CN113030296B - 一种筛查金银花及其栽种土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种筛查金银花及其栽种土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的方法，将经预处理后的金银花及其土壤，利用超高效液相色谱‑四极杆/高分辨质谱，采用Full MS/vDIA的非靶向扫描模式分别找到和阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐有相同的二级碎片离子的候选化合物，然后基于Full MS/ddMS2模式对所有候选化合物进行靶向扫描，根据质谱裂解的规律，通过特征二级碎片离子信息的识别匹配，找到阿维菌素的降解产物23个，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解产物22个，且在无降解产物对照品的条件下，可以对降解产物进行半定量分析，以此可以全面筛查出金银花及其土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐中降解产物的残留量及残留动态。

Description

一种筛查金银花及其栽种土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素 苯甲酸盐降解产物的方法
技术领域
本发明涉及中药分析检测领域，尤其涉及一种筛查金银花及其栽种土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的方法。
背景技术
金银花为忍冬科植物忍冬Lonicerajaponica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有保肝利胆、广谱抗菌、通经活络、健脑明目、疏散风寒等功效[1]。随着金银花用量逐年递增，其种植面积不断扩大，病虫害发生及危害也日益严重，已成为制约我国金银花产业发展的重要原因之一。
阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐为阿维菌素类农药中日常最常使用的两种农药，阿维菌素类农药是由链霉菌产生的一组广谱、高效、低残留的大环内酯类抗生素，目前广泛应用于金银花的病虫害防治以替代传统的毒性较高的化学农药[2,3]。而近年随着病虫害发生的严重，阿维菌素类农药的滥用问题不断显现，而阿维菌素类农药的滥用，使得阿维菌素类农药通过土壤及动物粪便进入环境，对水生生物、鸟类及陆生生物产生影响[4-8]，对人类健康造成潜在风险[9]，而阿维菌素类农药在金银花种植过程中的降解机制仍不清楚，国内外对此类农药的研究大多集中在农药母体的残留消解规律[10-13]，对于其降解产物更是罕有文献报道[14]。而以往专利中，并没有针对于金银花中阿维菌素类农药的检测筛查方法，而全面筛查阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的方法更是没有报道过。因此，需要针对金银花及其土壤开展个性化研究，筛查出阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐可能的降解产物构型，阐明其降解机制，全面评价此类农药在金银花中的残留风险。
参考文献：
[1]国家药典委员会,中国药典2015年版一部.
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[13]李人杰,暴连群.阿维菌素在玉米和土壤中的消解动态及最终残留.现代农药,2016,15(4):43-47.
[14]张卫.农药阿维菌素在环境中降解和代谢研究.浙江大学博士学位论文,2004.
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种筛查金银花及其栽种土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
提供一种筛查金银花及其栽种土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的方法，采用超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱检测，包括如下步骤：
步骤一，分别将金银花和土壤进行前处理，得到供试品溶液；
步骤二，采用超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱，在Full MS/vDIA非靶向扫描模式下对阿维菌素对照品和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对照品的二级质谱数据进行分析，同时采用Mass Frontier软件辅助推导理论裂解碎片；通过提取所述理论裂解碎片的诊断离子m/z寻找所述供试品溶液中的阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的候选降解产物；
步骤三，基于Full MS/ddMS2模式对所有所述候选降解产物进行靶向扫描，根据质谱裂解的规律，通过特征二级碎片离子信息的识别匹配进行精细结构推导；通过液相色谱-静电场轨道阱质谱方法，分别对所述阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解机制进行研究，初步鉴定了所述阿维菌素的降解产物23个、所述甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解产物22个。
进一步地，所述阿维菌素的理论裂解碎片具体为：含亚结构片段Ⅰ和Ⅱ的诊断离子m/z 567.3316([C34H47O7]+)、仅含亚结构片段Ⅱ的诊断离子m/z 305.2111([C19H29O3]+)、亚结构片段Ⅲ进一步裂解得到的碎片离子m/z 145.0859([C7H13O3]+)、m/z 113.0597([C6H9O2]+)和m/z 95.04914([C6H7O3]+)。
进一步地，所述甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的理论裂解碎片具体为：含亚结构片段c的诊断离子m/z 302.1962([C15H28O5N]+)，以及由亚结构片段c进一步裂解得到的离子m/z270.1700([C14H27O4N]+)、m/z/158.1176([C8H16O2N]+)和m/z126.0913([C7H12ON]+)。
进一步地，23个所述阿维菌素的降解产物具体为：1个光异构化的降解产物；1个去甲基化的降解产物；14个单羟基化以及双羟基化的降解产物；6个羰基化或羟基化后脱氢的降解产物；1个羟基化加羰基化的降解产物。
进一步优选地，23个所述阿维菌素的降解产物具体为：1个光异构化的降解产物，具体为8,9-Z-abamectin B1a(C48H72O14)；1个去甲基化的降解产物，具体为3”-O-desmethyl-abamectin B1a(C47H70O14)；14个单羟基化以及双羟基化的降解产物，具体为A1(C48H72O15)、A2(C48H72O15)、A3(C48H72O15)、A4(C48H72O16)、A5(C48H72O15)、A6(C48H72O15)、A7(C48H72O15)、A8(C48H72O15)、A9(C48H72O16)、A10(C48H72O16)、A11(C48H72O16)、A12(C48H72O16)、A13(C48H72O16)、A14(C48H72O16)；6个羰基化或羟基化后脱氢的降解产物，具体为A15(C48H70O15)、A16(C48H70O15)、A17(C48H70O15)、A18(C48H70O15)、A19(C48H70O15)、A20(C48H70O15)；1个羟基化加羰基化的降解产物，具体为A21(C48H70O16)。
进一步地，22个所述甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解产物具体为：1个光异构化的降解产物；2个去甲基化的降解产物；1个羟基化合并去甲基化的降解产物；3个羟基化合并甲基化的降解产物；6个单羟基化、双羟基化以及三羟基化的降解产物；4个羰基化或羟基化后脱氢的降解产物；4个其他类型降解产物；1个阿维菌素的同分异构体。
进一步优选地，22个所述甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解产物具体为：1个光异构化的降解产物，具体为8,9-Z-emamectin(C49H75NO13)；2个去甲基化的降解产物，具体为E1(C48H73NO13)、E2(C48H73NO13)；1个羟基化合并去甲基化的降解产物，具体为E3(C48H73NO14)；3个羟基化合并甲基化的降解产物，具体为E10(C50H77NO14)、E11(C50H77NO14)、E12(C50H77NO14)；6个单羟基化、双羟基化以及三羟基化的降解产物，具体为E4(C49H75NO14)、E5(C49H75NO15N)、E6(C49H75NO15N)、E7(C49H75NO15N)、E8(C49H75NO16)、E9(C49H75NO16)；4个羰基化或羟基化后脱氢的降解产物，具体为E13(C49H73NO14)、E14(C49H73NO14)、E15(C49H73NO14)、E16(C49H73NO14)；4个其他类型降解产物，具体为E17(C51H77NO14)、E18(C51H77NO15)、E19(C39H63O14N)、E20(C37H63NO11)；1个阿维菌素的同分异构体。
进一步地，所述超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱检测中，超高效液相色谱条件为：色谱柱C18，3.0×150mm，2.7μm；流动相A为0.01～0.5％甲酸+1～20mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B为0.01～0.5％甲酸+1～20mmol/L甲酸铵甲醇溶液；柱温30℃～50℃；流速为0.1～0.6ml/min；进样量1～20μL；梯度洗脱。
进一步优选地，所述梯度洗脱具体为：
Figure BDA0002941721890000041
Figure BDA0002941721890000051
进一步地，所述超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱检测中，质谱条件为：离子源电喷雾，正离子扫描模式ESI(+)；监测方式Full MS/vDIA模式、Full MS/ddMS2模式；电喷雾电压3.5kV；毛细管温度256℃；S-lens RF level 55.0；鞘气48；辅助气11；吹扫气2；辅助气温度413℃。
进一步地，所述金银花包括金银花药材和金银花叶子，其前处理步骤为：精密称取所述金银花药材或金银花叶子的粉末，加入0.01％～0.2％冰醋酸水溶液浸润后，加入乙腈与氘代莠去津内标溶液，混匀，加入无水硫酸镁和醋酸钠混合粉末，振摇提取，离心后取上清液至分散固相萃取净化管净化，取净化液，浓缩定容，摇匀，滤过，即得。
进一步优选地，所述无水硫酸镁和醋酸钠的质量比为(3～5):(0.5～1.5)；所述氘代莠去津内标溶液的浓度为5～10ng/mL；所述乙腈与氘代莠去津内标溶液的体积比为(150～200):1。
进一步地，所述土壤的前处理步骤为：精密称取土壤供试品，加入丙酮和氘代莠去津内标溶液，振摇提取，重复2～4次，合并并浓缩提取液，用乙腈定容，摇匀，滤过，即得。
进一步优选地，所述氘代莠去津内标溶液的浓度为5～10ng/mL；所述丙酮和氘代莠去津内标溶液的体积比为(200～400):1。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明将经预处理后的金银花及其土壤，利用超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱，采用Full MS/vDIA的非靶向扫描模式分别找到和阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐有相同的二级碎片离子的候选化合物，然后基于Full MS/ddMS2模式对所有候选化合物进行靶向扫描，根据质谱裂解的规律，通过特征二级碎片离子信息的识别匹配，在金银花及其土壤中，找到阿维菌素的降解产物23个，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解产物22个，且在无降解产物对照品的条件下，可以对降解产物进行半定量分析，以此可以全面筛查出金银花及其土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐中降解产物的残留量及残留动态，并为阐明阿维菌素类农药的降解过程奠定基础。
附图说明
图1为阿维菌素的质谱裂解行为；
图2为甲氨基阿维菌素的质谱裂解行为；
图3为阿维菌素的降解产物类型；
图4为甲氨基阿维菌素的降解产物类型。
具体实施方式
本发明提供了一种筛查金银花及其栽种土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的方法，采用超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱检测：
1.样品前处理
金银花药材：取供试品粉末3g(精确至0.01g)，加入0.01％～0.2％冰醋酸水溶液15mL浸润后，加入乙腈15mL与100μL5～10ng/mL氘代莠去津内标溶液，混匀，加入7.5g无水硫酸镁和醋酸钠混合粉末(质量比为3～5:0.5～1.5)，振摇提取，离心后取上清液10ml至分散固相萃取净化管(无水硫酸镁800～1000mg，PSA500～700mg，C18200～400mg，GCB 70～110mg)净化，取5ml净化液，浓缩定容至1ml，摇匀，滤过，即得。
金银花叶子：取供试品粉末3g(精确至0.01g)，加入0.01％～0.2％冰醋酸水溶液15mL浸润后，加入乙腈15mL与100μL5～10ng/mL氘代莠去津内标溶液，混匀，加入7.5g无水硫酸镁和醋酸钠混合粉末(质量比为3～5:0.5～1.5)，振摇提取，离心后取上清液10ml至分散固相萃取净化管(无水硫酸镁800～1000mg，PSA500～700mg，C18200～400mg，GCB 70～110mg)净化，取5ml净化液，浓缩定容至1ml，摇匀，滤过，即得。
土壤：取供试品5g(精确至0.01g)，加入丙酮20～40mL和100μL5～10ng/mL氘代莠去津内标溶液，振摇提取，重复2～4次，合并并浓缩提取液，用乙腈定容至5mL，摇匀，滤过，即得。
2.色谱与质谱条件
2.1高效液相色谱条件采用美国Waters公司Acquity超高效液相色谱仪，色谱柱：C18(3.0×150mm，2.7μm)；流动相A为：0.01％～0.5％甲酸+1mmol/L～20mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B为：0.01％～0.5％甲酸+1mmol/L～20mmol/L甲酸铵甲醇溶液；柱温：30℃～50℃；流速为0.1～0.6ml/min；进样量：1～20μL；梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0002941721890000071
2.2质谱条件采用美国Thermo公司Q-Exactive高分辨质谱仪，离子源：电喷雾，正离子扫描模式ESI(+)；监测方式：Full MS/vDIA模式、Full MS/ddMS2模式；电喷雾电压：3.5kV；毛细管温度：256℃；S-lens RF level：55.0；鞘气：48；辅助气：11；吹扫气：2；辅助气温度：413℃。
Full MS/vDIA非靶向扫描模式：
①Full MS scan参数：扫描范围分别为250～450m/z，分辨率为70000fwhm，AGCtarget为3e6，maximum IT为200ms。vDIA参数：碎裂质量数依次为250～290、290～330、330～370、370～410、410～450m/z，分辨率为35000fwhm，AGC target为1e6，maximum IT为auto，steppedNCE为10、20、40。
②Full MS scan参数：扫描范围分别为450～700m/z，分辨率为70000fwhm，AGCtarget为3e6，maximum IT为200ms。vDIA参数：碎裂质量数依次为450～500、500～550、550～600、600～650、650～700m/z，分辨率为35000fwhm，AGC target为1e6，maximum IT为auto，steppedNCE为10、20、40。
③Full MS scan参数：扫描范围分别为700～965m/z，分辨率为70000fwhm，AGCtarget为3e6，maximum IT为200ms。vDIA参数：碎裂质量数依次为700～750、750～800、800～850、850～900、900～965m/z，分辨率为35000fwhm，AGC target为1e6，maximum IT为auto，steppedNCE为10、20、40。
Full MS/ddMS2模式扫描模式：
Full MS/ddMS2模式-1：扫描时间为0～21min
Full MS scan参数：扫描范围630～950m/z，分辨率为70000fwhm，AGC target为3e6，maximum IT为200ms。MS2 scan参数：分辨率为17500fwhm，AGC target为1e6，maximumIT为60ms，loop count为3，isolation window为3.0m/z，stepped NCE为10、20、40，intensity threshold为1.7e4，apex trigger为2～6s，dynamic exclusion为5.0s。
Full MS/ddMS2模式-2：扫描时间为7～9min
Full MS scan参数：扫描范围100～1000m/z，分辨率为70000fwhm，AGC target为3e6，maximum IT为200ms。MS2 scan参数：分辨率为17500fwhm，AGC target为1e6，maximumIT为60ms，loop count为1，isolation window为3.0m/z，stepped NCE为10、20、40，intensity threshold为1.7e4，apex trigger为2～6s，dynamic exclusion为5.0s。
Full MS/ddMS2模式-3：扫描时间为3～5min
Full MS scan参数：扫描范围250～630m/z，分辨率为70000fwhm，AGC target为3e6，maximum IT为200ms。MS2 scan参数：分辨率为17500fwhm，AGC target为1e6，maximumIT为60ms，loop count为1，isolation window为3.0m/z，stepped NCE为10、20、40，intensity threshold为1.7e4，apex trigger为2～6s，dynamic exclusion为5.0s。
Full MS/ddMS2模式-4：扫描时间为12～14min
Full MS scan参数：扫描范围400～500m/z，分辨率为70000fwhm，AGC target为3e6，maximum IT为200ms。MS2 scan参数：分辨率为17500fwhm，AGC target为1e6，maximumIT为60ms，loop count为1，isolation window为3.0m/z，stepped NCE为10、20、40，intensity threshold为1.7e4，apex trigger为2～6s，dynamic exclusion为5.0s。
3.阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的发现
通过对阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对照品在Full MS/vDIA非靶向扫描模式下的二级质谱数据进行分析，同时采用Mass Frontier软件辅助推导理论裂解碎片，总结两个化合物的质谱裂解行为及诊断裂解离子如下：
如图1所示，阿维菌素在正离子模式下容易裂解得到含亚结构片段Ⅰ和Ⅱ的诊断离子m/z 567.3316([C34H47O7]+)、仅含亚结构片段Ⅱ的诊断离子m/z 305.2111([C19H29O3]+)，以及由亚结构片段Ⅲ进一步裂解得到的碎片离子m/z 145.0859([C7H13O3]+)、m/z 113.0597([C6H9O2]+)和m/z 95.04914([C6H7O3]+)。通过以上诊断裂解离子分析能够辅助寻找阿维菌素的降解产物并对其进行精细结构推导。
如图2所示，与阿维菌素的裂解行为不同，甲氨基阿维菌素由于含有氮原子，在正离子模式下主要裂解得到含亚结构片段c的诊断离子m/z 302.1962([C15H28O5N]+)，以及由亚结构片段c进一步裂解得到的离子m/z 270.1700([C14H27O4N]+)、m/z/158.1176([C8H16O2N]+)和m/z 126.0913([C7H12ON]+)。通过以上诊断裂解离子分析能够辅助寻找甲氨基阿维菌素的降解产物并对其进行精细结构推导。
基于上述对阿维菌素和甲氨基阿维菌素的质谱裂解行为研究，对供试品溶液进行分析，通过提取诊断离子寻找两个农药的降解产物，即(1)分别提取碎片离子m/z113.05971、95.04914、145.08592，设置质量偏差和保留时间偏差分别为5ppm和±0.02min，能同时产生以上三个诊断碎片的化合物被认为是阿维菌素可能的降解产物(候选降解产物)；(2)分别提取碎片离子158.11756、82.06513、126.09134，同样设置质量偏差和保留时间偏差分别为5ppm和±0.02min，能同时产生以上三个诊断碎片的化合物被认为是甲氨基阿维菌素可能的降解产物(候选降解产物)；基于Full MS/ddMS2模式对所有上述可能的降解产物(候选降解产物)进行靶向扫描，根据质谱裂解的规律，通过特征二级碎片离子信息的识别匹配进行精细结构推导；
通过液相色谱-静电场轨道阱质谱方法，对阿维菌素的降解机制进行研究，发现该农药在不同环境因素以及金银花药材种植过程中能够产生如图所示(图3)的降解产物类型，并初步鉴定降解产物23个。其中，光异构化的降解产物有1个，去甲基化的降解产物有1个，单羟基化以及双羟基化的降解产物为14个，羰基化或羟基化后脱氢的降解产物有6个，羟基化加羰基化的降解产物有1个。
上述23个所述阿维菌素的降解产物具体为：1个光异构化的降解产物，具体为8,9-Z-abamectin B1a(C48H72O14)；1个去甲基化的降解产物，具体为3”-O-desmethyl-abamectin B1a(C47H70O14)；14个单羟基化以及双羟基化的降解产物，具体为A1(C48H72O15)、A2(C48H72O15)、A3(C48H72O15)、A4(C48H72O16)、A5(C48H72O15)、A6(C48H72O15)、A7(C48H72O15)、A8(C48H72O15)、A9(C48H72O16)、A10(C48H72O16)、A11(C48H72O16)、A12(C48H72O16)、A13(C48H72O16)、A14(C48H72O16)；6个羰基化或羟基化后脱氢的降解产物，具体为A15(C48H70O15)、A16(C48H70O15)、A17(C48H70O15)、A18(C48H70O15)、A19(C48H70O15)、A20(C48H70O15)；1个羟基化加羰基化的降解产物，具体为A21(C48H70O16)
通过液相色谱-静电场轨道阱质谱方法，对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解机制进行研究，发现该农药在不同环境因素以及金银花药材种植过程中能够产生如图所示(图4)的降解产物类型，并初步鉴定降解产物22个。其中，光异构化的降解产物有1个，去甲基化的降解产物有2个，羟基化合并去甲基化的降解产物有1个，羟基化合并甲基化的降解产物有3个，单羟基化、双羟基化以及三羟基化的降解产物为6个，羰基化或羟基化后脱氢的降解产物有4个，其他类型降解产物有4个，另外还发现了1个阿维菌素的同分异构体。
上述22个所述甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解产物具体为：1个光异构化的降解产物，具体为8,9-Z-emamectin(C49H75NO13)；2个去甲基化的降解产物，具体为E1(C48H73NO13)、E2(C48H73NO13)；1个羟基化合并去甲基化的降解产物，具体为E3(C48H73NO14)；3个羟基化合并甲基化的降解产物，具体为E10(C50H77NO14)、E11(C50H77NO14)、E12(C50H77NO14)；6个单羟基化、双羟基化以及三羟基化的降解产物，具体为E4(C49H75NO14)、E5(C49H75NO15N)、E6(C49H75NO15N)、E7(C49H75NO15N)、E8(C49H75NO16)、E9(C49H75NO16)；4个羰基化或羟基化后脱氢的降解产物，具体为E13(C49H73NO14)、E14(C49H73NO14)、E15(C49H73NO14)、E16(C49H73NO14)；4个其他类型降解产物，具体为E17(C51H77NO14)、E18(C51H77NO15)、E19(C39H63O14N)、E20(C37H63NO11)；1个阿维菌素的同分异构体。
4.阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的半定量筛查
通过“2.2”中Full MS/ddMS2扫描模式对上述推导得到的23种阿维菌素降解产物和22种甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物进行靶向筛查，由于大部分降解产物没有标准品，故采用面积归一化法进行半定量的测定，即阿维菌素降解产物的残留量采用阿维菌素的校正因子计算，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的残留量采用甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的校正因子计算，得到半定量结果。阿维菌素降解产物及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的高分辨质谱数据库信息见下表2和表3。
表2阿维菌素降解产物的高分辨质谱数据库信息
Figure BDA0002941721890000111
Figure BDA0002941721890000121
表3甲氨基阿维菌素降解产物的高分辨质谱数据库信息
Figure BDA0002941721890000122
Figure BDA0002941721890000131
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
取田间试验所得金银花药材样品粉末，按照本发明提供的方法，将样品进行预处理，而后通过Full MS/ddMS2扫描模式对发明中推导得到的23种阿维菌素降解产物和22种甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物进行靶向筛查，通过面积归一法得到半定量结果，结果见表4。
表4金银花药材中阿维菌素的降解产物
Figure BDA0002941721890000132
实施例2
取田间试验中不同时间采摘的金银花叶子样品粉末，按照本发明提供的方法，将样品进行预处理，而后通过Full MS/ddMS2扫描模式对发明中推导得到的23种阿维菌素降解产物和22种甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物进行靶向筛查，通过面积归一法得到半定量结果，结果见表5-6，通过半定量结果可以得到阿维菌素及甲氨基阿维菌素在不同时间点的降解动态。
表5不同时间点金银花叶子阿维菌素降解产物的残留量(μg/kg)
Figure BDA0002941721890000133
Figure BDA0002941721890000141
表6不同时间点金银花叶子甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的残留量(μg/kg)
Figure BDA0002941721890000142
实施例3
取田间试验中不同时间取得的金银花土壤样品粉末，按照本发明提供的方法，将样品进行预处理，而后通过Full MS/ddMS2扫描模式对发明中推导得到的23种阿维菌素降解产物和22种甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物进行靶向筛查，通过面积归一法得到半定量结果，结果见表7-8，通过半定量结果可以得到阿维菌素及甲氨基阿维菌素在不同时间点的降解动态。
表7不同时间点金银花土壤阿维菌素降解产物的残留量(μg/kg)
Figure BDA0002941721890000151
表8不同时间点金银花土壤阿维菌素苯甲酸盐降解产物的残留量(μg/kg)
Figure BDA0002941721890000152
上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种筛查金银花及其栽种土壤中阿维菌素及甲氨基阿维菌素苯甲酸盐降解产物的方法，采用超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱检测，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，分别将金银花和土壤进行前处理，得到供试品溶液；
步骤二，采用超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱，在Full MS / vDIA非靶向扫描模式下对阿维菌素对照品和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对照品的二级质谱数据进行分析，同时采用Mass Frontier软件辅助推导理论裂解碎片；通过提取所述理论裂解碎片的诊断离子m/z寻找所述供试品溶液中的阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的候选降解产物；
步骤三，基于Full MS / ddMS2模式对所有所述候选降解产物进行靶向扫描，根据质谱裂解的规律，通过特征二级碎片离子信息的识别匹配进行精细结构推导；通过液相色谱-静电场轨道阱质谱方法，分别对所述阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解机制进行研究，初步鉴定了所述阿维菌素的降解产物23个、所述甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解产物22个；
23个所述阿维菌素的降解产物具体为：1个光异构化的降解产物；1个去甲基化的降解产物；14个单羟基化以及双羟基化的降解产物；6个羰基化或羟基化后脱氢的降解产物；1个羟基化加羰基化的降解产物；
所述阿维菌素的理论裂解碎片具体为：含亚结构片段Ⅰ和Ⅱ的诊断离子m/z 567.3316([C34H47O7]+)、仅含亚结构片段Ⅱ的诊断离子m/z 305.2111 ([C19H29O3]+)、亚结构片段Ⅲ进一步裂解得到的碎片离子m/z 145.0859 ([C7H13O3]+)、m/z 113.0597 ([C6H9O2]+) 和m/z95.04914 ([C6H7O3]+)；
22个所述甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的降解产物具体为：1个光异构化的降解产物；2个去甲基化的降解产物；1个羟基化合并去甲基化的降解产物；3个羟基化合并甲基化的降解产物；6个单羟基化、双羟基化以及三羟基化的降解产物；4个羰基化或羟基化后脱氢的降解产物；4个其他类型降解产物；1个阿维菌素的同分异构体；
所述甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的理论裂解碎片具体为：含亚结构片段c的诊断离子m/z302.1962 ([C15H28O5N]+)，以及由亚结构片段c进一步裂解得到的离子m/z 270.1700([C14H27O4N]+)、m/z /158.1176 ([C8H16O2N]+) 和m/z 126.0913 ([C7H12ON]+)；
质谱条件为：离子源 电喷雾，正离子扫描模式ESI（＋）；监测方式 Full MS / vDIA模式、Full MS / ddMS2模式；电喷雾电压 3.5kV；毛细管温度 256℃；S-lens RF level55.0；鞘气 48；辅助气 11；吹扫气 2；辅助气温度 413℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-四极杆/高分辨质谱检测中，超高效液相色谱条件为：色谱柱 C18，3.0×150mm，2.7μm ；流动相A为 0.01～0.5%甲酸+1～20 mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B为0.01～0.5%甲酸+1～20 mmol/L甲酸铵甲醇溶液；柱温 30℃～50℃；流速为0.1～0.6 ml/min；进样量1～20μL；梯度洗脱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
时间(分钟) 流动相A(%) 流动相B(%)
0 ～1 95 5
1～4 95→40 5→60
4～8 40→36 60→64
8～8.5 36→32 64→68
8.5～9 32→25 68→75
9～16 25→5 75→95
16～22 5 95
22～22.1 5→95 95→5
22.1～28 95 95。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金银花包括金银花药材和金银花叶子，其前处理步骤为：精密称取所述金银花药材或金银花叶子的粉末，加入0.01%～0.2%冰醋酸水溶液浸润后，加入乙腈与氘代莠去津内标溶液，混匀，加入无水硫酸镁和醋酸钠混合粉末，振摇提取，离心后取上清液至分散固相萃取净化管净化，取净化液，浓缩定容，摇匀，滤过，即得。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述土壤的前处理步骤为：精密称取精密称取土壤供试品，加入丙酮和氘代莠去津内标溶液，振摇提取，重复2～4次，合并并浓缩提取液，用乙腈定容，摇匀，滤过，即得。
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