CN113024668A

CN113024668A - 一种duf642蛋白单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN113024668A
Application number: CN202110228003.0A
Authority: CN
Inventors: 张颖; 刘锐涛; 刘崇怀; 樊秀彩; 姜建福; 孙磊
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2041-03-02
Also published as: CN113024668B

Abstract

本发明提供了一种DUF6425蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明的DUF6425的单克隆抗体，对DUF6425蛋白具有高亲和力和高特异性，能广泛地用于DUF6425检测上，特别可用于检测市售各品种葡萄中DUF6425蛋白的表达情况。此外，本发明的单克隆抗体提供了一个靶向蛋白研究的工具，使得对不同败育品种葡萄中DUF6425蛋白的表达与最终葡萄有无核的形成之间的调控关系能够有效地研究。

Description

一种DUF642蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体与应用，特别是涉及针对细胞壁合成相关蛋白DUF642单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞系以及该抗体的应用。

背景技术

细胞壁DUF642蛋白家族，是植物中高度保守的可能与果胶结构修饰相关的蛋白。DUF642蛋白家族能够参与植物细胞壁理化上的修饰、发育或环境信号的响应。其在植物生长发育中发挥作用同时又在植物逆境时响应胁迫,例如干旱、盐、酸铝下起着重要作用。

根据之前的研究发现，在葡萄种子发育过程中，DUF642基因的表达与最终是否形成可繁育的种子之间具有明确的调控关系，即DUF642基因的表达与否，决定了葡萄的败育现象。目前市场中，大量出售的葡萄品种中，一部分是自然选育出来的天然败育品种，一部分是经过人工诱导的无核品种。

目前市面上并没有专门针对葡萄DUF642基因的抗体，因此在蛋白检测层面上，对于该研究领域缺乏有效的抗体工具，用于葡萄败育的基础研究，以及市售无核品种的葡萄在蛋白层面的检测。

发明内容

本发明的目的是提供能与DUF6425蛋白专一结合的单克隆抗体，以解决现有技术存在的上述缺陷，本发明通过提供一个靶向蛋白研究的工具，使得对市售的不同品种葡萄中的DUF642蛋白的表达变化及蛋白网络图谱可以实现更深层次研究。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明通过合成表达DUF6425的全长重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和ELISA法，得到能够产出高亲和性和高特异性的单克隆抗体的细胞株，及由该细胞株分泌的单克隆抗体，并经免疫酶联，蛋白印记，免疫共沉淀加质谱和抗体芯片检测等验证，确定最有效抗体。

本发明获得的单克隆抗体具有如下结构：所述DUF6425单克隆抗体的重链可变区的CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，重链可变区的CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，重链可变区的CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；轻链可变区的CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区的CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明还提供了所述单克隆抗体在制备检测DUF6425蛋白的试剂盒中的应用。

优选地，所述试剂盒为检测DUF6425蛋白的ELISA试剂盒，所述试剂盒是所述单克隆抗体作为包被抗体。

本发明还提供一种葡萄败育相关蛋白，所述蛋白由DUF6425基因表达。本发明通过大量实验研究发现，DUF6425蛋白的表达水平在葡萄的无核品种与有核品种中有显著差异，且，在经过败育处理的有核品种葡萄中，DUF6425蛋白的表达水平显著提高。因此，表明该蛋白的表达与败育品种具有密切联系，可通过调节该蛋白的表达水平实现葡萄有无核形成之间的调控。

本发明还提供了所述的DUF6425蛋白的单克隆抗体在制备检测葡萄有无核形成的试剂盒中的应用。由于DUF6425蛋白能作为区别葡萄的无核品种与有核品种，因此，本发明的单克隆抗体也能用于检测无核品种与有核品种中的DUF6425蛋白。

本发明还提供了所述的DUF6425蛋白的单克隆抗体在制备检测葡萄败育的试剂盒中的应用。由于DUF6425蛋白的表达与败育现象具有密切联系，因此，本发明的单克隆抗体也能用于检测葡萄是否出现败育现象。

进一步地，所述DUF6425蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了所述DUF6425蛋白在制备检测葡萄有无核形成的试剂盒中的应用。

本发明还提供了所述DUF6425蛋白在制备检测葡萄败育的试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明的DUF642的单克隆抗体，对DUF642蛋白具有高亲和力和高特异性，能广泛地用于DUF642蛋白的检测，特别可用于检测市售各品种葡萄中DUF642蛋白的表达情况；此外，本发明还提供了一个靶向蛋白研究的工具，使得对不同败育品种葡萄中DUF642蛋白的表达与最终葡萄有无核的形成之间的调控关系能够有效地研究。

附图说明

图1为克隆号1L3抗体的ELISA检测曲线图；

图2为Anti-DUF642抗体通过Western Blot方法检测有核品种葡萄(玫瑰香)和无核品种葡萄(无核白)中的DUF642的表达量结果示意图；

图3为Anti-DUF642抗体通过Western Blot方法检测有核品种葡萄(醉金香)进行无核化处理中的DUF642的表达量结果示意图；

图4为Anti-DUF642抗体通过Western Blot方法检测有核品种葡萄(玫瑰香)和无核品种葡萄(无核白)在果实发育的3个时期中的DUF642的表达量结果示意图；

图5为Anti-DUF642抗体通过Western Blot方法检测有核品种葡萄(玫瑰香)和无核品种葡萄(无核白)在果实发育的3个时期中的DUF642的表达量量化分析图示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1杂交瘤细胞系的建立以及抗体的制备

一、实验材料

1.1抗原的制备：

通过克隆DUF642的全长基因，重组表达DUF642的全长蛋白，以其作为免疫原对小鼠进行免疫制备单克隆抗体，其氨基酸序列如下：MRAVAFLLLLLCATCHIALS FTDGLLPNGNFELGPKPSDM KGTEVIGPHA IPEWETSGFI EYIKAGQKQG DMLLVVPEGA FAVRLGNEAS IKQRVKVIKGMYYSITFSAA RTCAQEERLN ISVAPDWGVL PMQTLYSSNG WDSYAWAFQA DYDVIEIVIH NPGVEEDPACGPLIDSVAFR ALYPPRPSSK NLLKNGGFEE GPYVFPNTSW GVLIPPNIED DHSPLPGWMV ESLKAVKYIDSDHFSVPQEK RAVELVAGKE SAIAQVARTI PGKTYALSFS VGDASNSCEG SMVVEAFAGR DTIKVPYESKGKGGFKRAVL RFVAVSNRTR IMFLSTFYTM RSDDYASLCG PVLDDVKLLS LRTPPRHI(SEQ ID NO:1)。

1.2免疫小鼠：

将抗原免疫3只Balb/c小鼠(8-12周龄)，并监测其血清效价以决定最优的免疫次数。优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原的高亲和力的抗体(IgG亚型)。初次免疫后会经过3到4次的加强免疫，加强后取小鼠血清检测滴度(DUF642的重组蛋白作为抗原包被)。滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强，至滴度最高后融合。

1.3血清检测和筛选：

免疫小鼠眼眶取血，采用ELISA检测血清滴度(DUF642的重组蛋白作为抗原包被)。血清效价需大于10K，否则继续加强免疫。

1.4融合及筛选：

按常规方法取小鼠的全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合。工艺为优化过的PEG融合。将融合细胞铺到4块384孔板上(每孔细胞10²到10⁴)，进行培养。收集所有孔的上清，采用ELISA法对重组蛋白检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养。生长几天后，收集所有孔的上清用ELISA检测与可溶片段检测原的反应。阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合，以进行亲和力排序。每个免疫原亲和力最高的60个亲代克隆进入亚克隆。

1.5亚克隆及筛选

通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞。细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部。ELISA检测每个孔上清针对检测原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆。重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，此时得到单克隆细胞株(将其称之为1L3)。经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备。

1.6抗体上清制备和纯化

选择Balb/c小鼠接种最终获得的单克隆细胞株，每只小鼠1×10⁶～2×10⁶个。待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用采集腹水。将腹水离心，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用抗体纯化(ProteinA/G法)进行纯化，得到抗DUF642蛋白的单克隆抗体(将获得的DUF642蛋白单克隆抗体称之为单克隆抗体1L3)，本发明获得的单克隆抗体的氨基酸序列。

实施例2抗DUF642单克隆抗体的验证

对获得的单克隆抗体1L3细胞株进行免疫酶联，蛋白印记，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。

2.1抗体与重组蛋白的ELISA(免疫酶联)验证

取单克隆细胞株1L3产生的小鼠腹水抗体包被96孔ELISA板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，PBS洗涤，4℃保存待用。抗原多肽孵育，PBS洗涤，同时设置对照。HRP标记检测抗体，加入到孵育有前述的ELISA板中。TMB显色反应，酶标仪读数。抗体效价如表1所示：

表1：抗体ELISA检测数据

2.2抗体的内源蛋白印记(WB)验证

使用葡萄有核品种(玫瑰香)和无核品种(无核白)的全蛋白裂解液，抗体稀释浓度1:1000进行WB验证。实验结果如图2所示，anti-DUF642(DUF642单克隆抗体)在WB验证中，可以特异性的识别靶蛋白DUF642，产生KD条带，与预期大小相符。同时，也表明靶蛋白DUF642仅在无核品种(无核白)中表达，而在葡萄有核品种(玫瑰香)不表达，说明DUF642蛋白在无核品种中具有一定的特异性，因此，可将蛋白DUF642作为葡萄无核品种区别于有核品种的分子标签。

实施例3

将1L3克隆号anti-DUF642抗体的杂交瘤细胞株进行培养并提取总RNA，将mRNA反转录成第一链cDNA；通过PCR扩增重链及轻链基因并将扩增基因克隆至测序载体，进行多个阳性克隆测序得到最终序列结果。

应用例1DUF642的单克隆抗体在葡萄不同阶段无核化处理检测中的应用

选取有核品种(醉金香)葡萄果实发育的4个阶段，分别进行了无核化处理(即败育处理，经无核化处理后的葡萄会产生败育现象，无法结成种子)，以未处理作为相应对照，通过Western blot实验检测到无核化处理之后DUF642的表达量的变化，结果如图3所示，与未处理的对照组相比，经无核化处理的醉金香的DUF642蛋白表达量明显增加。

本发明的抗体对DUF642具有独特的特异性，可作为专门检测葡萄果实是否经过败育处理，以及不同发育时期的检测抗体，。

应用例2DUF642的单克隆抗体在葡萄果实不同阶段发育检测中的应用

选取葡萄有核品种(玫瑰香)和无核品种(无核白)果实发育的3个阶段，通过Western blot实验检测到DUF642在不同发育阶段时期有核与无核品种中的表达量的变化，由如图4、5可以看出，与有核品种相比，DUF642在整个无核品种中的表达量均高于有核品种；在无核品种中，果实发育Ⅲ期，DUF642表达量最高，提示可通过检测DUF642的蛋白含量来判断无核葡萄果实发育的阶段。

综上，由于DUF642蛋白的表达量在无核品种高表达，在有核品种中低表达，可作为葡萄无核品种的分子标签；同时，有核品种经败育处理后，DUF642蛋白的表达量显著增加，因此，DUF642蛋白的表达量的前后变化也可作为预判葡萄是否产生败育现象的依据。本发明研制的针对DUF642蛋白的单克隆抗体与DUF642蛋白有高度的亲和性和特异性，能检测出葡萄中的DUF642蛋白，因此，能很好的应用于检测DUF642蛋白的含量。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 一种DUF642蛋白单克隆抗体及其应用

<130> 2.20

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 368

<212> PRT

<213> 葡萄

<400> 1

Met Arg Ala Val Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ala Thr Cys His

1 5 10 15

Ile Ala Leu Ser Phe Thr Asp Gly Leu Leu Pro Asn Gly Asn Phe Glu

20 25 30

Leu Gly Pro Lys Pro Ser Asp Met Lys Gly Thr Glu Val Ile Gly Pro

35 40 45

His Ala Ile Pro Glu Trp Glu Thr Ser Gly Phe Ile Glu Tyr Ile Lys

50 55 60

Ala Gly Gln Lys Gln Gly Asp Met Leu Leu Val Val Pro Glu Gly Ala

65 70 75 80

Phe Ala Val Arg Leu Gly Asn Glu Ala Ser Ile Lys Gln Arg Val Lys

85 90 95

Val Ile Lys Gly Met Tyr Tyr Ser Ile Thr Phe Ser Ala Ala Arg Thr

100 105 110

Cys Ala Gln Glu Glu Arg Leu Asn Ile Ser Val Ala Pro Asp Trp Gly

115 120 125

Val Leu Pro Met Gln Thr Leu Tyr Ser Ser Asn Gly Trp Asp Ser Tyr

130 135 140

Ala Trp Ala Phe Gln Ala Asp Tyr Asp Val Ile Glu Ile Val Ile His

145 150 155 160

Asn Pro Gly Val Glu Glu Asp Pro Ala Cys Gly Pro Leu Ile Asp Ser

165 170 175

Val Ala Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Pro Arg Pro Ser Ser Lys Asn Leu

180 185 190

Leu Lys Asn Gly Gly Phe Glu Glu Gly Pro Tyr Val Phe Pro Asn Thr

195 200 205

Ser Trp Gly Val Leu Ile Pro Pro Asn Ile Glu Asp Asp His Ser Pro

210 215 220

Leu Pro Gly Trp Met Val Glu Ser Leu Lys Ala Val Lys Tyr Ile Asp

225 230 235 240

Ser Asp His Phe Ser Val Pro Gln Glu Lys Arg Ala Val Glu Leu Val

245 250 255

Ala Gly Lys Glu Ser Ala Ile Ala Gln Val Ala Arg Thr Ile Pro Gly

260 265 270

Lys Thr Tyr Ala Leu Ser Phe Ser Val Gly Asp Ala Ser Asn Ser Cys

275 280 285

Glu Gly Ser Met Val Val Glu Ala Phe Ala Gly Arg Asp Thr Ile Lys

290 295 300

Val Pro Tyr Glu Ser Lys Gly Lys Gly Gly Phe Lys Arg Ala Val Leu

305 310 315 320

Arg Phe Val Ala Val Ser Asn Arg Thr Arg Ile Met Phe Leu Ser Thr

325 330 335

Phe Tyr Thr Met Arg Ser Asp Asp Tyr Ala Ser Leu Cys Gly Pro Val

340 345 350

Leu Asp Asp Val Lys Leu Leu Ser Leu Arg Thr Pro Pro Arg His Ile

355 360 365

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 合成

<400> 2

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 合成

<400> 3

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 合成

<400> 4

Ala Thr Gly Gly Asp Tyr

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 合成

<400> 5

Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 合成

<400> 6

Leu Met Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 合成

<400> 7

Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Leu Thr

1 5

Claims

1.一种DUF6425蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗包括轻链和重链，所述重链可变区的CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，重链可变区的CDR2氨基酸序列如SEQID NO:3所示，重链可变区的CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；轻链可变区的CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区的CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测DUF6425蛋白的试剂盒中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为检测DUF6425蛋白的ELISA试剂盒，所述试剂盒是所述单克隆抗体作为包被抗体。

4.如权利要求1所述的DUF6425蛋白的单克隆抗体在制备检测葡萄有无核形成的试剂盒中的应用。

5.如权利要求1所述的DUF6425蛋白的单克隆抗体在制备检测葡萄败育的试剂盒中的应用。

6.一种葡萄败育相关蛋白，其特征在于，所述蛋白由DUF6425基因表达。

7.如权利要求6所述的葡萄败育相关蛋白，其特征在于，所述DUF6425蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

8.如权利要求6或7所述的DUF6425蛋白在制备检测葡萄有无核形成的试剂盒中的应用。

9.如权利要求6或7所述的所述DUF6425蛋白在制备检测葡萄败育的试剂盒中的应用。