CN113030317A - 一种植物挥发性有机化合物的保存、分析方法 - Google Patents

一种植物挥发性有机化合物的保存、分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种植物挥发性有机化合物的保存方法和分析方法,所述保存方法包括:使用萃取头对植物组织释放的挥发性有机化合物以顶空固相微萃取法进行富集;然后将萃取头置于温度为0℃到‑10℃密闭环境中,保存不超过48个小时,以便后续进行分析。本发明直接对具有生命活性的植物样品进行VOCs常温萃取,低温保存,避免了固定处理对样品造成的影响,从而使检测结果更加真实;当样品采集地与实验检测地相距较远,或植株不宜进行运输及组织样品采集时,可利用该技术检测VOCs;当检测队列中存在多个样品时,可用于保存富集了待测VOCs的萃取头,适用于不能当时检测的VOCs。

Description

一种植物挥发性有机化合物的保存、分析方法
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域,具体涉及一种植物挥发性有机化合物的保存、分析方法。
背景技术
植物不同器官通过新陈代谢作用产生的挥发性有机化合物(volatile organiccompounds,VOCs),是一类可自由穿过细胞膜并扩散入周边环境的物质。它们作为生物信号物质,可在植物体内或植物与其他生物之间传递信息,减轻或避免病虫害的发生。除此之外,这类化合物还是农产品特殊风味的重要贡献物。
常见的VOCs富集方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和超临界流体萃取法等,其中,固相微萃取法对VOCs的富集最为简便,而且该方法所需设备操作简单、方便携带。对于仍具有生命活性的植物样品而言,当所处环境发生改变时,其代谢活动会受到影响,代谢产物也会随之发生变化。因此,为了了解植物样品在某一特定状态下的VOCs特征,在萃取VOCs前须对样品进行固定处理,以停止其生命活动,避免VOCs产生过大变化。常用的样品固定处理方式有冷冻固样、热风固样、微波固样和液氮研磨等,但这类处理不仅需要额外的处理时间或特定的仪器设备及相关耗材,还延长了检测时间,增加了检测成本。此外经该类处理后,所得检测结果仍与真实的植物样品VOCs释放情况存在差异。
顶空固相微萃取是常用于挥发性有机化合物富集的固相微萃取方法。该方法利用萃取头上所附着的纤维涂层进行待测物吸附,但由于萃取后的保存运输环境与萃取时的环境不同,易导致纤维涂层中已吸附待测物的流失,所以富集完VOCs后,须立即进行后续检测工作。由此可见,当植物样品不宜进行搬运且所在地较为偏远时,较难完成VOCs的检测分析。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种植物挥发性有机化合物的保存方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种植物挥发性有机化合物的保存方法,包括以下步骤:
1)使用萃取头对植物组织释放的挥发性有机化合物在15-35℃进行以顶空固相微萃取法萃取;
2)然后将萃取头置于温度为0℃到-10℃密闭环境中,保存不超过48个小时。
在其中一些实施例中,步骤2)所述的密闭环境中的温度为-2℃到-8℃。
在其中一些实施例中,步骤2)所述的密闭环境中的温度为-2℃到-6℃。
在其中一些实施例中,所述萃取头为SPME Arrow DVB/CarbonWR/PDMS。
在其中一些实施例中,所述的植物组织为离体植物组织。
在其中一些优选的实施例中,所述萃取温度为20-25℃。
在其中一些优选的实施例中,所述保存时间不超过42小时,更优选不超过36个小时。
在其中一些实施例中,所述植物组织为完整植株上的组织。
在其中一些实施例中,所述密闭环境为内部温度能达0℃到-10℃的密闭箱。
本发明的另一个目的是提供一种植物挥发性有机化合物的分析方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种植物挥发性有机化合物的分析方法,包括以下步骤:
1)使用萃取头对植物组织释放的挥发性有机化合物进行萃取;
2)然后将萃取头置于温度为0℃到-10℃密闭环境中,保存不超过48个小时;
3)将步骤2)保存的萃取头所富集的挥发性有机化合物解吸于气相色谱-质谱联用仪中,并进行相关数据采集;
4)对所采集的数据进行质谱图提取、保留指数计算及数据库信息检索与比对,完成定性分析。
本发明的发明人发现,采用顶空固相微萃取法完成VOCs萃取后,利用适当的低温环境(0℃到-10℃,特别是-2℃到-8℃)保存萃取头,能延长VOCs在萃取头的纤维涂层中的滞留时间,且不会对待测VOCs的组分和含量造成较大影响。根据这个发现,发明人构建合适的低温环境,用于放置VOCs富集完毕的萃取头,保持暂时不能检测分析的VOCs,以便保存运输及应对长检测队列,保持时间可长达48小时。
本发明直接对具有生命活性的植物样品进行VOCs常温萃取,避免了固定处理对样品造成的影响,从而使检测结果更加真实地反映植物样品在自然状态或某特定状态下的VOCs释放情况;以及结合本发明萃取后的保存方法,实现不需要使用特别制作的设备或仪器,可同时进行多个植物样品的VOCs富集,保证了不同处理间或不同样品间在实验时间维度上的一致性;当样品采集地与实验检测地相距较远,或植株不宜进行运输及组织样品采集时,可利用该技术检测VOCs;并且当检测队列中存在多个样品时,可用于同时在同一密闭环境中保存多个富集了待测VOCs的萃取头,互不影响,非常简单且非常方便地保持和运输了不能当时立即检测的VOCs。
附图说明
图1:离体植物组织的VOCs常温萃取示意图。
图2:萃取头在泡沫箱或保温箱中的收纳方式示意图。
图3:不同品质茶青的总离子流色谱图,A.对照茶青;B.保鲜茶青;C.劣变茶青。
图4:完整植株上某组织的VOCs常温萃取示意图。
具体实施方式
本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。
本发明的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形,意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分,而是可选地还包括没有列出的步骤,或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”,描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
除非特别说明或另有定义,本文所使用的“第一、第二…”仅仅是用于对名称的区分,不代表具体的数量或顺序。
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
1)以茶树品种英红九号为材料,采10g茶鲜叶置于150mL顶空瓶中,瓶口覆以特氟龙硅胶复合垫片(如图1所示),使用两根SPME Arrow DVB/CarbonWR/PDMS(1.5mm,120/20μm)萃取头a和b,在室温(22-24℃)条件下对顶空瓶中茶鲜叶释放的VOCs以顶空固相微萃取法进行萃取,萃取时间为40min;
2)萃取结束后,将萃取头a以手动进样方式进行解吸,利用气相色谱-质谱联用仪采集数据;萃取头b置于放有相变蓄冷剂(相变温度为-10℃)的泡沫箱中(如图2所示),泡沫箱中的温度为-2℃到-6℃;
3)萃取头b保存14小时后再进行解析,并使用气相色谱-质谱联用仪进行数据采集;
4)将所获数据进行质谱图提取与保留指数计算,可参考现有方法(例如Babushok,V.I.,Linstrom,P.J.,and Zenkevich,I.G.(2011).Retention Indices for FrequentlyReported Compounds of Plant Essential Oils.Journal of Physical and ChemicalReference Data.40:043101,和Smith,C.A.,Want,E.J.,O’Maille,G.,Abagyan,R.,andSiuzdak,G.(2006).XCMS:Processing Mass Spectrometry Data for MetaboliteProfiling Using Nonlinear Peak Alignment,Matching,andIdentification.Analytical Chemistry.78:779–787),并于NIST(National Instituteof Standards and Technology)网站中进行检索与比对,以完成定性分析。
结果显示,在两个萃取头所富集的VOCs中,均鉴定出22种挥发性有机化合物,其中醇类化合物2种、醛类化合物1种、酯类化合物8种、酮类化合物2种、烃类化合物9种;此外,通过比较各化合物的峰面积也发现,萃取头a和萃取头b所富集的VOCs之间不存在明显差异(见表1)。
本发明的发明人发现,将萃取后的萃取头置于温度为-2℃到-6℃的泡沫箱中保存14小时,不会对待测VOCs造成影响。
表1.低温保存对萃取头中VOCs组成的影响
Figure BDA0002965970030000061
Figure BDA0002965970030000071
Figure BDA0002965970030000081
注:“MS”表示满足质谱定性条件,“RI”表示满足保留指数定性条件
实施例2:
1)以茶树品种英红九号的茶鲜叶为材料,分别进行4℃保鲜处理和42℃高温堆放处理,处理时间均为3小时,得到经保鲜处理的茶青及已发生劣变的茶青。随后,称取对照茶青(采摘后未经任何处理的新鲜茶青)、经保鲜处理的茶青及已发生劣变的茶青各10g,分别置于不同的150mL顶空瓶中,各瓶口均覆以特氟龙硅胶复合垫片。使用三根SPME ArrowDVB/CarbonWR/PDMS(1.5mm,120/20μm)萃取头a、b、c,于室温(22-24℃)条件下分别对三类不同茶青样品(即对照茶青、保鲜茶青和劣变茶青)所释放的VOCs以顶空固相微萃取法进行萃取,萃取时间为40min;
2)萃取结束后,建立检测队列,并依次进行检测,采集相关数据,即当萃取头a进行手动进样、解吸及气相色谱-质谱联用仪检测时,萃取头b和萃取头c被保存于同一放有蓄冷剂(相变温度为-10℃)的密闭泡沫箱中,泡沫箱中的温度为-4℃到-8℃,保存4小时后先检测萃取头b,然后再过1个小时检测萃取头c;
3)参照实施例1,对所采集的数据进行质谱图提取、保留指数计算并于NIST网站中进行检索与比对,以完成定性分析,获得不同品质茶青的VOCs释放情况。
结果显示,在萃取头a所富集的VOCs中,鉴定出22种挥发性有机化合物,其中醇类化合物2种、醛类化合物1种、酯类化合物8种、酮类化合物2种、烃类化合物9种;在萃取头b所富集的VOCs中,鉴定出19种挥发性有机化合物,其中醇类化合物2种、醛类化合物1种、酯类化合物5种、酮类化合物2种、烃类化合物9种;在萃取头c所富集的VOCs中,鉴定出28种挥发性有机化合物,其中醇类化合物9种、醛类化合物2种、酯类化合物2种、酮类化合物3种、烃类化合物11种、含氮化合物1种(见表2)。比较总离子流色谱图(见图3)也发现,三个萃取头所富集的VOCs呈现了样品间的差异。因萃取头b和萃取头c曾于同一低温环境中保存,而它们的VOCs组成间仍展现出极大差异,这说明在此环境下萃取头中的挥发性有机化合物未发生逸散,样本之间不存在相互影响,该保存方法简单可靠。因此,在应对检测队列中存在多个样品的情况时,无须为富集了不同待测VOCs的萃取头一一设置低温保存设备。
表2.不同品质茶青的VOCs释放情况
Figure BDA0002965970030000091
Figure BDA0002965970030000101
Figure BDA0002965970030000111
注:“MS”表示满足质谱定性条件,“RI”表示满足保留指数定性条件
实施例3:
1)取香茅叶片及茎秆共0.5g,置于250mL顶空瓶中,瓶口覆以特氟龙硅胶复合垫片。使用三根SPME Arrow DVB/CarbonWR/PDMS(1.5mm,120/20μm)萃取头a、b、c,于室温(25-27℃)条件下对香茅叶片及茎秆所释放的VOCs以顶空固相微萃取法进行萃取,萃取时间为30min;
2)萃取结束后,将萃取头a以手动进样方式进行解吸,利用气相色谱-质谱联用仪采集数据;萃取头b存放于带有相变蓄冷剂(相变温度为-10℃)的泡沫箱中,泡沫箱中的温度为-8℃到-2℃;萃取头c则放置于室温(25-27℃)环境中;
3)42小时后,分别对萃取头b和萃取头c进行手动进样、解吸及气相色谱-质谱联用仪检测;
4)将所获数据进行质谱图提取与保留指数计算,可参考现有方法(例如Babushok,V.I.,Linstrom,P.J.,and Zenkevich,I.G.(2011).Retention Indices for FrequentlyReported Compounds of Plant Essential Oils.Journal of Physical and ChemicalReference Data.40:043101,和Smith,C.A.,Want,E.J.,O’Maille,G.,Abagyan,R.,andSiuzdak,G.(2006).XCMS:Processing Mass Spectrometry Data for MetaboliteProfiling Using Nonlinear Peak Alignment,Matching,andIdentification.Analytical Chemistry.78:779–787,并于NIST(National Institute ofStandards and Technology)网站中进行检索与比对,以完成定性分析。
结果显示,在萃取头a和萃取头b所富集的VOCs中,均鉴定出55种挥发性有机化合物,其中醇类化合物3种、醛类化合物10种、酯类化合物2种、酮类化合物1种、烃类化合物39种,且峰面积相近;而在萃取头c所富集的VOCs中,仅鉴定出45种挥发性有机化合物,其中醇类化合物2种、醛类化合物9种、酯类化合物2种、酮类化合物1种、烃类化合物31种,且部分VOCs的峰面积有所下降(见表3)。这说明,萃取头c所富集的VOCs发生了逸散,因而导致部分挥发性有机化合物响应降低或未检出。由此可见,对于保持萃取头中所富集的VOCs,低温环境优于室温环境。
表3.不同保存环境对萃取头中VOCs组成的影响
Figure BDA0002965970030000121
Figure BDA0002965970030000131
Figure BDA0002965970030000141
Figure BDA0002965970030000151
注:“MS”表示满足质谱定性条件,“RI”表示满足保留指数定性条件
实施例4:
1)以处于盛花期的四季桂为材料,参照图4所示方式,对位于枝条顶部及叶腋处的花序进行VOCs以顶空固相微萃取法进行萃取富集,所用萃取头为SPME Arrow DVB/CarbonWR/PDMS(1.5mm,120/20μm),萃取时环境温度为25±1℃,萃取时间为20min;
2)萃取结束后,将萃取头放置于带有相变蓄冷剂(相变温度为-10℃)的泡沫箱中,运送回实验室,即于-6℃到-2℃下共保存了36个小时,然后进行手动进样、解吸及气相色谱-质谱联用仪检测;
3)参照实施例1,将气相色谱-质谱联用仪所采集的数据进行质谱图提取、保留指数计算并于NIST网站中进行数据检索与比对,以完成定性分析。
结果显示,参见表4,在低温保存后的萃取头所富集的VOCs中共鉴定出62种挥发性有机化合物,其中醇类化合物15种、醛类化合物5种、酯类化合物2种、酮类化合物10种、烃类化合物30种;此外,芳樟醇、芳樟醇氧化物、香叶醇、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、二氢-β-紫罗兰酮、β-罗勒烯等桂花香气常见主要成分也均被检出,且响应较高。
表4.四季桂的VOCs释放情况
Figure BDA0002965970030000161
Figure BDA0002965970030000171
Figure BDA0002965970030000181
注:“MS”表示满足质谱定性条件,“RI”表示满足保留指数定性条件
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种植物挥发性有机化合物的保存方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)使用萃取头对植物组织释放的挥发性有机化合物在15-35℃以顶空固相微萃取法进行萃取;
2)然后将萃取头置于温度为0℃到-10℃密闭环境中,保存时间不超过48个小时。
2.根据权利要求1所述的保存方法,其特征在于,步骤2)所述的密闭环境中的温度为-2℃到-8℃。
3.根据权利要求2所述的保存方法,其特征在于,步骤2)所述的密闭环境中的温度为-2℃到-6℃。
4.根据权利要求1所述的保存方法,其特征在于,所述萃取头为SPME Arrow DVB/CarbonWR/PDMS。
5.根据权利要求1所述的保存方法,其特征在于,所述的植物组织为离体植物组织。
6.根据权利要求1-5任一项所述的保存方法,其特征在于,萃取时的温度为20-25℃。
7.根据权利要求1所述的保存方法,其特征在于,所述的植物组织为完整植株上的组织。
8.根据权利要求1-5任一项所述的保存方法,其特征在于,所述保存时间不超过42小时,更优选不超过36个小时。
9.一种植物挥发性有机化合物的分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)使用萃取头对植物组织释放的挥发性有机化合物在15-35℃进行以顶空固相微萃取法萃取;
2)然后将萃取头置于温度为0℃到-10℃密闭环境中,保存不超过48个小时;
3)将步骤2)保存的萃取头所富集的挥发性有机化合物解吸于气相色谱-质谱联用仪中,并进行数据采集;
4)对所采集的数据进行质谱图提取、保留指数计算及数据库信息检索与比对,完成定性分析。
10.根据权利要求9所述的分析方法,其特征在于,所述植物组织为离体植物组织或完整植株上的组织。
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