CN113041349A - Kiaa1199基因在防治肿瘤疾病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开靶向抑制KIAA1199基因在防治肿瘤疾病中的用途。KIAA1199基因在制备防治肿瘤疾病药物中作为治疗靶标的应用；试剂在制备防治肿瘤疾病药物中的应用，试剂为KIAA1199基因表达的抑制剂；抑制剂为KIAA1199基因的siRNA，或抑制剂为吡非尼酮；如下任一项应用：a.吡非尼酮在制备防治肿瘤疾病药物中的应用，b.KIAA1199基因的siRNA在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。本发明通过抑制KIAA1199基因表达实现肿瘤治疗，KIAA1199为打破转移靶器官如肝脏免疫抑制微环境、遏制结肠癌肝转移的靶标；开拓了吡非尼酮、KIAA1199基因的siRNA治在疗肿瘤中新用途。

Description

KIAA1199基因在防治肿瘤疾病中的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及靶向干预KIAA1199基因在防治肿瘤疾病中的用途。
背景技术
肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌途径影响靶器官内固有/适应性免疫细胞组成及功能，进而营造适宜肿瘤细胞远处定植和免疫逃逸的“土壤”，并最终决定肿瘤细胞的走向与最终命运。寻找构筑远端靶器官微环境的驱动因素，靶向破坏转移微环境的免疫抑制特征，重新激活微环境中抗肿瘤免疫应答有望为结肠癌肝转移的预防和靶向治疗提供有价值的实验基础和理论依据。与肿瘤传统治疗法相比，靶向驱动基因破坏转移微环境有着明显优势：既能降低肿瘤的侵袭转移能力；又能破除这类肿瘤细胞营造的转移“土壤”，实现遏制肿瘤转移的同时激活机体的抗肿瘤免疫应答。
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，侵袭转移是其预后不良的主要原因。肝脏是结直肠癌最常见的远处侵犯器官，在整个病程中，超过50％会发生肝转移，成为结直肠癌患者最主要的死亡原因，严重制约患者的生存和预后。既往研究主要集中在结直肠癌细胞本身的侵袭转移能力，忽视了靶器官微环境的重要支持作用，难以实现临床转化。
KIAA1199基因位于15号染色体长臂q25.1位点，其表达的蛋白产物又称CEMIP，最初报道与非综合性听力丧失有关。
发明内容
针对上述问题，本发明提供KIAA1199基因在防治肿瘤疾病中的用途，主要解决现有技术并未涉及通过调节KIAA1199基因实现肿瘤治疗，并未涉及通过调节KIAA1199基因打破转移靶器官的免疫抑制微环境，并未涉及吡非尼酮、KIAA1199基因的siRNA治疗肿瘤新用途等问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
靶向干预KIAA1199基因在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。
一种方式，所述应用为KIAA1199基因在制备防治肿瘤疾病药物中作为治疗靶标的应用。
试剂在制备防治肿瘤疾病药物中的应用，所述试剂包括KIAA1199基因表达的抑制剂。
一种方式，所述抑制剂为KIAA1199基因的siRNA；或
所述抑制剂为吡非尼酮。
一种方式，所述试剂为PD-1抗体-KIAA1199基因表达抑制剂的联合物。
一种方式，所述联合物为防治癌细胞转移有效组分，优选为防治结肠癌肝转移有效组分。
一种方式，所述肿瘤疾病为结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌，所述肿瘤疾病优选为肠癌肝转移。
防治肿瘤疾病的产品，包含所述的试剂。
如下任一项应用：
a.吡非尼酮在制备防治肿瘤疾病药物中的应用；
b.KIAA1199基因的siRNA在制备防治肿瘤疾病药物中的应用；
c.KIAA1199基因在预测或检测结直肠癌免疫治疗效果模型中作为分子标志物的应用。
一种方式，a中所述吡非尼酮为KIAA1199基因表达的抑制剂；
b中所述KIAA1199基因的siRNA为KIAA1199基因表达的抑制剂；
c中治疗效果为PD-1治疗结直肠癌疗效。
预测结直肠癌免疫治疗效果的制剂，制剂包括分子标志物KIAA1199基因。
一种方式，所述KIAA1199基因表达在免疫抑制微环境中表现包括下述中至少一种：
增加转移灶内嗜中性粒细胞浸润，
降低转移灶CD8+T细胞比例和/或抗肿瘤活性，
降低IFN-γ+CD8+T。
一种方式，所述KIAA1199基因的siRNA序列为下述中任一
KIAA-Hsa-SiRNA1：5’-gcaatcgtcccattgatatac-3’，
KIAA-Hsa-SiRNA2：5’-gctccaagcaagagataaaga-3’，
KIAA-Hsa-SiRNA3：5’-ggctgtgagaggataaagatt-3’。
本发明的有益效果是：
通过抑制KIAA1199基因表达实现肿瘤治疗，KIAA1199为打破肿瘤疾病中如肝脏免疫抑制微环境、遏制结肠癌肝转移的靶标；同时开拓了吡非尼酮、KIAA1199基因的siRNA治在疗肿瘤中新用途。
附图说明
图1展示KIAA1199在结肠癌原发灶及配对肝脏转移灶中表达情况；
图2展示免疫荧光检测结肠癌患者原发灶及肝转移灶中KIAA1199、中性粒细胞表面标志物CD66B、T淋巴细胞CD8A表达情况；
图3展示筛选siRNA和化学药物靶向抑制KIAA1199表达的情况；
图4展示KIAA1199不同表达水平的结直肠癌细胞株条件培养基对嗜中性粒细胞的趋化能力；
图5展示靶向抑制KIAA1199对结直肠癌肝转移灶的形成的影响；
图6展示靶向抑制KIAA1199改善荷瘤鼠肝脏组织中的免疫抑制微环境情况；
图7展示靶向抑制KIAA199联合PD-1抗体防治结肠癌肝转移情况；
图8展示KIAA1199作为分子标志物预测结直肠癌免疫治疗效果。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
KIAA1199基因在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。
一些具体的使用情况中，所述应用为KIAA1199基因在制备防治肿瘤疾病药物中作为治疗靶标的应用。
试剂在制备防治肿瘤疾病药物中的应用，所述试剂包括KIAA1199基因表达的抑制剂。
一些实施例中，所述抑制剂为KIAA1199基因的siRNA；或
所述抑制剂为吡非尼酮；
另一些实施例，所述试剂为PD-1抗体-KIAA1199基因表达抑制剂的联合物，
进一步的方式中，所述联合物为防治癌细胞转移有效组分，优选为防治结肠癌肝转移有效组分。
一些实施例，所述肿瘤疾病为结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌，所述肿瘤疾病优选为肠癌肝转移。
防治肿瘤疾病的产品，包含所述的试剂。
如下任一项应用：
a.吡非尼酮在制备防治肿瘤疾病药物中的应用；
b.KIAA1199基因的siRNA在制备防治肿瘤疾病药物中的应用；
c.KIAA1199基因在预测或检测结直肠癌免疫治疗效果模型中作为分子标志物的应用。
上述的应用中，在一些使用环境中：
a中所述吡非尼酮为KIAA1199基因表达的抑制剂，
b中所述KIAA1199基因的siRNA为KIAA1199基因表达的抑制剂，
c中治疗效果为PD-1治疗结直肠癌疗效。
预测结直肠癌免疫治疗效果的制剂，制剂包括分子标志物KIAA1199基因。
所述KIAA1199基因表达在免疫抑制微环境中表现包括下述中至少一种：
增加转移灶内嗜中性粒细胞浸润，
降低转移灶CD8+T细胞比例和/或抗肿瘤活性，
降低IFN-γ+CD8+T。
所述KIAA1199基因的siRNA序列为下述中任一
KIAA-Hsa-SiRNA1：5’-gcaatcgtcccattgatatac-3’，
KIAA-Hsa-SiRNA2：5’-gctccaagcaagagataaaga-3’，
KIAA-Hsa-SiRNA3：5’-ggctgtgagaggataaagatt-3’。
在胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌等多种人类肿瘤中KIAA1199高表达，且与肿瘤发生、发展及预后不良相关。进一步，在结直肠癌肝转移的临床标本中KIAA1199参与重塑肝脏免疫抑制微环境，具体表现为肝脏组织内N2表型中性粒细胞浸润增多，CD8+T细胞比例降低，其中尤以分泌IFN-r的T细胞比例降低最为显著。在经脾肝转移和结直肠原位种植肝转移模型中进一步得到证实。提示KIAA1199是打破肝脏免疫抑制微环境，遏制结肠癌肝转移的潜在靶标。
实施例一
KIAA1199基因在结直肠原发灶及肝转移灶中的差异表达。选取经病理学确诊的结直肠癌手术标本及其配对的肝转移组织标本，SP法进行免疫组化染色。石蜡切片经过常规性脱蜡、水化，柠檬酸盐抗原修复液中修复，使用浓度为0.3％的过氧化氢甲醇液将内源性过氧化氢酶的活性阻断，正常血清37℃孵育15min，加入抗KIAA1199单克隆抗体(1∶500稀释)后在4℃冰箱内孵育并过夜，再加入生物素标记抗IgG抗体和辣根过氧化物酶标记抗IgG抗体(北京中杉公司)经过37℃孵育60min后，用DAB进行显色以及苏木精复染，最后中性树胶封片。以PBS替代一抗作为阴性对照，光学显微镜判断结果着色情况，胞浆棕黄色颗粒为阳性细胞。
结果如图1中所示，KIAA1199基因在结直肠肝转移灶的表达显著高于原发灶。图1中A应用GEO数据库分析结直肠癌原发灶和肝转移灶中KIAA1199转录水平表达；图1中B免疫组织化学对比分析结直肠癌原发灶和肝转移灶内KIAA 1199蛋白质差异表达情况。
实施例二
多重组织免疫荧光检测原发灶及肝转移灶内的免疫细胞组成和分布情况。新鲜组织标本组织连续切片，40g/L多聚甲醛固定12h，200mL/L蔗糖溶液脱水12h，OCT包埋组织，冰冻，连续组织切片，行常规免疫荧光染色：抗CD66B、CD8A和KIAA1199一抗稀释度为1∶200，二抗稀释度为1∶100)，PBS避光洗涤3次，每次5min，避光滴加70μl Hoechst 33342稀释液(1mg/ml，1∶2000)，室温避光孵育5min。PBS避光洗涤3次，每次5min；滴加适量抗荧光淬灭封片剂，激光共聚焦显微镜下观察，图片拍照保存。
结果如图2中所示，结直肠癌组织中KIAA1199表达与中性粒细胞浸润呈正相关。
实施例三
筛选靶向抑制KIAA1199表达的siRNA和化学药物。
3.1靶基因siRNA靶位点选择的一般原则靶siRNA序列选择是RNAi实验成败的关键。哺乳动物细胞RNAi实验中，使用最广泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA由正义链和反义链组成，其中正义链的前21nt与靶基因序列相同。具体原则如下：
1)靶序列为目的基因编码区内21bp长度的序列；
2)避免在距起始密码和终止密码50-100bp范围选取靶位；
3)避免≥4个连续的A或T；
4)通过BLAST分析确定该序列特异靶向目的基因。
3.2遵循以上原则，应用在线设计软件siRNA Wizard(www.sirnawizard.com)，针对鼠源性KIAA1199基因筛选了三段候选序列作为siRNA的靶(图3中A)，阴性对照是一段经BLAST比对证实与靶细胞中的其他基因均无同源性的一段核酸序列。
人源性如下表所示，也具有相应的抑制作用。
KIAA-Hsa-SiRNA1： 5’-gcaatcgtcccattgatatac-3’，
KIAA-Hsa-SiRNA2： 5’-gctccaagcaagagataaaga-3’，
KIAA-Hsa-SiRNA3： 5’-ggctgtgagaggataaagatt-3’。
3.3Liperfectamine 2000转染退火后的psiRNA片段，采用Western Blot检测3对siRNA在翻译水平干预靶基因的表达。如图3中B所示，与Scramble序列相较而言，psiRNA1、psiRNA2和psiRNA3均可不同程度地抑制KIAA1199蛋白的表达，其中又以psiRNA3对靶基因的干预效果最为显著。
3.4鉴于目前尚无靶向KIAA1199的小分子干扰剂或药物，特发性肺纤维化药物吡非尼酮(pirfenidone；PFD)是潜在的KIAA1199基因的干预药物。为了验证该药物对KIAA1199基因表达的抑制作用，分别采用终浓度为500ug/mL和1000ug/mL的PFD处理MC38细胞株，48h后，提取细胞总蛋白，图3中C示出Western Blot免疫印迹检测目的基因KIAA1199的表达情况。
实施例四
KIAA1199不同表达水平的结直肠癌细胞株条件培养基对嗜中性粒细胞的趋化能力。
4.1C57BL/6J小鼠骨髓中性粒细胞提取。取8-10周龄的小鼠，雌雄不限，取股骨和胫骨，剪掉骨髓两端，暴露骨髓腔，注射器冲洗获得骨髓细胞；用70微米尼龙网过滤，离心收集细胞；应用红细胞裂解液裂解细胞后洗涤；应用MACS免疫磁珠法分离嗜中性粒细胞细胞，并采用Ly6G/CD11B进行纯度验证。
4.2趋化实验。将1*106个嗜中性粒细胞置于Tanswell小室上室中，将DMEM，MC38培养上清和稳定感染psiRNA3的MC38细胞条件培养基按照一定的浓度加入培养下室，6h后观察并计数下室内嗜中性粒细胞。此外将外源性KIAA1199真核表达质粒稳定转染入HCT116细胞中，进一步论证KIAA1199的表达水平对条件培养基趋化中性粒细胞的能力。
4.3为进一步确定KIAA1199的表达增加中性粒细胞的趋化能力与KIAA1199表达密切相关，将不同表达水平的结直肠癌细胞条件培养基分别与中性粒细胞进行培养，计数趋化入下室的中性粒细胞。结果参见图4中示出内容。
实施例五
靶向抑制KIAA1199减少结直肠癌肝转移灶的形成。8-10周龄的C57BL/6J品系小鼠，雌雄不限，麻醉后经脾脏注射入C57BL/6小鼠建立肝转移模型，8-10周龄的C57BL/6J品系小鼠，雌雄不限，麻醉后经脾脏注射入5*105个MC38 scramble(Control)和shKIAA199MC38结直肠癌细胞建立肝转移模型，21天后观察肝脏组织表面的转移肿瘤数目，称取肿瘤/小鼠体重比，采用HE确认肝脏转移灶。
靶向抑制KIAA1199减少结直肠癌肝转移灶的形成。图5中A展示经脾肝转移模型的建立；如图5中B、C展示肝脏表面转移病灶的个数，肿瘤/体重比，大体观及HE染色。KIAA1199在结肠癌肝转移发生发展过程中发挥重要作用。
实施例六
靶向抑制KIAA1199改善荷瘤鼠肝脏组织中的免疫抑制微环境。分别将5*105个MC38 scramble(Control)和shKIAA199 MC38结直肠癌细胞注射入脾脏，制备经脾肝转移瘤模型，21天后，收集肝脏转移病灶，制备单细胞悬液后，采用流式细胞仪定量分析肿瘤组织内CD45+细胞、CD45+/CD11b+/Ly6G+中性粒细胞、CD45+/F4/80+巨噬细胞、IFN-γ+/CD8+T细胞的比例。
结果如图6中所示，靶向抑制KIAA1199改善荷瘤鼠肝脏组织中的免疫抑制微环境。
实施例七
靶向抑制KIAA199联合PD-1抗体防治结肠癌肝转移。鉴于靶向KIAA1199后转移灶内的免疫抑制微环境大为改善，为进一步明确KIAA199作为靶点治疗结肠癌肝转移的临床价值，使用构建完成的稳转细胞系建立小鼠C57 BL/6盲肠原位瘤自发肝转移模型及经脾肝转移模型。分别验证单独抑制KIAA199，抑制KIAA199联合抗PD-1疗法的效果，具体分组如下：
①KIAA199 overexpression；
②KIAA199 overexpression+anti-PD-1；
③KIAA199 overexpression+吡非尼酮(PFD)；
④KIAA199 overexpression+吡非尼酮(PFD)+anti-PD-1。
小鼠接种肿瘤细胞后第三天开始使用吡非尼酮(300mg/kg/d)，PD-1单克隆抗体(200ug，day 3、5、7、9、11)。连续监测小鼠体重，每周活体成像监测肝转移及原发灶生长趋势，21天后对小鼠进行安乐死处理，采集肿瘤原发灶及肝转移灶组织。大体及HE观察小鼠肝转移灶大小及数目。
结果如图7中所示，靶向抑制KIAA199联合PD-1抗体能有效防治结肠癌肝转移。
实施例八
KIAA1199作为分子标志物预测结直肠癌免疫治疗效果的临床价值。GEO数据库分析显示，具有微卫星高度不稳定(MSI-H)表型的结直肠癌患者肿瘤组织内KIAA1199基因水平显著低于微卫星稳定/低度不稳定(MSS/MSI-L)表型患者，鉴于微卫星稳定性状态在判断结直肠癌患者预后及指导免疫治疗用药的意义，预示着肿瘤组织中KIAA1199表达可作为PD-1疗效预测的分子标志物。
建立了不同KIAA1199表达状态的MC-38皮下移植瘤模型，比较了野生型wt-MC38和过表达KIAA1199 over-MC38皮下移植瘤对PD-1抗体治疗的响应。具体操作如下：取8-10周龄的C57BL/6J小鼠，皮下接种wt-MC38或KIAA1199 over-MC38细胞2*10^5/只，从第6天开始腹腔注射PD-1单抗(200ug/只)，隔一天注射一次，连用4次，绘制皮下移植瘤生长曲线。
肿瘤组织中KIAA1199表达水平影响结直肠癌免疫治疗疗效。如图8中A表明GEO数据分析结直肠癌KIAA1199表达与微卫星不稳定性间的相关性，如图8中B、C表明肿瘤细胞KIAA1199基因表达水平影响PD-1抗体治疗疗效。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (13)

1.KIAA1199基因在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为KIAA1199基因在制备防治肿瘤疾病药物中作为治疗靶标的应用。
3.试剂在制备防治肿瘤疾病药物中的应用，其特征在于，所述试剂包括KIAA1199基因表达的抑制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为KIAA1199基因的siRNA；或
所述抑制剂为吡非尼酮。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂为PD-1抗体-KIAA1199基因表达抑制剂的联合物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述联合物为防治癌细胞转移有效组分，优选为防治结肠癌肝转移有效组分。
7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾病为结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌，所述肿瘤疾病优选为肠癌肝转移。
8.防治肿瘤疾病的产品，其特征在于，包含权利要求3-6中任一所述的试剂。
9.如下任一项应用：
a.吡非尼酮在制备防治肿瘤疾病药物中的应用；
b.KIAA1199基因的siRNA在制备防治肿瘤疾病药物中的应用；
c.KIAA1199基因在预测或检测结直肠癌免疫治疗效果模型中作为分子标志物的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，a中所述吡非尼酮为KIAA1199基因表达的抑制剂；
b中所述KIAA1199基因的siRNA为KIAA1199基因表达的抑制剂；
c中治疗效果为PD-1治疗结直肠癌疗效。
11.预测结直肠癌免疫治疗效果的制剂，其特征在于，制剂包括分子标志物KIAA1199基因。
12.根据权利要求3-6、10中任一所述的应用，其特征在于，所述KIAA1199基因表达在免疫抑制微环境中表现包括下述中至少一种：
增加转移灶内嗜中性粒细胞浸润，
降低转移灶CD8+T细胞比例和/或抗肿瘤活性，
降低IFN-γ+CD8+T。
13.根据权利要求4或9所述的应用，其特征在于，所述KIAA1199基因的siRNA序列为下述中任一
KIAA-Hsa-SiRNA1：5’-gcaatcgtcccattgatatac-3’，
KIAA-Hsa-SiRNA2：5’-gctccaagcaagagataaaga-3’，
KIAA-Hsa-SiRNA3：5’-ggctgtgagaggataaagatt-3’。
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