依次加入Pd(OAc)2(223.33mg，1mmol)和P(o-Tol)3(274mg，0.9mmol)、反复冻融3次后室温搅拌1小时，使催化剂活化。再依次加入化合物5(2.43g，5mmol)、化合物18(4.38g，20mmol)、20mL DMF和25μL三乙胺，进行3次冷冻脱气操作，最后将反应升温至80℃反应8h。终止反应，加入50mL乙酸乙酯稀释，依次用100mL0.2mol HCl溶液、100mL NaHCO3饱和水溶液和100mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。浓缩有机相，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝8：1)纯化，得到淡黄色固体化合物19(2.31g，80％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.25(d,J＝8Hz,2H),7.71(d,J＝8Hz,2H),7.31(d,J＝8Hz,2H),6.8(d,J＝8Hz,1H),6.64(d,J＝8Hz,2H),5.49(d,J＝8Hz,1H),5.31(d,J＝8Hz,1H),4.29(d,J＝8Hz,1H),4.22(d,J＝8Hz,1H),3.93(d,J＝8Hz,2H),3.52(d,J＝8Hz,1H),3.25(d,J＝8Hz,2H),2.52(d,J＝8Hz,1H),1.3(d,J＝16Hz,6H),0.95(d,J＝16Hz,9H),0.16(d,J＝16Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ172.75,161.3,150.38,147.57,144.56,142.77,138.18,137.48,133.87,130.75,128.41,127.5,126.93,123.9,116.63,75.7,65.69,59.44,57.16,50.63,35.78,22.05,18.6,15.8,4.22.HRMS(ESI)m/zcalcd for C31H39N3O6Si+[M+H]+578.2608,found 578.2619.
Figure BDA0002967551910000182
在氩气保护下，将化合物19(577.26mg，1mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮/DMF(1：3，15mL)的混合溶液中，再加入二氟化氢铵(56.79mg，1mmol)，室温下搅拌36h。终止反应，加30mL乙酸乙酯稀释，依次用50mL NaHCO3饱和水溶液和50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝40：1)纯化，得到淡黄色固体化合物20(347.38mg，75％)。化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(d,J＝8Hz,2H),7.73(d,J＝8Hz,2H),7.5(d,J＝8Hz,3H),7.12(d,J＝8Hz,2H),6.31(d,J＝8Hz,1H),5.32(d,J＝16Hz,1H),5.03(d,J＝24Hz,2H),4.84(d,J＝24Hz,2H),4.64(d,J＝8Hz,2H),4.24(d,J＝24Hz,1H),2.95(S,1H),2.66(d,J＝8Hz,1H),1.14(s,3H),0.98(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.25,161.32,150.24,147.58,145.54,142.77,138.18,133.81,130.75,128.41,127.5,126.93,123.34,116.63,66.28,65.39,60.84,50.63,22.39,15.47.HRMS(ESI)m/zcalcd for C25H25N3O6+[M+H]+464.1743,found 464.1766.
Figure BDA0002967551910000191
在氩气保护下，将化合物20(231.59mg，0.5mmol)和Pt/C(20mg)溶解到无水二氯甲烷(8mL)溶液中，再使用微量加样器将甲酸(15μL)和TEA(8μL)滴加至反应中。室温搅拌6h后终止反应，向反应物中加入20mL乙酸乙酯稀释，依次用30mL饱和NaHCO3溶液和30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋转蒸干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1)纯化，得到淡黄色的固体化合物CRP-2(106.65mg，65％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(d,J＝8Hz,2H),7.61(d,J＝8Hz,2H),7.15-7.09(m,J＝24Hz,3H),6.71(d,J＝8Hz,1H),5.39(d,J＝16Hz,1H),5.03-4.95(m,J＝32Hz,2H),4.7(d,J＝8Hz,1H),4.7(d,J＝16Hz,1H),4.57(d,J＝8Hz,2H),2.91(d,J＝8Hz,2H),1.3(s,3H),0.83(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.24,161.88,150.38,140.13,137.9,133.81,130.75,127.5,126.93,116.63,66.46,60.84,57.44,50.63,22.39,15.8.HRMS(ESI)m/z calcd for C18H20N2O4+[M+H]+329.1423,found329.1462.
实施例3CRP-3的制备
Figure BDA0002967551910000201
在氩气保护下，向茄型反应瓶中依次加入Pd(OAc)2(223.33mg，1mmol)和P(o-Tol)3(274mg，0.9mmol)、反复冻融3次后室温搅拌1小时，使催化剂活化。再依次加入化合物5(2.43g，5mmol)、化合物6(4.3g，20mmol)、20mL DMF和25μL三乙胺，进行3次冷冻脱气操作，最后将反应升温至90℃反应16h。终止反应，加入50mL乙酸乙酯稀释，依次用100mL 0.2molHCl溶液、100mL NaHCO3饱和水溶液和100mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。浓缩有机相，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝8：1)纯化，得到棕黄色固体化合物7(2.02g，65％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.13(d,J＝8Hz,2H),7.83(d,J＝20Hz,4H),7.59(d,J＝8Hz,2H),6.23(d,J＝16Hz,1H),6.11(d,J＝8Hz,1H),5.49(d,J＝16Hz,1H),4.84(d,J＝8Hz,2H),3.98(d,J＝4Hz,1H),3.78(d,J＝4Hz,9H),3.48-3.41(m,J＝28Hz,2H),1.19-1.13(m,J＝24Hz,6H),0.77(s,9H),0.01(d,J＝4Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ172.85,161.30,150.23,147.57,145.58,142.77,138.18,133.81,129.15,128.41,127.5,123.9,119.91,75.7,65.69,59.44,57.16,55.78,50.63,25.78,22.05,18.6,15.8,4.22.
HRMS(ESI)m/z calcd for C34H46N3O6Si+[M+H]+621.3184,found 621.3459.
Figure BDA0002967551910000202
在氩气保护下，将化合物7(621.35mg，1mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮/DMF(1：3，15mL)的混合溶液中，再加入二氟化氢铵(56.79mg，1mmol)，室温下搅拌36h。终止反应，加30mL乙酸乙酯稀释，依次用50mL NaHCO3饱和水溶液和50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝40：1)纯化，得到棕黄色固体化合物8(380.42mg，75％)。化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.72(s,1H),8.24(d,J＝16Hz,2H),7.79(s,2H),7.55(d,J＝8Hz,2H),6.33(d,J＝8Hz,1H),6.21(d,J＝20Hz,2H),5.68(d,J＝16Hz,1H),5.56(d,J＝32Hz,2H),8.13(d,J＝8Hz,2H),3.95(s,9H),3.05(d,J＝12Hz,2H),8.13(d,J＝8Hz,2H),2.8-2.68(m,J＝48Hz,2H),1.27(d,J＝8Hz,3H),1.22(d,J＝8Hz,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.24,161.3,150.23,148.57,145.58,142.77,138.18,133.81,129.72,129.15,128.41,127.5,123.9,119.91,66.46,65.69,60.84,57.44,55.78,50.63,22.39,15.8.HRMS(ESI)m/z calcd for C28H32N3O6+[M+H]+507.2319,found 507.2305.
Figure BDA0002967551910000211
在氩气保护下，将化合物8(253.62mg，0.5mmol)和Pt/C(20mg)溶解到无水二氯甲烷(8mL)溶液中，再使用微量加样器将甲酸(15μL)和TEA(8μL)滴加至反应中。室温搅拌6h后终止反应，向反应物中加入20mL乙酸乙酯稀释，依次用30mL饱和NaHCO3溶液和30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋转蒸干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1)纯化，得到淡黄色的固体化合物CRP-3(73.78mg，40％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.72-7.65(m,J＝28Hz,1H),8.13(d,J＝8Hz,2H),7.49(d,J＝4Hz,2H),7.29(d,J＝4Hz,2H),8.13(d,J＝8Hz,2H),6.46(d,J＝20Hz,1H),5.37(d,J＝12Hz,1H),8.13(d,J＝8Hz,2H),4.81-4.74(m,J＝28Hz,2H),3.93(d,J＝12Hz,1H),3.79(d,J＝8Hz,9H),3.12(d,J＝20Hz,1H),2.65(d,J＝8Hz,1H),1.14-1.1(d,J＝12Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.24,161.88,150.23,140.13,137.9,133.81,129.72,129.15,127.5,119.91,66.46,60.84,57.44,55.78,50.63,22.39,15.8.HRMS(ESI)m/z calcd for C21H27N2O4+[M+H]+371.1965,found 371.3168.
实施例4CRP-4的制备
Figure BDA0002967551910000212
在氩气保护下，向茄型反应瓶中依次加入Pd(OAc)2(223.33mg，1mmol)和P(o-Tol)3(274mg，0.9mmol)、反复冻融3次后室温搅拌1小时，使催化剂活化。再依次加入化合物5(2.43g，5mmol)、化合物12(4.56g，20mmol)、20mL DMF和25μL三乙胺，进行3次冷冻脱气操作，最后将反应升温至80℃反应8h。终止反应，加入50mL乙酸乙酯稀释，依次用100mL0.2mol HCl溶液、100mL NaHCO3饱和水溶液和100mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。浓缩有机相，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝8：1)纯化，得到淡黄色固体化合物13(2.34g，80％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.13(d,J＝8Hz,2H),7.8(d,J＝8Hz,1H),7.6(d,J＝8Hz,2H),7.38(d,J＝8Hz,2H),7.26-7.18(m,J＝32Hz,3H),6.76(d,J＝16Hz,2H),5.38(d,J＝8Hz,1H),5.21(d,J＝8Hz,1H),4.21-4.13(d,J＝32Hz,2H),3.43(d,J＝16Hz,1H),3.17(d,J＝8Hz,1H),7.88(d,J＝8Hz,2H),1.2(d,J＝8Hz,6H),0.78(s,9H),0.12(d,J＝8Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ172.85,161.3,147.57,145.58,142.77,138.18,133.81,132.49,128.41,128.22,127.5,123.9,121.08,80.33,78.78,75.7,65.69,59.44,57.16,50.63,25.78,22.05,18.6,15.8,4.22.HRMS(ESI)m/z calcd forC33H38N2O6Si+[M+H]+587.2499,found 587.2456.
Figure BDA0002967551910000221
在氩气保护下，将化合物13(586.25mg，1mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮/DMF(1：3，15mL)的混合溶液中，再加入二氟化氢铵(56.79mg，1mmol)，室温下搅拌36h。终止反应，加30mL乙酸乙酯稀释，依次用50mL NaHCO3饱和水溶液和50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝40：1)纯化，得到淡黄色固体化合物14(330.51mg，70％)。化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.24(d,J＝8Hz,2H),7.8(d,J＝8Hz,2H),7.72(d,J＝8Hz,2H),7.29(s,1H),6.84(d,J＝16Hz,1H),5.5(d,J＝16Hz,2H),5.33(d,J＝12Hz,2H),4.84(s,2H),4.31(d,J＝12Hz,2H),3.55(d,J＝12Hz,2H),3.31(d,J＝8Hz,2H),1.29(d,J＝24Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.24,161.3,147.57,145.58,142.77,138.18,132.89,132.49,128.41,128.22,127.5,123.9,121.08,80.33,78.78,66.46,65.69,60.84,57.44,50.63,22.39,15.8.HRMS(ESI)m/z calcd for C27H24N2O6+[M+H]+473.1634,found 473.1589.
Figure BDA0002967551910000231
在氩气保护下，将化合物14(224.08mg，0.5mmol)和Pt/C(20mg)溶解到无水二氯甲烷(8mL)溶液中，再使用微量加样器将甲酸(15μL)和TEA(8μL)滴加至反应中。室温搅拌6h后终止反应，向反应物中加入20mL乙酸乙酯稀释，依次用30mL饱和NaHCO3溶液和30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋转蒸干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1)纯化，得到淡黄色的固体化合物CRP-4(101.14mg，60％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.97(d,J＝8Hz,1H),7.52(d,J＝16Hz,2H),7.38(d,J＝16Hz,2H),6.96(d,J＝16Hz,2H),6.61(s,1H),8.24(d,J＝8Hz,2H),5.06-4.99(m,J＝28Hz,1H),4.47(d,J＝8Hz,1H),4.31(d,J＝8Hz,1H),1.13(d,J＝12Hz,3H),0.77(s,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.24,161.88,140.13,137.9,133.81,132.89,132.49,128.22,127.5,121.08,80.33,78.78,66.64,60.84,57.44,50.63,22.39,15.8.HRMS(ESI)m/z calcd for C20H19NO4+[M+H]+338.1314,found 338.1572.
实施例5CRP-5的制备
Figure BDA0002967551910000232
在氩气保护下，向茄型反应瓶中依次加入Pd(OAc)2(223.33mg，1mmol)和P(o-Tol)3(274mg，0.9mmol)、反复冻融3次后室温搅拌1小时，使催化剂活化。再依次加入化合物5(2.43g，5mmol)、化合物15(4.58g，20mmol)、20mL DMF和25μL三乙胺，进行3次冷冻脱气操作，最后将反应升温至80℃反应8h。终止反应，加入50mL乙酸乙酯稀释，依次用100mL0.2mol HCl溶液、100mL NaHCO3饱和水溶液和100mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。浓缩有机相，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝8：1)纯化，得到淡黄色固体化合物16(2.5g，85％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.14(d,J＝8Hz,2H),7.9(d,J＝12Hz,1H),7.69(d,J＝8Hz,1H),7.61(d,J＝8Hz,2H),7.53(d,J＝8Hz,2H),7.48(d,J＝8Hz,2H),6.73(d,J＝8Hz,1H),5.39(d,J＝8Hz,1H),5.22(d,J＝8Hz,1H),4.2(d,J＝12Hz,1H),3.44(d,J＝8Hz,1H),3.21(d,J＝12Hz,1H),1.22-1.16(m,J＝24Hz,6H),0.78(d,J＝8Hz,9H),0.01(d,J＝8Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ172.85,161.3,147.57,145.58,142.77,138.18,134.37,133.81,132.53,128.41,127.5,127.45,123.9,118.49,110.87,75.7,65.69,59.44,57.16,50.63,25.13,22.65,18.6,15.8,4.22.HRMS(ESI)m/z calcd forC32H37N3O6Si+[M+H]+588.2452,found 588.2461.
Figure BDA0002967551910000241
在氩气保护下，将化合物16(587.25mg，1mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮/DMF(1：3，15mL)的混合溶液中，再加入二氟化氢铵(56.79mg，1mmol)，室温下搅拌36h。终止反应，加30mL乙酸乙酯稀释，依次用50mL NaHCO3饱和水溶液和50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝40：1)纯化，得到淡黄色固体化合物17(331.21mg，70％)。化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.24(d,J＝8Hz,2H),7.72(d,J＝8Hz,2H),7.45(d,J＝8Hz,1H),7.32(d,J＝8Hz,2H),8.84-6.74(m,J＝40Hz,1H),6.64(d,J＝8Hz,3H),5.49(d,J＝8Hz,1H),5.38(d,J＝8Hz,1H),4.68-4.62(m,J＝24Hz,1H),4.32-4.22(m,J＝40Hz,1H),3.55-3.48(d,J＝28Hz,1H),3.27(d,J＝8Hz,1H),1.33-1.29(m,J＝16Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ145.32,142.17,138.18,134.37,133.81,132.51,128.41,127.45,123.9,118.49,110.87,66.46,65.69,60.48,57.44,50.63,22.39,15.8.HRMS(ESI)m/z calcd for C26H23N3O6+[M+H]+474.1587,found 474.1562.
Figure BDA0002967551910000251
在氩气保护下，将化合物17(224.08mg，0.5mmol)和Pt/C(20mg)溶解到无水二氯甲烷(8mL)溶液中，再使用微量加样器将甲酸(15μL)和TEA(8μL)滴加至反应中。室温搅拌6h后终止反应，向反应物中加入20mL乙酸乙酯稀释，依次用30mL饱和NaHCO3溶液和30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥。旋转蒸干有机相，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1)纯化，得到淡黄色的固体化合物CRP-5(101.44mg，60％)。
化合物的表征数据：1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.29(d,J＝8Hz,2H),7.12(d,J＝16Hz,2H),6.78(d,J＝12Hz,2H),6.09-6.02(m,J＝28Hz,1H),5.02(d,J＝12Hz,1H),4.32(d,J＝8Hz,1H),4.21(d,J＝8Hz,1H),3.59(d,J＝16Hz,1H),2.75(d,J＝16Hz,1H),1.32(s,3H),0.96(d,J＝16Hz,3H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.24,161.88,140.13,137.9,134.37,133.81,132.53,127.5,127.45,118.49,110.87,66.46,60.84,57.44,50.63,22.39,18.5.HRMS(ESI)m/z calcd for C19H18N2O4+[M+H]+339.1267,found 339.1252.
测试实施例
本发明实施例1-5所制备的(CRP-1至CRP-5)化合物在检测碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐药菌中的应用，包括以下步骤：(1)将本发明的耐碳青霉烯类抗生素病菌的探针与待测样品在一定条件下混合，形成具有光学性质或颜色变化的化合物(参见图1)。
称取3.13mg化合物CRP-1，3.28mg化合物CRP-2，3.71mg化合物CRP-3，3.37mg化合物CRP-4和3.38mg化合物CRP-5分别溶解在100μL的二甲基亚砜溶液中配置成0.1mol/L的探针储备液(棕色瓶4℃储存)。使用pH为7.5的磷酸盐缓冲液稀释探针储备液，配置成0.1mmol/L的试验浓度。
首先取将1ml临床样本(痰液、肺泡灌洗液、胸水、胸腔积液、尿液和血清)进行低温超声破壁，8000转/min离心5分钟，取200μL上清液加入到800μL 0.1mmol/L的探针溶液中，37℃孵育10min，进行拉曼光谱检测。
拉曼光谱测试方法
本发明使用的拉曼仪为雷尼绍拉曼光谱仪，使用直径0.3mm的毛细管吸取待测样本在50×目镜下进行拉曼检测，激光波长为633nm,激光功率为20mW,曝光时间为1s。

Claims (13)

1.具有式(I)结构的化合物：
Figure FDA0003503397730000011
其中，Cy表示苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、咪唑基；
其中，R1表示氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基；
其中，R2表示氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基；
其中，R3表示氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、C3-C6环烷基；
其中，X表示CR4R5、NR6、O、S；
其中，R4、R5、R6各自独立地表示氢或者C1-C6烷基；
其中，所述的Cy至少被1个吸电子基团所取代；所述的吸电子基团选自-NO2、-CN、-SO3H、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CHO、-COOH、-C(O)R、-N+(R)3，其中，R表示(C1-C3)烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，R为甲基或乙基。
3.如权利要求2所述的化合物，其中，所述的吸电子基团选自-NO2、-CN、-SO3H、-CF3、-CHO、-COOH、-N+(CH3)3。
4.如权利要求1-3任一项所述的化合物，其中R1和R2各自独立地优选的为氢。
5.如权利要求1-3任一项所述的化合物，其中X为CR4R5。
6.如权利要求5所述的化合物，其中R4为氢或C1-C6烷基；R5为氢或C1-C6烷基。
7.如权利要求6所述的化合物，其中R4和R5为甲基或乙基。
8.如权利要求1-3任一项所述的化合物，其中R3为氢或甲基或乙基。
9.如权利要求1-8任一项所述的化合物作为拉曼光谱探针检测耐碳青霉烯类抗生素病菌中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述的检测方法包括定性和定量检测。
11.如权利要求10所述的应用，其中所述的定性检测方法包括以下步骤：(1)将权利要求1-8任一项所述的化合物溶解于溶剂中形成溶液，与待测样品在一定条件下形成混合物；(2)肉眼观察化合物溶液混合前后的变化。
12.如权利要求10所述的应用，其中所述的定量检测方法包括以下步骤：(1)将权利要求1-8任一项所述的化合物溶解于溶剂中形成溶液，与待测样品在一定条件下形成混合物；(2)通过拉曼光谱测量化合物的光学信号变化，从而确定待测样品中碳青霉烯酶或者含有碳青霉烯耐药菌的含量或浓度。
13.试剂盒，包括权利要求1-8任意一项所述的化合物。
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