CN113018446A - Bcl-2/Bcl-xL抑制剂与化疗药物的组合及其应用 - Google Patents

Bcl-2/Bcl-xL抑制剂与化疗药物的组合及其应用 Download PDF

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CN113018446A CN202110280833.8A CN202110280833A CN113018446A CN 113018446 A CN113018446 A CN 113018446A CN 202110280833 A CN202110280833 A CN 202110280833A CN 113018446 A CN113018446 A CN 113018446A
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Abstract

本发明提供一种药物组合物，包含Bcl‑2/Bcl‑xL抑制剂和化疗药物，以及药学上可接受的载体。本发明还提供治疗癌症的方法，该方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的Bcl‑2/Bcl‑xL抑制剂和治疗有效量的化疗药物。本发明还提供Bcl‑2/Bcl‑xL抑制剂和化疗药物的组合在制备抗癌药物中的用途。本发明中，通过Bcl‑2/Bcl‑xL抑制剂与化疗药物的联合施用，可以获得显著增强的抗癌作用。

Description

Bcl-2/Bcl-xL抑制剂与化疗药物的组合及其应用
本申请是申请号为201910700341.2、申请日为2019年7月31日、发明名称为“Bcl-2/Bcl-xL抑制剂与化疗药物的组合及其应用”的中国发明专利申请的分案申请，该申请分别要求申请日为2018年7月31日、申请号为201810914839.4的中国申请，申请日为2019年2月12日、申请号为PCT/CN2019/074862的国际申请，申请日为2019年7月4日、申请号为201910598720.5的中国申请，和申请日为2019年7月22日、申请号为201910662265.0中国申请的优先权。
技术领域
本发明涉及一种药物组合物及其在治疗癌症中的应用，以及治疗癌症的方法，所述药物组合物包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物。
背景技术
细胞凋亡是机体清除异常或不需要的细胞的自然途径，若其受到影响则可能导致各种疾病如癌症的发生。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的重要调节剂。该蛋白家族包括抗细胞凋亡的蛋白，例如Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1；和促细胞凋亡的分子，包括Bid、Bim、Bad、Bak和Bax。尽管正常细胞具有低表达水平的抗细胞凋亡的Bcl-2和Bcl-xL蛋白，但发现这些蛋白在许多不同类型的人类肿瘤中高度过表达，被认为可能与肿瘤的产生、发展及耐药性产生有关。目前已寻求将靶向Bcl-2和/或Bcl-xL作为癌症治疗策略。
第一代Bcl-2/Bcl-xL抑制剂ABT-737和ABT-263是由美国雅培制药开发的小分子Bcl-2抑制剂。已经报道ABT-737和ABT-263以高亲和力结合Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w(Ki<1nM)和具有比Mcl-1和A1(两种其它的抗细胞凋亡的Bcl-2蛋白)高的特异性。另外，WO2014/113413A1中已经公开第二代Bcl-2/Bcl-xL抑制剂，其可结合Bcl-2和/或Bcl-xL，Ki值<10nM，和在无细胞功能测定法中作为Bcl-2和Bcl-xL的有效的拮抗剂起作用。
在癌症的治疗中有时采用抗癌药物的联合治疗。本领域仍然需要抗癌活性高且副作用低的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂与其他抗癌剂的组合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有显著的抗癌作用的药物组合物、治疗癌症的方法、以及上述药物组合物的用途。
根据本发明的第一方面，提供一种药物组合物，其特征在于，包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物、以及药学上可接受的载体。所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂为下述通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物或其药学上可接受的盐：
(I)
Figure BDA0002978293850000021
(II)
Figure BDA0002978293850000022
Figure BDA0002978293850000023
(IV)
Figure BDA0002978293850000031
其中A环是
Figure BDA0002978293850000032
取代或未取代的X选自亚烷基、亚烯基、环亚烷基、环亚烯基和杂环亚烷基；
Y选自(CH2)n-N(Ra)2和
Figure BDA0002978293850000033
Q选自O、O(CH2)1-3、NRc、NRc(C1-3亚烷基)、OC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)O、C(＝O)O(C1-3亚烷基)、NHC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)NH和C(＝O)NH(C1-3亚烷基)；
Z是O或NRc；
R1和R2独立选自H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、SR'、NR'R”、COR'、CO2R'、OCOR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、NR'COR”、NR'CONR”R”'、NR'C＝SNR”R”'、NR'SO2R”、SO2R'和SO2NR'R”；
R3选自H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、NR'R”、OCOR'、CO2R'、COR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、C1-3亚烷基CH(OH)CH2OH、SO2R'和SO2NR'R”；
R'、R”和R”'独立地为H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、C1-3亚烷基杂环烷基或杂环烷基；
R'和R”或R”和R”'可与它们所连接的原子一起形成3-7元环；
R4是氢、卤素、C1-3烷基、CF3或CN；
R5是氢、卤素、C1-3烷基、取代的C1-3烷基、羟基烷基、烷氧基或取代的烷氧基；
R6选自H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、SR'、NR'R”、CO2R'、OCOR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、NR'COR”、NR'CONR”R”'、NR'C＝SNR”R”'、NR'SO2R”、SO2R'和SO2NR'R”；
取代或未取代的R7选自氢、烷基、烯基、(CH2)0-3环烷基、(CH2)0-3环烯基、(CH2)0-3杂环烷基、(CH2)0-3芳基,和(CH2)0-3杂芳基；
R8选自氢、卤素、NO2、CN、CF3SO2,和CF3；
Ra选自氢、烷基、杂烷基、烯基、羟基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、环烯基和杂环烷基；
Rb是氢或烷基；
Rc选自氢、烷基、取代的烷基、羟基烷基、烷氧基和取代的烷氧基；和
n、r和s独立地为1、2、3、4、5或6；
R21是SO2R2'；
R22是烷基，优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基；
R23是烷基，优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基；
R24是卤素，优选氟、氯；
R25是卤素，优选氟、氯；
R26选自H、卤素和烷基，优选氟、氯、C1-4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
R21b是H或烷基,优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基；
n2,r2和s2独立地是1、2、3、4、5或6，更优选r2和s2均是2且n2是3、4或5,更优选n2、r2和s2均是2；和
R2'是烷基,优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基。
上述通式(I)、(II)或(III)的化合物已经在WO2014/113413A1中披露，该专利文献说明书的全部内容以引用的方式并入本文。上述通式(IV)在PCT/CN2019/070508中披露，该专利文献说明书的全部内容以引用的方式并入本文。
根据本发明的第二方面，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和治疗有效量的化疗药物。
根据本发明的第三方面，提供Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本发明的药物组合物具有优异的抗癌效果，具体而言，本发明的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物的组合的抗癌效果优于单独使用所述各组分的治疗效果的总和，也就是说，本发明的药物组合物获得了优异的协同效果。
附图说明
图1表示化合物15(即下述表1中记载的化合物15)和多西他赛联合用药在MDA-MB-231三阴乳腺癌肿瘤细胞系中的细胞增殖抑制作用。
图2表示化合物15和多西他赛联合用药在人源MDA-MB-231细胞系乳腺癌小鼠异种移植瘤模型中的抗癌作用。
图3表示化合物15和多西他赛联合用药在人源NCI-H146细胞系小细胞肺癌小鼠异种移植瘤模型中的抗癌作用。
图4表示化合物15和多西他赛联合用药在人源PC3细胞系前列腺癌小鼠异种移植瘤模型中的抗癌作用。
图5表示化合物15和多西他赛联合用药在人源MGC80-3细胞系胃癌小鼠异种移植瘤模型中的抗癌作用。
图6表示化合物15和多西他赛或顺铂联合用药在人源MGC80-3细胞系胃癌小鼠异种移植瘤模型中的抗癌作用。
图7表示化合物15和伊立替康联合用药在人源SW620细胞系结肠癌小鼠异种移植瘤模型中的抗癌作用。
图8表示化合物15和紫杉醇(图8(a))和伊立替康(图8(b))在皮下LU5250 SCLCPDX模型中的联合治疗。
图9表示化合物15和紫杉醇(图9(a))和伊立替康(图9(b))在皮下LU5188 SCLCPDX模型中的联合治疗。
图10表示LU5250模型小鼠在给予下列联合用药组合后的体重变化：化合物15+紫杉醇(图10(a))；化合物15+伊立替康(图10(b))。
图11表示LU5188模型小鼠在给予下列联合用药组合后的体重变化：化合物15+紫杉醇(图11(a))；化合物15+伊立替康(图11(b))。
图12表示化合物15和紫杉醇(图12(a))、化合物15和伊立替康(图12(b))、化合物15和顺铂(图12(c))在皮下NCI-H146人体小细胞肺癌模型中的联合治疗效果。
图13表示在小鼠接受皮下NCI-H146人体小细胞肺癌得到的模型中，给予化合物15与紫杉醇(图13(a))、化合物15与伊立替康(图13(b))、化合物15与顺铂(图13(c))联合治疗后的平均体重变化结果。
图14表示化合物31与紫杉醇组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146(图14(a))、NCI-H69(图14(b))、NCI-H446(图14(c))中的抗增殖效果。
图15表示化合物31与拓扑替康组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146(图15(a))、NCI-H69(图15(b))、NCI-H446(图15(c))中的抗增殖效果。
图16表示化合物31与顺铂组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146(图16(a))、NCI-H69(图16(b))中的抗增殖效果。
图17表示化合物31与伊立替康组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146(图17(a))、NCI-H69(图17(b))中的抗增殖效果。
图18表示化合物31与依托泊苷组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146(图18(a))、NCI-H69(图18(b))中的抗增殖效果。
图19表示化合物31与紫杉醇组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146中的半胱天冬酶3/7的活性增强程度。
图20表示化合物31与拓扑替康组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H446中的半胱天冬酶3/7的活性增强程度。
图21表示化合物31与依托泊苷结组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146(图21(a))、NCI-H69(图21(b))中的半胱天冬酶3/7的活性增强程度。
图22表示化合物31与伊立替康组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146(图22(a))、NCI-H69(图22(b))中的半胱天冬酶3/7的活性增强程度。
图23表示化合物31与顺铂组合在人体小细胞肺癌细胞系NCI-H146(图23(a))、NCI-H69(图23(b))中的半胱天冬酶3/7的活性增强程度。
图24表示化合物15和顺铂(图24(a))或多西他赛(图24(b))在皮下NCI-H1975-L858R-T790M-C797S非小细胞肺癌(NSCLC)异种移植模型中的联合治疗。
图25表示AGS和NCI-N87两种胃癌细胞株中Bcl-2家族蛋白的基础表达水平。
图26表示化合物31在AGS(图26(a))和NCI-N87(图26(b))两种细胞株中的细胞增殖抑制作用。
图27表示化合物31对细胞周期无明显影响。
图28表示化合物15在不同浓度下对小鼠移植瘤体积(图28(a))、肿瘤重量(图28(b))、肿瘤大小(图28(c))、小鼠体重(图28(d))、小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白(图28(e))、小鼠肿瘤组织中凋亡相关免疫组化(图28(f))的影响。
图29(a)表示化合物31与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合诱导胃癌细胞发生凋亡；图29(b)表示化合物31与5-FU联合对胃癌细胞凋亡相关蛋白的影响。
图30表示化合物15与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合对小鼠移植瘤体积(图30(a))、肿瘤重量(图30(b))、肿瘤大小(图30(c))、小鼠体重(图30(d))、小鼠肿瘤组织中TUNEL检测情况(图30(e))、小鼠肿瘤组织中凋亡相关免疫组化(图30(f))的影响。
图31表示化合物31和多西他赛(TXT)联合用药在NCI-N87胃癌肿瘤细胞系中的细胞增殖抑制作用。
图32表示化合物31和帕比司他(panobinostat)联合用药在HGC-27胃癌肿瘤细胞系中的细胞增殖抑制作用。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明进行说明。应理解，本发明不限于以下的实施方式。只要是在不脱离本发明主旨的范围内，本领域的技术人员可进行适当的变更或改良，这些变更或改良也包含在本发明的范围内。
药物组合物
根据本发明的第一方面，提供一种药物组合物，其特征在于，包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物、以及药学上可接受的载体。所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂为下述通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物或其药学上可接受的盐：
(I)
Figure BDA0002978293850000071
(II)
Figure BDA0002978293850000072
Figure BDA0002978293850000073
(IV)
Figure BDA0002978293850000081
其中A环是
Figure BDA0002978293850000082
取代或未取代的X选自亚烷基、亚烯基、环亚烷基、环亚烯基和杂环亚烷基；
Y选自(CH2)n-N(Ra)2和
Figure BDA0002978293850000083
Q选自O、O(CH2)1-3、NRc、NRc(C1-3亚烷基)、OC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)O、C(＝O)O(C1-3亚烷基)、NHC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)NH和C(＝O)NH(C1-3亚烷基)；
Z是O或NRc；
R1和R2独立地选自H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、SR'、NR'R”、COR'、CO2R'、OCOR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、NR'COR”、NR'CONR”R”'、NR'C＝SNR”R”'、NR'SO2R”、SO2R'和SO2NR'R”；
R3选自H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、NR'R”、OCOR'、CO2R'、COR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、C1-3亚烷基CH(OH)CH2OH、SO2R'和SO2NR'R”；
R'、R”和R”'独立地是H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、C1-3亚烷基杂环烷基或杂环烷基；
R'和R”或R”和R”'可与它们所连接的原子一起形成3-7元环；
R4是氢、卤素、C1-3烷基、CF3或CN；
R5是氢、卤素、C1-3烷基、取代的C1-3烷基、羟基烷基、烷氧基或取代的烷氧基；
R6选自H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、SR'、NR'R”、CO2R'、OCOR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、NR'COR”、NR'CONR”R”'、NR'C＝SNR”R”'、NR'SO2R”、SO2R'和SO2NR'R”；
取代或未取代的R7选自氢、烷基、烯基、(CH2)0-3环烷基、(CH2)0-3环烯基、(CH2)0-3杂环烷基、(CH2)0-3芳基和(CH2)0-3杂芳基；
R8选自氢、卤素、NO2、CN、CF3SO2和CF3；
Ra选自氢、烷基、杂烷基、烯基、羟基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、环烯基和杂环烷基；
Rb是氢或烷基；
Rc选自氢、烷基、取代的烷基、羟基烷基、烷氧基和取代的烷氧基；
n、r和s独立地是1、2、3、4、5或6；
R21是SO2R2'；
R22是烷基，优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基；
R23是烷基，优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基；
R24是卤素，优选氟、氯；
R25是卤素，优选氟、氯；
R26选自H、卤素和烷基，优选氟、氯、C1-4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
R21b是H或烷基,优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基；
n2,r2和s2独立地是1、2、3、4、5或6，,更优选r2和s2均是2且n2是3、4或5,更优选n2、r2和s2均是2；和
R2'是烷基,优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基。
Bcl-2/Bcl-xL抑制剂
本文所用的术语"Bcl-2/Bcl-xL"意指Bcl-2、Bcl-xL、或Bcl-2和Bcl-xL，即Bcl-2和/或Bcl-xL。
本文所用的术语"烷基"是指直链或支链的饱和C1-10烃基、优选为C1-6烃基，其非限制性实例包括甲基、乙基、以及直链或支链的丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。术语Cn意指具有"n"个碳原子。术语Cn-p意指包含"n"至"p"个碳原子。
术语"亚烷基"是指具有通式-(CH2)n-的二价烷基，其中n为1至10的整数。烷基例如甲基，或亚烷基例如-CH2-可以是未取代的、或被例如卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、烷基氨基或氨基取代。
术语"烯基"与"烷基"相同定义，除了含有碳-碳双键，例如乙烯基、丙烯基和丁烯基。术语"亚烯基"与"亚烷基"相同定义，除了含有碳-碳双键。术语"炔基"和"亚炔基"与"烷基"和"亚烷基"相同定义，除了所述基团含有碳-碳三键。
本文所用的术语"卤素"定义为氟、氯、溴和碘。
术语"羟基"定义为-OH。
术语"烷氧基"定义为-OR，其中R是烷基。
术语"氨基"定义为-NH2和术语"烷基氨基"定义为-NR2，其中至少一个R是烷基和另一个R是烷基或氢。
术语"硝基"定义为-NO2。
术语"氰基"定义为-CN。
术语"三氟甲基"定义为-CF3。
术语"三氟甲氧基"定义为-OCF3。
本文所用的基团例如
Figure BDA0002978293850000101
是
Figure BDA0002978293850000102
的缩写。
本文所用的术语"芳基"是指单环或多环的芳族基团，优选单环或二环的芳族基团，例如苯基或萘基。除非另外说明，芳基可以是未取代的或被一个或多个(并且特别是1-4个)取代基取代，所述取代基选自例如卤素、烷基、烯基、-OCF3、-CF3、-NO2、-CN、-NC、-OH、烷氧基、氨基、烷基氨基、-CO2H、-CO2烷基、-OCO烷基、芳基和杂芳基。
本文所用的术语"杂芳基"是指单环或二环的环系统，其包含一个或两个芳族环和在芳环中包含至少一个氮、氧或硫原子。除非另外说明，杂芳基可以是未取代的或被一个或多个(并且特别是1-4个)取代基取代，所述取代基选自例如卤素、烷基、烯基、-OCF3、-CF3、-NO2、-CN、-NC、-OH、烷氧基、氨基、烷基氨基、-CO2H、-CO2烷基、-OCO烷基、芳基和杂芳基。
本文所用的术语"环烷基"意指含有3-8个碳原子的单环脂肪族环。术语"杂环烷基"意指单环或二环的环系统，在环系统中含有至少一个氮、氧或硫原子。术语"杂芳基"和"杂环烷基"包括包含至少一个氧原子、氮原子或硫原子的环系统，和包括包含氧和氮原子；氧和硫原子；氮和硫原子；和氮、氧和硫原子的环系统。
上述通式(I)、(II)或(III)中，在一些实施方式中，R1和R2或R2和R3可一起形成环。在其它实施方式中，R'和R"或R"和R”'可与它们所连接的原子一起形成3-7元环。
在一些优选的实施方式中，X是亚烷基，和在优选的实施方式中，是C1-3亚烷基。
在一些实施方式中，Y是
Figure BDA0002978293850000103
在优选的实施方式中，n是2。在其它优选的实施方式中，Rb是氢或C1-3烷基。
在其它优选的实施方式中，Q是O、O(CH2)1-3、C(＝O)O(CH2)1-3、OC(＝O)(CH2)1-3或C(＝O)O(C3H7)1-3。在一些实施方式中，Q是O、OCH2、C(＝O)OCH2、C(＝O)O(CH2)2、C(＝O)O(CH2)3、OC(＝O)CH2或C(＝O)O(CH(CH3)CH2)。
在一些实施方式中，Z是O、NH或N(C1-3烷基)。在优选的实施方式中，Z是O、NH或NCH3。
在一些实施方式中，R1是SO2R'、SO2NR'R"、NR'SOR"、H或烷基。在一些优选的实施方式中，R1是SO2(C1-3烷基)、SO2N(C1-3烷基)2、NHSO2(C1-3烷基)、H或C1-3烷基。R1的一个优选的实施方式是SO2CH3。
在一些实施方式中，R2和R3独立地是H、C1-3烷基或环烷基。R2也可以是卤素。在一些优选的实施方式中，R2和R3独立地是甲基、乙基、正丙基、异丙基、环戊基或环己基。R2也可以是Cl或F。
在一些实施方式中，R4是H或卤素，优选是H、Cl或F。在其它实施方式中，R5是H、卤素或C1-3烷基，优选是H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、F或Cl。在其它实施方式中，R6是H、卤素、烷基或环烷基。在一些优选的实施方式中，R6是H、F、Cl、C1-3烷基、环戊基或环己基。
在一些实施方式中，R7是(CH2)0-3-环烷基或(CH2)0-3-杂环烷基。在优选的实施方式，R7是(CH2)0-3-环烷基，任选被-OH取代。在一个实施方式中，R7是
Figure BDA0002978293850000111
在一些实施方式中，R8是CF3SO2或CF3。在各种实施方式中，Ra、Rb和Rc独立地是H或C1-3烷基。
另外，上述具有结构式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物的盐、水合物、溶剂化物、活性代谢物也包括在本发明中，和可用于本文公开的方法。本发明还包括结构式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物的所有可能的立体异构体和几何异构体。本发明包括外消旋化合物和光学活性异构体两者。当结构式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物需要作为单一的对映体时，其可通过终产物的解析或通过自异构纯的原料或使用手性辅助试剂的立体特异性合成获得，例如参见Z.Ma等,Tetrahedron:Asymmetry,8(6),第883-888页(1997)。终产物、中间体或原料的解析可通过本领域已知的任何合适的方法实现。此外，在其中结构式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物的互变异构体是可能的情况下，本发明意欲包括所述化合物的所有互变异构体形式。
本文所用的术语"药学上可接受的盐"是指结构式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物的盐或两性离子形式。通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物的盐可在化合物的最终分离和纯化期间制备，或分别通过将所述化合物与具有合适的阳离子的酸反应制备。结构式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物的药学上可接受的盐可以是与药学上可接受的酸形成的酸加成盐。可用于形成药学上可接受的盐的酸的实例包括无机酸例如硝酸、硼酸、盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，和有机酸例如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。本发明的化合物的盐的非限制性实例包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、2-羟基乙磺酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、抗坏血酸盐、羟乙基磺酸盐、水杨酸盐、甲磺酸盐、均三甲苯磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、乙二磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。此外，本发明的化合物中存在的可用的氨基可被甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯；癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；和苄基和苯乙基溴化物季胺化。
根据前述，对本文出现的本发明的化合物的任何提及意欲包括结构式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物以及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或活性代谢物。本文所用的术语“活性代谢物”是指通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物在人体中的代谢产物。
本发明Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的具体化合物包括但不限于具有下述表1所示结构的化合物。
表1
Figure BDA0002978293850000121
Figure BDA0002978293850000131
Figure BDA0002978293850000141
Figure BDA0002978293850000151
Figure BDA0002978293850000161
Figure BDA0002978293850000171
Figure BDA0002978293850000181
Figure BDA0002978293850000191
Figure BDA0002978293850000201
Figure BDA0002978293850000211
Figure BDA0002978293850000221
Figure BDA0002978293850000231
Figure BDA0002978293850000241
Figure BDA0002978293850000251
Figure BDA0002978293850000261
Figure BDA0002978293850000271
本发明的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂优选为(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯基硫代)丁基)哌啶-4-羰基氧基)乙基膦酸(即上述表中的化合物15，有时简称为“化合物15”)或其药学上可接受的盐，如下述结构式表示：
Figure BDA0002978293850000281
化合物15以高亲和力与Bcl-2，Bcl-xL，Bcl-w蛋白选择性结合，其IC50分别为1.6nM、4.4nM、9.3nM。化合物15能与Mcl-1微弱结合。化合物15通过化学结构修饰在血液循环中有效地降低了第一代BCL-2抑制剂的血小板毒性缺陷，但是又能够在组织里获得特异酶的激活来有效地杀死肿瘤细胞。其血小板毒性减少了10-30倍，但是活性是第一代BCL-2抑制剂的10倍左右。化合物31是化合物15的活性代谢产物。化合物15是第二代新靶点BCL-2蛋白抑制剂。
本发明的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂还可以优选为(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸(即上述表中的化合物31，有时简称为“化合物31”)或其药学上可接受的盐，如下述结构式表示：
Figure BDA0002978293850000282
可以根据WO2014/113413A1中描述的方法来合成本发明药物组合物中的上述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂。
化疗药物
术语“化疗药物”是可用于治疗癌症的生物(大分子)或化学(小分子)化合物。化疗药物的种类包括但不限于：组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)、烷化剂、抗代谢剂、生物碱、细胞毒性/抗癌抗生素、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂、蛋白、抗体、激酶抑制剂等。化疗药物包括用于靶向治疗的化合物和非靶向常规化疗的化合物。
化疗药物的非限制性实例包括：厄洛替尼、阿法替尼、多西他赛、阿霉素、5-FU(5-氟尿嘧啶)、帕比司他(panobinostat)、吉西他滨、顺铂、卡铂、紫杉醇、贝伐单抗、曲妥珠单抗、培妥珠单抗、二甲双胍、替莫唑胺、他莫昔芬、多柔比星、雷怕霉素、拉帕替尼、羟基喜树碱、曲美替尼。化疗药物的更多实例还包括：奥沙利铂、硼替佐米、舒尼替尼、来曲唑、伊马替尼、PI3K抑制剂、氟维司群(fulvestrant)、亚叶酸、洛那法尼(lonafarnib)、索拉非尼、吉非替尼、克唑替尼、伊立替康、拓扑替康、戊柔比星、威罗菲尼、替比伐尼、卡培他滨、凡德他尼、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、帕尼单抗(panitumumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tositumomab)、西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、帕唑帕尼(pazopanib)、坎磷酰胺(canfosfamide)、硫替派(thiotepa)、环磷酰胺；磺酸烷基酯，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)、和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylmelamine)，包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；布拉它辛(bullatacin)和不拉它辛酮(bullatacinone)；苔藓抑素；海绵多烯酮类化合物(callystatin)；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；自念珠藻环肽(cryptophycin)(尤其是自念珠藻环肽1和自念珠藻环肽8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、环磷酰胺、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、氧化双氯乙基甲胺盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如亚硝脲氮芥(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，刺孢霉素(calicheamicin)、刺孢霉素γ1I、刺孢霉素ωI1、达内霉素(dynemicin)、达内霉素A；二磷酸盐，如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素、全反式维甲酸、安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、卡美诺霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、脱氧氟尿苷、地托比星(detorubicin)、6-二偶氮-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星、脱氧多柔比星、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(如丝裂霉素C)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，如氨甲喋呤；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤、博莱霉素、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄性激素，卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺素，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝司塔布斯(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登醇(maytansinoid)，如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0002978293850000301
多糖复合体(JHS Natural Products、Eugene、OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethane)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C")；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；长春碱；依托泊苷(etoposide)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；培美曲塞；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇(retinoid)，如视黄酸；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、和衍生物。
本发明中所用的化疗药物优选为放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、脱氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶(例如5-氟尿嘧啶)、帕比司他、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨。更优选为多西他赛、顺铂、伊立替康、阿霉素、多西他赛、顺铂、吉西他滨、伊立替康或羟基喜树碱。进一步优选为多西他赛、氟尿嘧啶(例如5-氟尿嘧啶)、帕比司他、顺铂、伊立替康、紫杉醇、拓扑替康、或依托泊苷。最优选为多西他赛、氟尿嘧啶(例如5-氟尿嘧啶)、帕比司他。
癌症治疗
本发明的药物组合物可用于治疗癌症。所述癌症包括但不限于肾上腺癌、淋巴上皮瘤、腺样细胞癌、淋巴瘤、听神经瘤、急性淋巴细胞白血病、肢端黑色素瘤、急性髓系白血病、肢端汗腺瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性嗜酸粒细胞白血病、肝癌、急性红细胞白血病、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、急性巨核细胞白血病、MALT淋巴瘤、急性单核细胞白血病、恶性纤维组织细胞瘤、急性早幼粒细胞白血病、恶性外周神经鞘瘤、套细胞淋巴瘤、腺癌、边缘区B细胞淋巴瘤、恶性海马肿瘤、腺样囊性癌、套细胞淋巴瘤、腺瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、腺瘤样牙源性肿瘤、肥大细胞白血病、腺鳞癌、纵隔生殖细胞肿瘤、脂肪组织肿瘤、乳腺髓样癌、肾上腺皮质癌、甲状腺髓样癌、成人T细胞白血病/淋巴瘤、成神经管细胞瘤、侵袭性NK细胞白血病、黑色素瘤、艾滋病相关淋巴瘤、脑膜瘤、肺泡横纹肌肉瘤、默克尔细胞癌、肺泡软组织肉瘤、间皮瘤、成釉细胞瘤、转移性尿路上皮癌、间变性大细胞淋巴瘤、混合苗勒氏肿瘤、甲状腺未分化癌、粘液性肿瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肌肉组织肿瘤、血管肉瘤、蕈样真菌病、星形细胞瘤、粘液样脂肪肉瘤、非典型畸形性横纹肌样瘤、粘液瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、粘液肉瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、鼻咽癌、B细胞淋巴瘤、神经鞘瘤、基底细胞癌、神经母细胞瘤、胆道癌、神经纤维瘤、膀胱癌、神经瘤、胚细胞瘤、结节性黑色素瘤、骨癌、眼癌、布伦纳瘤、少突细胞瘤、褐色肿瘤、少突神经胶质瘤、伯基特氏淋巴瘤、嗜酸细胞瘤乳腺癌、鞘膜脑膜瘤、脑癌、视神经肿瘤癌、口腔癌原位癌、骨肉瘤、癌肉瘤、卵巢癌、软骨肿瘤、肺上沟瘤、乳头状甲状腺癌、骨髓瘤、副神经节瘤、软骨瘤、松果体母细胞瘤、脊索瘤、松果细胞瘤、绒毛膜癌、垂体瘤、脉络丛乳头状瘤、垂体腺瘤、肾透明细胞肉瘤、垂体瘤、颅咽管瘤、浆细胞瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、多胚胎发性细胞瘤、宫颈癌、前驱体T淋巴母细胞淋巴瘤、结直肠癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、德戈斯病、原发性积液淋巴瘤、增生性小圆细胞瘤、原发性预成型腹膜癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、前列腺癌、胚胎发育不良的神经上皮肿瘤、胰腺癌、无性细胞瘤、咽癌、胚胎癌、腹膜假粘液瘤、内分泌腺肿瘤、肾细胞癌、内胚窦瘤、肾髓样癌、肠病相关的T细胞淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、食道癌、横纹肌瘤、胎中胎胎儿、横纹肌肉瘤、纤维瘤、Richter’s征转化里希特的转变、纤维肉瘤、直肠癌、滤泡性淋巴瘤、肉瘤、滤泡性甲状腺癌、神经鞘瘤病、神经节细胞瘤、精原细胞瘤、胃肠癌、支持细胞瘤、生殖细胞肿瘤、性索-性腺间质瘤、妊娠绒毛膜癌、印戒细胞癌、巨细胞成纤维细胞瘤、皮肤癌、骨巨细胞瘤、小蓝圆细胞瘤、胶质瘤、小细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、胶质瘤、生长抑素瘤、胶质瘤病大脑、煤烟尘疣、胰高血糖素瘤、脊柱肿瘤、性腺母细胞瘤、脾边缘区淋巴瘤、颗粒细胞瘤、鳞状细胞癌、雌激素瘤、滑膜肉瘤、胆囊癌、Sezary疾病、胃癌、小肠癌、毛细胞白血病、鳞状细胞癌、血管母细胞瘤、胃癌、头颈癌、T细胞淋巴瘤、血管外皮细胞瘤、睾丸癌、血液系统恶性肿瘤、肉瘤、肝母细胞瘤、甲状腺癌、肝脾T细胞淋巴瘤、移行细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、非霍奇金淋巴瘤、脐尿管癌、浸润性小叶癌、泌尿生殖系统癌、肠癌、尿路上皮癌、肾癌、葡萄膜黑色素瘤、喉癌、子宫癌、恶性雀斑样痣、疣状癌、致死性中线癌、视觉通路胶质瘤、白血病、外阴癌、睾丸间质细胞瘤、阴道癌、脂肪肉瘤、瓦尔登斯特伦的巨球蛋白血症、肺癌、腺淋巴瘤、淋巴管瘤、肾母细胞瘤、淋巴管肉瘤。
上述癌症优选为肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、乳腺癌、脑胶质瘤、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、急性淋巴细胞性白血病。更优选为乳腺癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、前列腺癌、胃癌、结肠癌。在某些实施方式中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。三阴性乳腺癌是指在癌细胞中雌激素受体、孕酮激素受体、以及HER2受体的表达都检测不到的乳腺癌。
可通过给予本发明的药物组合物治疗的其它疾病和病况(包括癌症)公开于美国专利公开号2007/0027135、美国专利号7,432,304、美国专利公开号2010/0278921、WO2012/017251A1和WO2014/113413A1，分别以其整体结合到本文中。
在某些实施方式中，所述癌症是转移性的实体瘤。
在某些实施方式中，所述癌症是Bcl-2/Bcl-xL和Bax阳性的。“Bcl-2/Bcl-xL和Bax阳性”是指其特征为Bcl-2/Bcl-xL和Bax基因扩增或Bcl-2/Bcl-xL和Bax蛋白过表达并因此具有与正常健康细胞相比异常高水平的Bcl-2/Bcl-xL和Bax基因和/或Bcl-2/Bcl-xL和Bax蛋白的癌性或恶性细胞或组织。在某些实施方式中，可以在多种类型的癌症中发生一个或多个基因突变，从而导致癌细胞产生过量的Bcl-2/Bcl-xL和Bax蛋白。
在某些实施方式中，所述患者的癌症被诊断为Bcl-2/Bcl-xL和Bax阳性。所述患者可以通过本领域公知的方法被诊断，例如通过可以核酸探针进行杂交检测的方法、通过核酸扩增的方法、通过蛋白水平的免疫检测方法等。在某些实施方式中，所述癌症是胃癌。在某些实施方式中，所述胃癌是Bcl-2/Bcl-xL和Bax阳性胃癌。Bcl-2/Bcl-xL和Bax阳性胃癌的特征在于以Bcl-2/Bcl-xL和Bax基因扩增或Bcl-2/Bcl-xL和Bax蛋白过表达为特征的癌性胃细胞。在优选的实施方式中，胃癌患者同时过表达Bcl-2/Bcl-xL和Bax，即，所述患者患有Bcl-2/Bcl-xL和Bax阳性胃癌。
在某些实施方式中，所述癌症是对EGFR抑制剂耐药的。
“表皮生长因子受体”或“EGFR”(Epidermal growth factor receptor)是一种酪氨酸激酶的细胞表面受体。EGFR为生长促进致癌基因erbB或ErbB1的蛋白质产物，其为家族即原癌基因(protooncogenes)的ERBB家族的一个成员，在人类许多癌症的发生和发展中起关键作用。尤其是，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中观察到EGFR增强的表达。临床上，已有报告肿瘤中的ERBB致癌基因扩增和/或受体过度表达与疾病复发和患者预后差相关，以及与疗法的响应相关。
EGFR抑制剂是指能够抑制EGFR的酪氨酸激酶活性的分子，可以是小分子化合物、生物大分子例如抗体或抗体片段等。示例性的小分子EGFR抑制剂包括，但不限于，第一代EGFR抑制剂例如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、第二代EGFR抑制剂如阿法替尼、达克替尼、伊马替尼和拉帕替尼，第三代EGFR抑制剂如奥西莫替尼(AZD9291)、纳扎替尼、rociletinib、naquotinib等。示例性大分子EGFR抑制剂包括但不限于西妥昔单抗和帕尼单抗。
在某些实施方式中，所述EGFR抑制剂选自下组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、伊马替尼、拉帕替尼、奥西莫替尼(AZD9291)、纳扎替尼、rociletinib、naquotinib、vandetanib、neratinib,pelitinib、canertinib、brigatinib、PKC412、Go6976、mavelertinib、olmutinib、naquotinib、WZ4002、TAS2913、西妥昔单抗和帕尼单抗、avitinib、HS-10296和TQB3804。在某些实施方式中，所述EGFR抑制剂是奥西莫替尼。
耐药在本申请中是指对治疗剂(例如EGFR抑制剂)产生抗性或者不响应。例如，即使接受治疗剂的治疗，肿瘤细胞的数量仍然增加。在某些实施方式中，所述对EGFR抑制剂耐药的癌症是肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)。
在某些实施方式中，所述癌症(例如肺癌)的特征在于表达突变的EGFR。所述突变的EGFR具有一个或多个选自下组的突变：L858R、T790M、C797S、和EGFR基因外显子20插入。EGFR的标准氨基酸序列可参见，SwissProt数据库中登录号P00533-1中所示的序列，以及NCBI数据库中登录号NP_005219.2中所示的序列。本申请中的EGFR的突变位置以上述EGFR的标准氨基酸序列中的位置为准。例如L858R，T790M和C797S分别是指在EGFR序列的858位上的亮氨酸被精氨酸替代，或者790位的苏氨酸被甲硫氨酸替代，或者797位的半胱氨酸被丝氨酸替代。L858R突变位于EGFR的外显子21中。第一代EGFR抑制剂能够治疗对EGFR外显子19缺失或外显子21L858R突变的患者，但是患者容易获得耐药性。EGFR外显子20中的T790M突变被发现是与获得性耐药发展相关的最常见的突变，T790M将类似地抑制由EGFR酪氨酸激酶抑制剂的抑制作用。第三代EGFR抑制剂能够作用于具有T790M突变的EGFR。然而，已经观察到第三代EGFR抑制剂的获得性耐药的发展，包括797位的半胱氨酸残基发生突变。
在某些实施方式中，所述患者被诊断为表达所述突变的EGFR。所述患者可以通过本领域公知的方法被诊断，例如通过可以特异性区分突变EGFR与野生型EGFR的核酸探针进行杂交检测的方法、通过核酸扩增的方法、通过特异性区分突变EGFR与野生型EGFR的抗体进行检测的方法等。
本申请意想不到的发现，本申请提供的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物的联合使用，能够治疗EGFR突变的癌症，包括但不限于具有上述EGFR突变的癌症。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是化合物15或化合物31。在某些实施方式中，所述化疗药物包括微管蛋白抑制剂。在某些实施方式中，所述化疗药物是多西他赛、氟尿嘧啶(例如5-氟尿嘧啶)或顺铂。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含化合物15或化合物31和多西他赛的组合。本发明人出乎意料地发现化合物15或化合物31与多西他赛联合使用会产生比单独使用化合物15、化合物31或多西他赛更加优异的显著抗癌作用。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含化合物15或化合物31和5-氟尿嘧啶的组合。本发明人出乎意料地发现化合物15或化合物31与5-氟尿嘧啶联合使用会产生比单独使用化合物15、化合物31或5-氟尿嘧啶更加优异的显著抗癌作用。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含化合物15或化合物31和组蛋白乙酰化抑制剂(帕比司他)的组合。本发明人出乎意料地发现化合物15或化合物31与帕比司他联合使用会产生比单独使用化合物15、化合物31或帕比司他更加优异的显著抗癌作用。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含化合物15或化合物31和顺铂的组合。本发明人出乎意料地发现化合物15或化合物31与顺铂联合使用会产生比单独使用化合物15、化合物31或顺铂更加优异的显著抗癌作用。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含化合物15或化合物31和伊立替康的组合。本发明人出乎意料地发现化合物15或化合物31与伊立替康联合使用会产生比单独使用化合物15、化合物31或伊立替康更加优异的显著抗癌作用。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含化合物15或化合物31和紫杉醇的组合。本发明人出乎意料地发现化合物15或化合物31与紫杉醇联合使用会产生比单独使用化合物15、化合物31或紫杉醇更加优异的显著抗癌作用。
在优选的实施方式中，本发明的药物组合物包含化合物15或化合物31和拓扑替康的组合。本发明人出乎意料地发现化合物15或化合物31与拓扑替康联合使用会产生比单独使用化合物15、化合物31或拓扑替康更加优异的显著抗癌作用。
治疗方法
根据本发明的第二方面，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和治疗有效量的化疗药物。其中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物分别如上文中所定义。所述癌症也如上文中所定义。
本文所用的术语"治疗"是指消除、减少或改善疾病或病况和/或与其相关的症状。例如“治疗癌症”包括治疗、遏制癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其转移等。尽管未排除，但治疗疾病或病况不要求所述疾病、病况或与其相关的症状被完全消除。本文所用的术语"治疗"可包括"预防性治疗"，其是指在未患有疾病，但有风险或易于重新发生疾病或病况或所述疾病或病况有复发风险或易于复发的受试者中，减少重新发生疾病或病况的可能性，或减少之前控制的疾病或病况的复发的可能性。术语"治疗"和同义词预期给予需要所述治疗的个体治疗有效量的本发明化合物。
本发明的含义内，"治疗"还包括复发预防或阶段预防，以及治疗急性或慢性征兆、症状和/或机能障碍。治疗可以是针对症状的，例如，抑制症状。其可在短时期内起作用，针对中等时期内，或可以是长期治疗，例如在维持疗法的情况下。
本文所用的术语"治疗有效量"或"有效剂量"是指如下的活性成分的量，当通过本发明的方法给药时，其足以有效递送活性成分至有需要的个体用于治疗目标疾病。在癌症或其它增殖病症的情况下，药剂的治疗有效量可减少不需要的细胞增殖，减少癌细胞数，减少肿瘤大小；抑制癌细胞侵润至周围器官；抑制肿瘤转移；抑制肿瘤生长至一定程度；减少靶细胞中的Bcl-2/Bcl-xL信号转导；和/或缓解与癌症相关的一个或多个症状至一定程度。
本发明的治疗方法中，可以在对有需要的个体施用治疗有效量的化疗药物之前、之后或同时，对所述患者施用治疗有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂；其中Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物可以各自与药学上可接受的载体结合。
本发明的治疗方法中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物可作为单一单位剂量一起给药或作为多个单位剂量分开给药。
在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂可以以约0.005-约500mg/日、优选约0.05-约250mg/日、更优选约0.5-约100mg/日的量给药。在某些实施方案中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂以约10mg/周至约1000mg/周、约10mg/周至约900mg/周、约10mg/周至约800mg/周、约10mg/周至约700mg/周、约10mg/周至约640mg/周、约10mg/周至约600mg/周、约10mg/周至约500mg/周、约10mg/周至约400mg/周、约10mg/周至约300mg/周、约10mg/周至约200mg/周、或约20mg/周至约100mg/周的量，例如约10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg/周的量给药。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂以每剂量约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500毫克的量给药。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每周七次的频率给药。
在某些实施方式中，所述化疗药物可以以0.005mg/日至约5000mg/日的量，包括以约0.005、0.05、0.5、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/日的量给药。
制药用途
根据本发明的第三方面，提供Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物分别如上文中所定义。所述癌症也如上文中所定义。
本发明的药物组合物可通过任何合适的途径给药，例如通过口服、含服、吸入、舌下、直肠、阴道、脑池内或经过腰椎刺穿的鞘内、经尿道、经鼻、经皮、或胃肠外(包括静脉内、肌肉内、皮下、冠状动脉内、皮内、乳房内、腹膜内、关节内、鞘内、眼球后、肺内注射和/或在特定位点的手术植入)给药。胃肠外给药可使用针头和注射器或使用高压技术完成。在某些实施方案中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述化疗药物可以以相同或不同的给药途径施用。在某些实施方案中，所述给药途径包括口服、静脉注射或皮下注射。
本发明的药物组合物的毒性和治疗功效可通过标准制药程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如用于确定各成分的最大耐受剂量(MTD)，其定义为在动物中不引起毒性的最高剂量。在最大耐受剂量和治疗效果(例如抑制肿瘤生长)之间的剂量比是治疗指数。剂量可在该范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的给药途径。
制药用途所需的治疗有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物随着治疗的病况的性质、所需活性的时间长度和患者的年龄以及病况而变化。可分别调整给药量和间隔以提供足以保持所需治疗效果的药物组合的血浆水平。可以单一剂量或按以合适间隔给药的多次剂量方便地施用所需剂量，例如按1次、2次、3次、4次或更多次亚剂量/天。经常需要或要求多次剂量。例如，本发明的药物组合物可以以下频率给药：1次剂量/天，持续2天，休息5天，持续2周；1次剂量/天，持续3天，休息4天，持续3周；每周1次给药，持续2周；每周1次给药，持续4周；或者，根据情况适当确定的任何剂量方案。在某些实施方案中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和所述化疗药物可以一起、同时、顺序或交替给药。
本发明的药物组合物通常与药用载体混合给药，所述载体根据预期的给药途径和标准药学实践而选择。根据本发明使用的药物组合物使用一种或多种药学上可接受的载体以常规方式配制。
本发明的药物组合物可通过例如常规的混合、溶解、制粒、制锭、乳化、包封、捕获或冻干过程制备。合适的制剂取决于所选的给药途径。当口服给药时，所述组合物通常呈片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂或酏剂的形式。当以片剂形式给药时，所述组合物可另外包含固体载体，例如明胶或辅剂。片剂、胶囊剂和粉剂含有约0.01％-约95％重量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂。当以液体形式给药时，可加入液体载体例如水、醇或动物或植物来源的油。液体形式的组合物可进一步含有生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或甘油。当以液体形式给药时，所述组合物含有约0.1％-约90％重量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂。
当治疗有效量的本发明药物组合物通过静脉内、皮肤或皮下注射给药时，所述组合物呈无热源的胃肠外可接受的水溶液的形式。在本领域的技术范围内可适当考虑pH、等渗性、稳定性等而制备这样的胃肠外可接受的溶液。用于静脉内、皮肤或皮下注射的优选的组合物通常含有等渗溶剂。
Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和/或化疗药物可容易地与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合。这样的载体使得活性剂能够配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等剂型。用于口服的药物制剂可通过添加活性成分和固体赋形剂，对所得混合物任选进行研磨，根据需要在加入合适的助剂之后，进行造粒并压制以得到片剂或片芯而获得。合适的赋形剂包括例如填充剂、纤维素制剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂等。
Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和/或化疗药物配制成注射制剂用于胃肠外给药，例如通过推注或持续滴注。注射制剂可以单位剂型提供，例如在安瓿中或在多剂量容器中，具有添加的防腐剂。所述组合物可呈这样的形式，例如在油性或水性溶剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂，和可含有辅剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给药的药物组合物包括呈水溶形式的活性剂的水性溶液。此外，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和/或化疗药物的混悬剂可制备成合适的油性注射混悬剂。合适的亲脂溶剂包括脂肪油或合成的脂肪酸酯。水性注射混悬剂可包含增加混悬剂的粘度的物质。任选地，混悬剂还可包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解度并允许制备高度浓缩溶液的试剂。或者，本发明的组合物可以呈粉末形式，用于在使用前与合适的溶剂例如无菌无热源水配制。
Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和/或化疗药物还可配制在直肠组合物中，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基料。除了前述制剂之外，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和/或化疗药物还可配制为贮库制剂。这样的长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射给予。因此，例如，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和/或化疗药物可与合适的聚合材料或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制。
具体而言，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和/或化疗药物可以采用含有赋形剂例如淀粉或乳糖的片剂的形式，或与赋形剂混合的胶囊剂的形式，或含有矫味剂或着色剂的酏剂或混悬剂的形式，口服、含服或舌下给药。上述液体制剂可与药学上可接受的添加剂(例如助悬剂)一起配制。Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和/或化疗药物还可经胃肠外注射，例如静脉内、肌肉内、皮下或冠状动脉内。对于胃肠外给药，最好以无菌水性溶液的形式使用，其可含有其它物质，例如盐或单糖，例如甘露糖醇或葡萄糖，以使所述溶液与血液等渗。
Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的体内抗癌作用
在另一方面，本申请还提供了通过向患者施用有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂(例如，化合物15或化合物31)在有需要的患者中治疗癌症的方法。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂作为单一药剂。在某些实施方式中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂作为与其他治疗剂(例如化疗药物)联合治疗的联合药剂。
在某些实施方案中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂是化合物15或化合物31。
在某些实施方案中，所述治疗癌症的方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂，如化合物15或化合物31，其中所述方法包括至少一个28天的疗程，其中在所述疗程的所述连续4周中每周两次(例如，化合物15或化合物31在每个疗程的第1、4、8、11、15、18和22天通过30分钟静脉滴注给药，28天为1个疗程)或每周一次(例如，化合物15或化合物31将在每个周期的第1、8、15、22天通过30分钟静脉滴注给药，28天为一个疗程)通过静脉输注施用Bcl-2/Bcl-xL抑制剂。所述疗程可根据需要重复多次。所述治疗有效量为约10mg至约400mg Bcl-2/Bcl-xL抑制剂。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约20mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约40mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约80mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约120mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约160mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约200mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约240mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约280mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约320mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约360mg。
在某些实施方案中，Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的治疗有效量为约400mg。
本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。
1.一种药物组合物，其特征在于，包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物、以及药学上可接受的载体；
所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂为下述通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物或其药学上可接受的盐：
(I)
Figure BDA0002978293850000391
(II)
Figure BDA0002978293850000392
Figure BDA0002978293850000401
(IV)
Figure BDA0002978293850000402
其中A环是
Figure BDA0002978293850000403
取代或未取代的X选自亚烷基、亚烯基、环亚烷基、环亚烯基和杂环亚烷基；
Y选自(CH2)n-N(Ra)2和
Figure BDA0002978293850000404
Q选自O、O(CH2)1-3、NRc、NRc(C1-3亚烷基)、OC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)O、C(＝O)O(C1-3亚烷基)、NHC(＝O)(C1-3亚烷基)、C(＝O)NH和C(＝O)NH(C1-3亚烷基)；
Z是O或NRc；
R1和R2独立地选自H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、SR'、NR'R”、COR'、CO2R'、OCOR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、NR'COR”、NR'CONR”R”'、NR'C＝SNR”R”'、NR'SO2R”、SO2R'和SO2NR'R”；
R3选自H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、NR'R”、OCOR'、CO2R'、COR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、C1-3亚烷基CH(OH)CH2OH、SO2R'和SO2NR'R”；
R'、R”和R”'独立地是H、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、C1-3亚烷基杂环烷基或杂环烷基；
R'和R”或R”和R”'可与它们所连接的原子一起形成3-7元环；
R4是氢、卤素、C1-3烷基、CF3或CN；
R5是氢、卤素、C1-3烷基、取代的C1-3烷基、羟基烷基、烷氧基或取代的烷氧基；
R6选自H、CN、NO2、卤素、烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环烷基、OR'、SR'、NR'R”、CO2R'、OCOR'、CONR'R”、CONR'SO2R”、NR'COR”、NR'CONR”R”'、NR'C＝SNR”R”'、NR'SO2R”、SO2R'和SO2NR'R”；
取代或未取代的R7选自氢、烷基、烯基、(CH2)0-3-环烷基、(CH2)0-3-环烯基、(CH2)0-3-杂环烷基、(CH2)0-3芳基和(CH2)0-3杂芳基；
R8选自氢、卤素、NO2、CN、CF3SO2和CF3；
Ra选自氢、烷基、杂烷基、烯基、羟基烷基、烷氧基、取代的烷氧基、环烷基、环烯基和杂环烷基；
Rb是氢或烷基；
Rc选自氢、烷基、取代的烷基、羟基烷基、烷氧基和取代的烷氧基；和
n、r和s独立地是1、2、3、4、5或6；
R21是SO2R2'；
R22是烷基，优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基；
R23是烷基，优选C1-4烷基,更优选甲基、丙基或异丙基；
R24是卤素，优选氟、氯；
R25是卤素，优选氟、氯；
R26选自H、卤素和烷基，优选氟、氯、C1-4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
R21b是H或烷基,优选C1-4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基；
n2,r2和s2独立地是1、2、3、4、5或6，更优选r2和s2均是2且n2是3、4或5,更优选n2、r2和s2均是2；和
R2'是烷基，优选C1-4烷基，更优选甲基、丙基或异丙基。
2.根据段落1所述的药物组合物，其中，Y是
Figure BDA0002978293850000411
式中，n是1-3的整数；
Rb是氢或C1-3烷基；
Q是O、O(CH2)1-3、C(＝O)O(CH2)1-3、OC(＝O)(CH2)1-3或C(＝O)O(C3H7)1-3。
3.根据段落1或2所述的药物组合物，其中，所述Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂选自以下：
Figure BDA0002978293850000421
Figure BDA0002978293850000431
Figure BDA0002978293850000441
4.根据段落1～3中任一项所述的药物组合物，其中，所述Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂是(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯基硫代)丁基)哌啶-4-羰基氧基)乙基膦酸或其药学上可接受的盐，具有下述结构式：
Figure BDA0002978293850000451
(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸或其药学上可接受的盐，具有下述结构式：
Figure BDA0002978293850000452
5.根据段落1-4中任一项所述的药物组合物，其中，所述化疗药物选自帕比司他、放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、5-氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、阿霉素、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和羟基喜树碱。
6.根据段落1-5中任一项所述的药物组合物，其中，所述化疗药物选自多西他赛、5-氟尿嘧啶、帕比司他、紫杉醇、顺铂、伊立替康、拓扑替康、依托泊苷。
7.根据段落1-6中任一项所述的药物组合物，其中，所述化疗药物为多西他赛、5-氟尿嘧啶或帕比司他。
8.根据段落1-7中任一项所述的药物组合物，其中，该药物组合物用于癌症的治疗。
9.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效量的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和治疗有效量的化疗药物。
10.根据段落9所述的方法，其中，所述Bcl-2/Bcl-xL抑制剂为段落1～4中任一项所定义的Bcl-2/Bcl-xL抑制剂；所述化疗药物为段落5～7中所定义的化疗药物。
11.根据段落9或10所述的方法，其中，所述癌症选自肾上腺癌、淋巴上皮瘤、腺样细胞癌、淋巴瘤、听神经瘤、急性淋巴细胞白血病、肢端黑色素瘤、急性髓系白血病、肢端汗腺瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性嗜酸粒细胞白血病、肝癌、急性红细胞白血病、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、急性巨核细胞白血病、MALT淋巴瘤、急性单核细胞白血病、恶性纤维组织细胞瘤、急性早幼粒细胞白血病、恶性外周神经鞘瘤、套细胞淋巴瘤、腺癌、边缘区B细胞淋巴瘤、恶性海马肿瘤、腺样囊性癌、腺瘤、腺瘤样牙源性肿瘤、肥大细胞白血病、腺鳞癌、纵隔生殖细胞肿瘤、脂肪组织肿瘤、乳腺髓样癌、肾上腺皮质癌、甲状腺髓样癌、成人T细胞白血病/淋巴瘤、成神经管细胞瘤、侵袭性NK细胞白血病、黑色素瘤、艾滋病相关淋巴瘤、脑膜瘤、肺泡横纹肌肉瘤、默克尔细胞癌、肺泡软组织肉瘤、间皮瘤、成釉细胞瘤、转移性尿路上皮癌、间变性大细胞淋巴瘤、混合苗勒氏肿瘤、甲状腺未分化癌、粘液性肿瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、血管平滑肌脂肪瘤、肌肉组织肿瘤、血管肉瘤、蕈样真菌病、星形细胞瘤、粘液样脂肪肉瘤、非典型畸形性横纹肌样瘤、粘液瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、粘液肉瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、鼻咽癌、B细胞淋巴瘤、神经鞘瘤、基底细胞癌、神经母细胞瘤、胆道癌、神经纤维瘤、膀胱癌、神经瘤、胚细胞瘤、结节性黑色素瘤、骨癌、眼癌、布伦纳瘤、少突细胞瘤、褐色肿瘤、少突神经胶质瘤、伯基特氏淋巴瘤、嗜酸细胞瘤乳腺癌、鞘膜脑膜瘤、脑癌、视神经肿瘤癌、口腔癌原位癌、骨肉瘤、癌肉瘤、卵巢癌、软骨肿瘤、肺上沟瘤、乳头状甲状腺癌、骨髓瘤、副神经节瘤、软骨瘤、松果体母细胞瘤、脊索瘤、松果细胞瘤、绒毛膜癌、垂体瘤、脉络丛乳头状瘤、垂体腺瘤、肾透明细胞肉瘤、垂体瘤、颅咽管瘤、浆细胞瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、多胚胎发性细胞瘤、宫颈癌、前驱体T淋巴母细胞淋巴瘤、结直肠癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、德戈斯病、原发性积液淋巴瘤、增生性小圆细胞瘤、原发性预成型腹膜癌、前列腺癌、胚胎发育不良的神经上皮肿瘤、胰腺癌、无性细胞瘤、咽癌、胚胎癌、腹膜假粘液瘤、内分泌腺肿瘤、肾细胞癌、肠病相关的T细胞淋巴瘤、内胚窦瘤、肾髓样癌、视网膜母细胞瘤、食道癌、横纹肌瘤、胎中胎胎儿、胎儿、横纹肌肉瘤、纤维瘤、Richter’s征转化里希特的转变、纤维肉瘤、直肠癌、滤泡性淋巴瘤、肉瘤、滤泡性甲状腺癌、神经鞘瘤病、神经节细胞瘤、精原细胞瘤、胃肠癌、支持细胞瘤、生殖细胞肿瘤、性索-性腺间质瘤、妊娠绒毛膜癌、印戒细胞癌、巨细胞成纤维细胞瘤、皮肤癌、骨巨细胞瘤、小蓝圆细胞瘤、胶质瘤、小细胞癌、多形性胶质母细胞瘤、软组织肉瘤、胶质瘤、生长抑素瘤、胶质瘤病大脑、煤烟尘疣、胰高血糖素瘤、脊柱肿瘤、性腺母细胞瘤、脾边缘区淋巴瘤、颗粒细胞瘤、鳞状细胞癌、雌激素瘤、滑膜肉瘤、胆囊癌、Sezary疾病、胃癌、小肠癌、毛细胞白血病、鳞状细胞癌、血管母细胞瘤、胃癌、头颈癌、T细胞淋巴瘤、血管外皮细胞瘤、睾丸癌、血液系统恶性肿瘤、肉瘤、肝母细胞瘤、甲状腺癌、肝脾T细胞淋巴瘤、移行细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、非霍奇金淋巴瘤、脐尿管癌、浸润性小叶癌、泌尿生殖系统癌、肠癌、尿路上皮癌、肾癌、葡萄膜黑色素瘤、喉癌、子宫癌、恶性雀斑样痣、疣状癌、致死性中线癌、视觉通路胶质瘤、白血病、外阴癌、睾丸间质细胞瘤、阴道癌、脂肪肉瘤、瓦尔登斯特伦的巨球蛋白血症、肺癌、腺淋巴瘤、淋巴管瘤、肾母细胞瘤、淋巴管肉瘤。
12.根据段落9-11中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、胃癌、结肠癌。
13.根据段落9-11中任一项所述的方法，所述癌症是转移性的实体瘤。
14.根据段落9-13任一所述的方法，所述癌症是Bcl-2/Bcl-xL和Bax阳性的。
15.根据段落9-14中任一项所述的方法，所述癌症是胃癌。
16.根据段落9-14中任一项所述的方法，所述癌症是对EGFR抑制剂耐药的。
17.根据段落9-14或16任一所述的方法，所述癌症是肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)。
18.根据段落16或17所述的方法，所述EGFR抑制剂选自下组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、伊马替尼、拉帕替尼、奥西莫替尼(AZD9291)、纳扎替尼、rociletinib、naquotinib、vandetanib、neratinib、pelitinib、canertinib、brigatinib、PKC412、Go6976、mavelertinib、olmutinib、WZ4002、TAS2913、西妥昔单抗、帕尼单抗、avitinib、HS-10296和TQB3804。
19.根据段落16-18中任一项所述的方法，所述癌症的特征在于表达突变的EGFR，所述EGFR具有一个或多个选自下组的突变：L858R、T790M、C797S、和EGFR基因外显子20插入。
20.根据段落19中所述的方法，所述EGFR具有以下突变：L858R、T790M、和C797S。
21.根据段落19或20所述的方法，其中所述患者被诊断为表达所述突变的EGFR。
22.根据段落9-21中任一项所述的方法，其中，将所述Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂以约0.005-约500mg/日、约0.05-约250mg/日或约0.5-约100mg/日的量给药。
23.Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂和化疗药物的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂为段落1～4中任一项所定义的Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂；所述化疗药物为段落5～7所定义的化疗药物。
24.根据段落23所述的用途，其中，所述Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂是(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯基硫代)丁基)哌啶-4-羰基氧基)乙基膦酸或(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸；所述化疗药物选自多西他赛、5-氟尿嘧啶、帕比司他、紫杉醇、顺铂、伊立替康、拓扑替康、依托泊苷。
实施例
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果作进一步说明，以使本领域技术人员能够充分地了解本发明的目的、特征和效果。应该理解以下实施例仅为示意性的，不构成对本发明范围的限定。
Bcl-2/Bcl-xL抑制剂的合成
化合物15：(R)-2-(1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯基氨基)-4-(苯基硫代)丁基)哌啶-4-羰基氧基)乙基膦酸。化合物15合成的方法可参照WO2014/113413A1说明书的记载，由如下途径制备。
Figure BDA0002978293850000481
1H NMR(300MHz,CD3OD):δ7.93(d,J＝1.9Hz,1H),7.72(dd,J＝9.2,1.8Hz,1H),7.30-7.12(m,12H),6.83-6.42(m,5H),4.46-4.33(m,3H),3.96(s,1H),3.54-2.93(m,16H),2.82(s,3H),2.72(s,3H),2.71-2.55(m,1H),2.24-1.65(m,8H),1.41(d,J＝7.1Hz,6H)。MS(ESI):m/z 1268.58(M+H)+。
化合物31：(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸。化合物31的合成的方法可参照WO2014/113413A1说明书的记载，由如下途径制备。
Figure BDA0002978293850000491
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.84(s,1H),7.82(s,1H),7.65(d,J＝8.7Hz,1H),7.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.32–7.14(m,7H),7.11–6.81(m,6H),6.63–6.47(m,2H),6.43–6.30(m,1H),4.33(p,J＝7.1Hz,1H),4.07(s,1H),3.32-3.22(m,4H),3.19–3.03(m,9H),2.89(s,4H),2.67(s,4H),2.31-1.55(m,8H),1.35(d,J＝7.0Hz,6H)。
WST实验
细胞铺板：通过基于水溶性四唑盐(WST)的CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验检测抗增殖作用。
将细胞接种于96孔板中，每个阴性对照组仅加入95μL完全培养基，每个待测孔加入95μL完全培养基细胞悬液，细胞密度为5-10x10^4个/孔。
实施例中所用的MGC80-3、SW620购自中科院上海生命科学院研究所生物化学与细胞生物学研究所细胞库。MDA-MB-231、PC-3、NCI-H14可获自美国模式培养物保藏所(ATCC，American Type Culture Collection)，登录号分别为HTB-26,CRL-1435和HTB-173。应予说明，本发明所用细胞均可从ATCC获得。MGC80-3、PC-3、NCI-H146的培养条件为RPMI 1640培养基；10％胎牛血清；1％双抗。MDA-MB-231的培养条件为最低必需培养基(含0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸钠)，10％胎牛血清，1％双抗。SW620的培养条件为Leibovitz的L-15培养基，10％胎牛血清，1％双抗。
加药(避光操作)：在96孔培养板中，根据不同细胞对不同药物的敏感性，选择最高浓度为10μM，按1：3比例系列稀释得到9个浓度。每孔加入5μL化合物，每个浓度做2-3个复孔。化合物加好后，将96孔板置于5％CO2，37℃的孵箱中孵育。并用不同浓度的受试物处理72小时。通过使用9个不同浓度药物B(如多西他赛，Docetaxel)与3个固定剂量的化合物15作用72小时，测试该药物与化合物15的协同作用。每个测试剂量做3复孔。
读数：培养结束时，对于贴壁细胞，除去待测孔内旧液，加入100μl/孔CCK-8检测液(含10％CCK-8，5％FBS的相应培养基)。对于悬浮细胞，直接加入20μl/孔CCK-8原液。将培养板继续于37℃，CO2培养箱中孵育2-4小时。
使用酶标仪(SpectraMax Plus 384，Molecular Devices,LLC.,US)A450 nm检测OD值。使用3复孔平均OD值，通过下列公式计算细胞存活率百分比：
(O.D.测试孔–O.D.空白对照孔)/(O.D.细胞对照孔-O.D.空白对照孔)×100％。
使用Graphpad Prism 6.0软件的非线性回归数据分析方法计算IC50。结果如图1和表2中所示。
对于联合实验，通过单药对照的3复孔平均OD值归一化处理后计算细胞存活率。通过联合曲线与单药曲线的IC50进行比较以确定2个化合物的协同作用(联合曲线左移)。
体内药效实验评估方法
细胞接种法建立人肿瘤免疫缺陷小鼠皮下异种移植瘤模型：收集对数生长期的肿瘤细胞，计数后重悬于1×PBS，调整细胞悬液浓度至2.5-5×107/mL。用1mL注射器(4号针头)在免疫缺陷小鼠右侧背部皮下接种肿瘤细胞，5-10×106/0.2mL/鼠。相关参数的计算参考中国NMPA《细胞毒类抗癌药物非临床研究技术指导原则》。
实验期间每周测定两次动物体重和肿瘤大小。每天观察动物的状态以及有无死亡等情况发生。常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性、摄食和饮水情况、体重增加或降低情况、眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的死亡和临床症状均记录在原始数据中。整个给药、小鼠体重及肿瘤体积的测量操作均在超净工作台中进行。根据实验方案要求，末次给药结束后，收集血浆和肿瘤组织，称重并拍照记录。血浆和肿瘤样本-80℃冻存备用。
肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：
TV＝a×b2/2
其中a、b分别代表肿瘤测量长和宽。
相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)计算公式为：
RTV＝Vt/V1
其中V1为分组给药时的肿瘤体积，Vt为给药后某天测量时的肿瘤体积。
抗癌活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式分别为：
相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％
TRTV为治疗组RTV，CRTV为溶媒对照组RTV；
肿瘤缓解率(％)为治疗后荷瘤小鼠出现SD(stable disease,疾病稳定)、PR(partial regression，肿瘤部分消退)及CR(complete regression,肿瘤完全消退)的数目除以本组小鼠总数×100％。
动物体重变化(Change of body weight，％)＝(测量体重-分组时体重)/分组时体重×100％。
疗效评价标准：根据中国NMPA《细胞毒类抗癌药物非临床研究技术指导原则》(2006年11月)，T/C(％)值≤40％并经统计学分析p<0.05为有效。若小鼠的体重下降超过20％或药物相关的死亡数超过20％，则认为该药物剂量具有严重毒性。
体外结果
如图1和表2所示，在MDA-MB-231三阴乳腺癌肿瘤细胞系中，化合物15与多西他赛(Docetaxel)(TXT)联合用药，对肿瘤细胞的增殖抑制作用增强，表现为联合用药曲线左移，联合用药组的IC50值比各个单独用药组的IC50值小。
表2.化合物15与多西他赛的联合用药及单独用药的结果
Figure BDA0002978293850000511
体内实验
实验例1.化合物15联合多西他赛在人源MDA-MB-231细胞系乳腺癌小鼠异种移植 瘤模型中的联合抗癌作用
MDA-MB-231是人的三阴乳腺癌模型，本实验在此移植模型中评价了化合物15与多西他赛的抗癌治疗作用。如图2所示，化合物15(100mg/kg)可以增加多西他赛单药的抗癌作用，给药结束时化合物15(100mg/kg)与多西他赛给药组1/8肿瘤完全消退且持续至实验结束。实验结果表明联合施用化合物15和多西他赛两种药物比单独施用其中任一种在三阴乳腺癌上的抗癌作用显著更明显。
实验例2.化合物15联合多西他赛在人源NCI-H146细胞系小细胞肺癌小鼠异种移 植瘤模型中的联合抗癌作用
本实验研究了化合物15与多西他赛在NCI-H146人小细胞肺癌模型中的抗癌治疗作用。如图3所示，化合物15(25mg/kg)可以增加多西他赛单药的抗癌作用，化合物15(25mg/kg)与多西他赛给药组在给药第四天，7只动物中有1只的肿瘤开始消失，给药三周后，7只动物中有5只的肿瘤完全消退。实验结果表明联合施用化合物15和多西他赛两种药物比单独施用其中任一种在小细胞肺癌上的抗癌作用显著更明显。
实验例3.化合物15联合多西他赛在人源PC3细胞系前列腺癌小鼠异种移植瘤模型 中的联合抗癌作用
本实验研究了化合物15与多西他赛在PC3人前列腺癌模型中的抗癌治疗作用。如图4所示，化合物15(100mg/kg)可以增加多西他赛单药的抗癌作用，化合物15(100mg/kg)单药显示了轻微的抗癌作用，T/C(％)为84.4％(P＝0.4665)；多西他赛(8mg/kg)单药组也显示了轻微的抗癌作用，T/C(％)为72.4％(P＝0.1579)；化合物15与多西他赛联合给药组显示了较单药更好的抗癌作用，T/C(％)51.5％(P＝0.0209)。该实验结果表明联合施用化合物15和多西他赛两种药物比单独施用其中任一种在前列腺癌上的抗癌作用显著更明显。
实验例4.化合物15联合多西他赛或顺铂在人源MGC80-3细胞系胃癌小鼠异种移植 瘤模型中的联合抗癌作用
本实验研究了化合物15与多西他赛或顺铂在MGC80-3人胃癌模型中的抗癌治疗作用。如图5所示，化合物15(100mg/kg)可以增加多西他赛单药的抗癌作用，多西他赛(8mg/kg)单药组显示了轻微的抗癌作用，T/C(％)为54.5％(P＝0.6650)；化合物15与多西他赛联合给药组T/C(％)为47.8％(P＝0.0572)，较多西他赛单药组抗癌药效更好。
如图6所示，化合物15(100mg/kg)可以增加多西他赛单药或顺铂的抗癌作用，多西他赛(12mg/kg)单药组显示了轻微的抗癌作用，T/C(％)为39.0％(P＝0.0003)；化合物15与多西他赛联合给药组T/C(％)7.8％(P<0.0001)，较多西他赛单药组抗癌药效更好且7只动物中2只的肿瘤在给药第三周时完全消失。顺铂(3mg/kg)单药组在给药结束时T/C(％)65.0％(P＝0.0034)，化合物15与顺铂联合给药组T/C(％)为53.6％(P＝0.0001)。
上述实验结果表明联合施用化合物15和多西他赛或顺铂两种药物比单独施用其中任一种在胃癌上的抗癌作用显著更明显。
实验例5.化合物15联合伊立替康在人源SW620细胞系结肠癌小鼠异种移植瘤模型 中的联合抗癌作用
本实验研究了化合物15与伊立替康在SW620人结肠癌模型中的抗癌治疗作用。如图7所示，化合物15(100mg/kg)可以增加伊立替康单药的抗癌作用，化合物15(100mg/kg)单药显示了轻微的抗癌作用，T/C(％)60.6％；伊立替康(50mg/kg)单药组也显示了轻微的抗癌作用，T/C(％)29.9％；化合物15(50或100mg/kg)，BIW给药周期和100mg/kg QW给药周期分别与伊立替康联合给药的T/C(％)值分别为23.5％(P＝0.0001)、9.1％(P<0.0001)和11.4％(P＝0.0001)。该实验结果表明联合施用化合物15和伊立替康两种药物比单独施用其中任一种在结肠癌上的抗癌作用显著更明显。
由以上的各试验可知，在化合物15作为单药或与化疗药物联合作用的体外细胞抗增殖试验中，化合物15与化疗药物联合用药时，对一系列肿瘤细胞的增殖抑制作用得到增强。
化合物15与化疗药物在NCI-H146人小细胞肺癌模型、MDA-MB-231人三阴乳腺癌模型、PC-3人前列腺癌模型、MGC80-3人胃癌模型及SW620人结肠癌模型上的联合用药结果显示，化合物15可以增强化疗药物的抗癌作用。
以上结果表明Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂与化疗药物联合用药，在治疗癌症中具有巨大潜力。
实验例6.化合物15用于治疗转移性实体瘤的患者
化合物15是一种新型双重Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂。开发了一种独特的策略，可以在巧妙地降低靶向的血小板毒性，同时保持强大的体内抗肿瘤活性。化合物15抑制人癌异种移植模型中的肿瘤生长，同时显示出显著较少的血小板减少症。
在美国、澳大利亚和中国进行了具有相似研究设计的3项临床试验(I期或I/II期)。在剂量递增阶段，患者在28天的疗程内每周两次或每周静脉内接受化合物15(10-400mg)。每2个疗程按照RECIST 1.1标准进行肿瘤反应评估。研究目的是评估安全性，最大耐受剂量(MTD)/二期推荐剂量(RP2D)，药代动力学(PK)，药效学(PD)和化合物15作为单药使用时在转移性实体瘤中的初步疗效。
截至2019年1月31日，44名患者(美国：21名患者，中国：13名患者，澳大利亚：10名患者)接受了7个不同剂量水平的化合物15的治疗。目前正在研究的剂量水平是每周两次320mg。
试验的汇总分析显示，化合物15在所有测试剂量水平下均具有良好的耐受性。尚未达到MTD。大多数不良事件(AE)为1级或2级，未发现导致药物中断的药物相关AE。最常见的3/4级AE是：低钠血症(11.4％)，淋巴细胞计数减少(6.8％)，脂肪酶升高(6.8％)。
19例小细胞肺癌(SCLC)患者进行了至少一次治疗后的肿瘤评估，其中1例美国患者在40mg的剂量下部分缓解(PR)。部分缓解持续时间很长，该患者已用化合物15治疗超过20个疗程。4名中国患者在80mg/240mg的剂量下实现了病情稳定(SD)，其中2名患者的病情稳定持续时间超过4个疗程。此外，在澳大利亚的研究中还报道了在其他肿瘤类型(例如：CRC)中的5个病情稳定案例。
PK分析表明，在10-160mg的剂量范围内，第1天的AUC和Cmax随剂量成比例增加，在相同剂量水平下，AUC和Cmax在美国和中国患者之间是相当的。
本试验表明，化合物15在所有测试剂量水平下都具有良好的耐受性。剂量递增在每周两次和每周一次的给药计划中持续进行。在剂量递增期间观察到初步的单一药剂抗癌活性。
实验例7.化合物15在肺癌异种移植模型中的治疗效果
实验评估了实验样品化合物15单独及其多种联合用药组合在雌性NOD.SCID小白鼠中对皮下
Figure BDA0002978293850000541
肺癌异种移植模型LU5250和LU5188的治疗效果。
将3x3x3mm3的LU5250或LU5188的肿瘤块接种到雌性NOD.SCID小白鼠中。随机分组当日被记录为第1天。在第1天开始治疗，肿瘤的平均体积分别为：LU5250136mm3和LU5188155mm3。6组小白鼠参与了每个异种移植模型的实验，给药方式和剂量请见表3。两种模型都在第21天被拆除。
表3
Figure BDA0002978293850000542
Figure BDA0002978293850000551
注：
a.编号：每组动物的数量。
b.根据每个动物的体重调整剂量体积。
c.随机分组当日记录为第1天。实施治疗当日记录为第1天。
d.对于每周两次的给药频率，在第1天，第4天，第8天，第11天，第15天，第18天和第21天给药。对于每四天一次的给药频率，在第1天，第5天，第9天，第13天，第17天，第21天给药。
e.对于组合治疗，首先给药化合物15，然后在一小时后给药伊立替康或紫杉醇。
f.如体重减少>20％，小白鼠需被移除并实施安乐死。
每周两次用卡尺在两个方向上测量肿瘤体积，以mm3为体积单位，使用公式V＝0.5a×b2(a和b为肿瘤垂直的长直径和短直径)。在Laminar Flow Cabinet中进行给药以及肿瘤和体重的测量。以下公式用于计算相对肿瘤体积(RTV)：RTV＝Vt/V1(V1和Vt分别是治疗开始当日(第1天)的平均肿瘤体积和特定时间点(第t天)的平均肿瘤体积)。以下公式用于计算协同分数(Clarke R.，Breast Cancer Research&Treatment,1997,46(2-3):255-278.)：协同分数＝((A/C)×(B/C))/(AB/C)；其中A是指对治疗A的反应；B是指对治疗B的反应；C是指对溶媒对照的反应；AB：A和B的联合用药组合治疗)。
用标准美国国家癌症研究所的方法计算肿瘤参数。以治疗的肿瘤的平均体积RTV(T)除以对照肿瘤的平均体积RTV(C)×100％，来计算相对肿瘤增殖率(％T/C)。T/C百分比值是一个抗肿瘤有效性的指标：T/C值<42％表示有显著的抗肿瘤活性。T/C值<10％表示有高度显著的抗肿瘤活性，并且这个T/C值被NCI用来证明临床试验的合理性，如果治疗方法达到了毒性和某些其他要求(称为DN-2水平活性)的话。体重减轻大于20％(组中的平均值)，或产生高于20％的药物死亡表示药剂毒性过高。
LU5250和LU5188的肿瘤生长曲线(平均肿瘤体积随时间的变化)分别在图8(a)、图8(b)、图9(a)和图9(b)中。肿瘤生长抑制的结果总结在下表4和表5中。LU5250和LU5188的平均体重变化结果分别显示在分别在图10(a)、图10(b)、图11(a)和图11(b)中。
表4.化合物15与紫杉醇或伊立替康的组合治疗在从SCLC患者中衍生出的异种移植物LU5250中的抗肿瘤活性
Figure BDA0002978293850000552
Figure BDA0002978293850000561
注解：
1.肿瘤相对体积(RTV):平均值±标准误差
2.相对肿瘤增殖率＝被治疗肿瘤的平均体积(TRTV)/对照肿瘤的平均体积(CRTV)×100％
表5.化合物15与紫杉醇或伊立替康的组合治疗在从SCLC患者中衍生出的异种移植物LU5188中的抗肿瘤活性
Figure BDA0002978293850000562
注：
1.肿瘤相对体积(RTV):平均值±标准误差
2.相对肿瘤增殖率＝被治疗肿瘤的平均体积(TRTV)/对照肿瘤的平均体积(CRTV)×100％
实验例8.化合物15在肺癌异种移植模型的治疗效果
实验评估了实验样品化合物15单独及其多种联合用药组合在对皮下NCI-H146肺癌异种移植模型的治疗效果。
将1x107 NCI-H146肿瘤细胞在0.1mL的磷酸盐缓冲液和基质胶(7:3)中预备处理后接种到雌性SCID小鼠中。随机分组当日被记录为第1天。在第1天开始治疗。8组小鼠参与了实验，给药方式和剂量请见表6。研究在第21天结束。用40只小鼠进行研究。所有动物被随机分配到8个不同的实验组。随机分组时平均肿瘤大小约为192mm3。
表6
Figure BDA0002978293850000571
Figure BDA0002978293850000581
注：
d.编号：每组动物的数量。
e.根据每个动物的体重调整剂量体积。
f.随机分组当日记录为第1天。实施治疗当日记录为第1天。
d.对于每周两次的给药频率，在第1天，第4天，第8天，第11天，第15天，第18天和第21天给药。对于每4天一次的给药频率，在第1天，第5天，第9天，第13天，第17天，第21天给药。对于每周一次的给药频率，在第一天，第8天和第15天给药。
g.对于联合用药的药物(第6、7、8组)，首先给药化合物15，然后在一小时后给药紫杉醇/伊立替康/顺铂。
肿瘤体积的测量和计算方法，以及肿瘤参数的计算方法同实施例7。图12(a)、图12(b)、图12(c)显示了8个不同组的肿瘤生长曲线(平均肿瘤体积随时间的变化)。肿瘤生长抑制的结果总结在表7中。接种肿瘤的小鼠的平均体重变化分别在图13(a)、图13(b)、图13(c)中。
表7.NCI-HI146模型中实验方法的抗肿瘤活性
Figure BDA0002978293850000591
注：
1.mRECIST(Gao H,Nature medicine,2015,21(11):1318):修改后的实体肿瘤反应评估标准；mRECIST_best:实验过程中的最佳反应；mRECIST_last:实验最后一天的反应
2,PR:部分缓解,CR:完整缓解,SD:疾病稳定,PD:疾病进展
实验例9.化合物31用于小细胞肺癌细胞系模型的体外研究
本研究的目的是测试化合物31与小细胞肺癌化疗药物组合治疗在人类小细胞肺癌细胞中的抗增殖和凋亡诱导作用。该研究中的化疗剂包括紫杉醇，顺铂，依托泊苷，伊立替康和拓扑替康。
使用Cell
Figure BDA0002978293850000601
发光细胞活力测定(CTG)和
Figure BDA0002978293850000602
3/7测定来分别评估化合物31作为单一药剂或和其它化疗药物组合使用时对抗增殖和诱导细胞凋亡作用。
Cell
Figure BDA0002978293850000603
(CTG)发光细胞活力测定采集在对数生长期的细胞。将10μL被稀释的药物溶液加入到96孔板中，同时将10μL的培养基加入到96孔的对照板中。对于组合实验，将5μL的指定测试试剂加入每个小孔中。在实验结束时，将96孔板平衡至室温，然后向每个小孔中加入30μL的CTG试剂(避光)以诱导细胞裂解。然后使用Biotek协作性H1酶标仪检测发光信号。使用对照组的复孔(空白)的平均发光值(LN)，并使用下式来计算细胞活力值(％)：
细胞活力百分比(％)＝(实验细胞荧光信号值-阴性对照细胞荧光信号值)/(对照细胞荧光信号值-阴性对照细胞荧光信号值)×100％。
使用Graphpad Prism 6.0软件(Golden software，Golden，Colorado，USA)绘制细胞存活曲线。对于组合药物实验，使用CalcuSyn软件(BIOSOFT，UK)计算组合指数(CI)以进一步分析所示药物的组合效果(Chou，Cancer research 70,440-446。)。CalcuSyn是一种专业的混合药物分析软件。它可以快速、准确地计算各种药物的相互作用，包括协同作用，叠加作用和拮抗作用。如果两种联合用药的CI值<1，表明这两种药物具有协同作用；如果CI值＝1，表明这两种药物具有叠加效应；如果CI值>1，表明这两种药物具有拮抗作用。
Figure BDA0002978293850000604
3/7测定中的测定试剂盒(Promega)用于定量测定药物或其组合诱导的细胞凋亡期间胱天蛋白酶3/7的活化。细胞接种和药物稀释的程序如上所述。用药物或药物组合来处理96孔板中的细胞，并在平衡至室温后再等30分钟。向每个小孔中加入
Figure BDA0002978293850000605
3/7试剂(避光)，充分混合以诱导细胞裂解。将96孔板在室温下再保持30分钟以稳定发光信号。使用Biotek协作性H1酶标仪检测发光信号。使用Graphpad Prism6.0软件4绘制半胱天冬酶3/7活化曲线。
小细胞肺癌细胞系可获自以下来源：(1)ATCC登录号HTB-119NCI-H69)；(2)上海生物化学与细胞生物学研究所(NCI-H446和NCI-H146)。细胞在37℃，含5％CO2的潮湿环境中培养。
本次实验的目的是评估化合物31作为一个单一的药剂或与其它化疗药物(包括紫杉醇，顺铂，依托泊苷，伊立替康和拓扑替康)的组合在小细胞肺癌细胞系NCI-H146、NCI-H69和NCI-H446中抑制细胞增殖/活力的作用。如图14、图15、图16、图17和图18所示，化合物31与紫杉醇、顺铂，依托泊苷，伊立替康或拓扑替康的组合对于肿瘤生长抑制的效果远大于单独使用化合物31或单独使用相应的化疗药物，从其响应曲线向左的移动可以看出。
基于图14、图15、图16、图17和图18中指定的组合的不同剂量可进一步计算组合指数(CI)。在所有被测试的细胞系中，化合物31与紫杉醇或拓扑替康的组合在较低浓度就取得了协同作用；而化合物31和顺铂，伊立替康或依托泊苷的组合在较高浓度才能观察到协同作用。
结果证实在人体小细胞肺癌细胞系中，化合物31与化疗药物的组合可以产生协同性的抗增殖作用。原始的剂量依赖的生长抑制曲线和组合指数值见图14、图15、图16、图17和图18。
发明人接着通过测量半胱天冬酶3/7激活来检测化合物31单独或与其它化疗药物的组合对诱导细胞凋亡的影响。
研究结果显示(见图19、图20、图21、图22、和图23)，在所有细胞系和被测试的药物中，药物治疗以剂量依赖的方式增加活化的(裂解的)半胱天冬酶3/7的浓度。药物组合得到的浓度明显高于单一药剂组得到的浓度，表明药物组合可以更有效地诱导细胞凋亡。有趣的是，在某些情况下，半胱天冬酶3/7的激活分两个阶段。在初始阶段的增加(组合组中以更高的强度增加)后，活化的半胱天冬酶3/7浓度达到瓶颈，并在后阶段开始下降。半胱天冬酶3/7的这种双阶段的激活在药物组合组中更为明显，并发生得更快。这符合药物组合联用引发更有效、更快的细胞凋亡的原理。
讨论：
在小细胞肺癌细胞系模型的体外研究中，发明人将化合物15与小细胞肺癌的标准化疗药物组合在一起，其中包括紫杉醇，拓扑替康，顺铂，依托泊苷和伊立替康。这些化学疗法通过抑制有丝分裂(紫杉醇)或对细胞添加遗传毒性(其他药物)来杀死癌细胞，从而下调抗调亡蛋白(例如Mcl-1在有丝分裂期间被紫杉醇抑制(Huang S，et al.Oncotarget,7(25)))或上调促凋亡蛋白(例如NOXA被拓扑异构酶1抑制剂伊立替康抑制(Okumura KJ,etal.Cancer Research,14(24)))。化合物15具有独特的作用机理。它可以靶向固有的过度表达的抗调亡蛋白，同时也可以克服标准化疗产生的潜在抗性，包括Bcl-2，Bcl-xL或Bcl-W的上调((Shi J et al.Cancer Research 71(13)；Bah N et al.Cell Death and Disease,5,e1291；doi:10.1038/cddis.2014.251.；Huang S,et al.Oncotarget,7(25)))。
发明人的研究表明，化合物31作为一个单独的药物分子对小细胞肺癌细胞增殖具有抑制作用。通过诱导半胱天冬酶3/7的活化，进而诱导细胞凋亡。化合物15与其它化学治疗药物的组合可以协同性地增强抑制作用，并且在体内可能更具有抗肿瘤活性。因此，化合物31与标准化疗药物的组合具有很大的小细胞肺癌的治疗潜力，值得进一步的临床试验。
实验例10.化合物15用于EGFR抑制剂耐药的患者
实验评估了实验样品化合物15联合顺铂或多西他赛组合在对皮下NCI-H1975-L858R-T790M-C797S NSCLC异种移植模型的治疗效果。
奥西莫替尼(AZD9291)是第三代表皮生长因子受体抑制剂，用于克服早期酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗产生的耐药性，这种耐药性通常与T790M突变的发生有关。然而，大多数患者在接受靶向治疗1-2年后，由于新的基因组异常，如C797S突变或EGFR基因外显子20插入，会出现疾病进展。杀死这些新获得的抗性细胞成为诊所的一个紧急挑战(Nagano，2018年“Mechanism of Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor-TyrosineKinase Inhibitors and a Potential Treatment Strategy.”Cell 15；7(11).piiE212)。
实验测试了化疗和化合物15联合应用是否在对奥西莫替尼有抗性的H1975 EGFRC797S的异种移植有效。在携带EGFR L858R/T790M/C797S突变的H1975 CDX模型中，该组合显示了协同抑制肿瘤进展的作用。
6组荷有NCI-H1975(EGFR L858R/T790M/C797S)肿瘤的NOD/SCID小鼠分别采用溶媒、化合物15、多西他赛、顺铂、化合物15与多西他赛联合或化合物15与顺铂联合的治疗。化合物15以100mg/kg的剂量，静脉给药，每周两次，共5次剂量。顺铂以5mg/kg的剂量,静脉给药，每周一次，共3次剂量。多西他赛以8mg/kg的剂量,静脉给药，每周一次共2次剂量。联合使用时，联合使用的药物按照各自单独给药时的剂量和给药频率给药。多西他赛单药治疗在第22天时显示抗肿瘤活性，T/C值为21.4％。化合物15与多西他赛联合治疗取得了显著的抗肿瘤活性，T/C值为5.3％。协同分数2.53(>1)显示协同组合效应。顺铂单药治疗显示中度抗肿瘤活性，第22天时T/C值为66.1％。化合物15与顺铂联合治疗达到协同抗肿瘤活性，T/C值为26.8％，协同分数为1.55(>1)。肿瘤体积的测量和计算方法，以及肿瘤参数的计算方法同实施例7。图24(a)、图24(b)显示了各试验方法组的肿瘤生长曲线(平均肿瘤体积随时间的变化)。
Figure BDA0002978293850000631
实验例11.化合物31或化合物15对胃癌细胞生长的影响和潜在机制研究
(1)胃癌细胞对化合物31的敏感性与Bcl-2，Bcl-xL和Bax的表达密切相关
首先，发明人通过蛋白印迹法分析了胃癌细胞株：AGS和NCI-N87(购自南京科佰生物科技有限公司)中Bcl-2家族蛋白的基础表达水平(图25)。AGS和NCI-N87是Bcl-2和Bcl-xL高表达，且Bax也高表达的细胞株。
发明人通过CCK-8测定细胞活力的方法评估了化合物31(由苏州亚盛医药提供)在胃癌细胞株增殖过程中的抑制作用，发现化合物31在72小时内以浓度依赖的方式抑制Bcl-2，Bcl-xL和Bax高表达的细胞株(AGS和NCI-N87)增殖。AGS和NCI-N87的IC50分别为1.146±0.56μM和0.9007±0.23μM(图26(a)和图26(b)，表9)。由此可见，胃癌细胞对化合物31的敏感性与Bcl-2，Bcl-xL和Bax的表达密切相关。
表9
细胞系 IC<sub>50</sub>(μM)
AGS 1.146±0.56
N87 0.9007±0.23
(2)化合物31对细胞周期无明显影响
发明人使用细胞周期检测试剂盒进行了细胞周期的检测，结果显示，化合物31对AGS和NCI-N87这两株胃癌细胞的细胞周期无明显影响(图27)。
(3)化合物15在体内随浓度增加能对胃癌细胞的增殖产生明显的抑制作用
为了评估化合物15在体内的抗肿瘤生长活性，发明人在裸鼠上构建了NCI-N87移植瘤模型，并且用不同剂量的化合物15通过尾静脉注射连续给药10天的方式处理携带NCI-N87移植瘤的裸鼠，在接种肿瘤细胞5周后，将小鼠处死取瘤进行实验。通过测量瘤体积大小发现，当剂量增加时，化合物15单药即可发挥显著的抑制肿瘤生长的作用，到达终点后，25mg/kg组和50mg/kg组小鼠的肿瘤体积生长至700mm3和800mm3，100mg/kg组小鼠肿瘤体积仅约400mm3，同时对照组达到约1300mm3(图28(a))，四组之间有显著差异。
处死小鼠后取出瘤组织也能发现，移植瘤的重量和大小随着给药浓度梯度的增加也有较为明显的减小趋势(图28(b)和图28(c))。另一方面，通过对小鼠自身体重的测量，四组之间的体重没有明显差异(图28(d))，这提示化合物15有着较为安全的给药剂量窗。
发明人将取出的瘤组织提取蛋白和包埋制作切片，可以看到随着剂量的增加，瘤组织蛋白中Cleaved-caspase3和PARP-1断裂带的蛋白质表达量逐渐升高(图28(e))。免疫组织化学染色显示随着浓度梯度增加，在100mg/kg组中Ki67阳性细胞的百分比明显低于其他组(图28(f))，提示了化合物15在体内对胃癌细胞增殖的抑制作用。
实验例12化合物15或化合物31联合5-氟尿嘧啶对胃癌细胞生长的影响和潜在机 制
(1)化合物31与5-FU联合增强了诱导胃癌细胞发生凋亡的效果
发明人选择了临床上最常见的化疗药物之一5-氟尿嘧啶(5-FU)与化合物31联合。为了探究化合物31联合5-FU对胃癌细胞生长的影响和潜在机制，发明人使用了膜联蛋白V/PI染色来检测指定浓度的化合物31(0.3μm)、5-FU(3μm)和联合组处理48小时后的AGS和NCI-N87两株胃癌细胞的凋亡情况。在AGS细胞中，用化合物31或5-FU单药处理分别导致约22％和15％的凋亡率，而联合组，凋亡细胞的比例增加到54％(图29(a))；在NCI-N87细胞中，联合组也比单药处理组获得更高的凋亡率，化合物31或5-FU单药处理导致的凋亡率分别为24％和18％，而联合组达到46％的凋亡率(图29(a))。
同时，通过蛋白印迹法显示，与任何单药处理组相比，无论是AGS还是NCI-N87胃癌细胞中联合组的Cleaved-caspase3和PARP-1断裂带的增加都更为显著(图29(b))。这些结果提示，在AGS和NCI-N87两株胃癌细胞中，化合物31与5-FU联合增强了诱导胃癌细胞发生凋亡的效果。
(2)化合物15联合5-FU在体内通过诱导凋亡发生更有效地发挥了对胃癌细胞增殖的抑制作用
为了评估化合物15联合5-FU在体内的抗肿瘤生长活性，发明人在裸鼠上构建了NCI-N87移植瘤模型，将小鼠分为对照组、化合物15(50mg/kg qd)、5-FU(25mg/kg)、联合组4组，并且采用化合物15通过尾静脉注射连续给药10天，5-FU通过尾静脉注射每周给药一次连续给两周的方式处理携带异种移植物的裸鼠，在接种肿瘤细胞5周后，将小鼠处死取瘤进行实验。在任何不同的测量时间内，联合组的肿瘤体积显著小于其他各组，到达终点后，化合物15组和5-FU组小鼠的肿瘤体积生长至1600mm3和2200mm3，联合组小鼠肿瘤体积仅约1000mm3，同时对照组达到约2600mm3(图30(a))，四组之间有显著差异。
处死小鼠后取出瘤组织也能发现，移植瘤的重量和大小在联合组和其余各组之间也有明显差异，联合组明显小于其余各组(图30(b)和图30(c))。另一方面，通过对小鼠自身体重的测量，四组之间的体重没有明显差异，化合物15组和联合组经过短暂的体重下降波动后回升(图30(d))，提示化合物15有着较为可靠的安全联用剂量。
发明人将取出的瘤组织包埋制作切片，使用TUNEL试剂盒和免疫组织化学法检测，联合组中的TUNEL阳性细胞明显多于其余各组(图30(e))；与其他各组相比，联合组中Cleaved-caspase3的表达也明显提高(图30(f))，这些都提示化合物15联合5-FU在体内更有效地诱导胃癌细胞发生了凋亡。联合组中Ki67阳性细胞的百分比也显著低于化合物15组、5-FU组以及对照组(图30(f))，提示化合物15联合5-FU在体内更有效地发挥了对胃癌细胞增殖的抑制作用。
实验例13化合物31联合多西他赛(TXT)对胃癌细胞生长的影响
通过基于水溶性四唑盐(WST)的CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验检测抗增殖作用。简而言之，将NCI-N87细胞接种于96孔板中，并用不同浓度的化合物31处理72小时。为了测试化合物31与多西他赛之间的协同效应，在每个孔中加入0.001nM、0.1nM或10nM浓度的多西他赛。每个处理做3个复孔。处理结束后，向96孔板中加入CCK-8试剂(10μL/孔)，并与细胞一起培养2小时。使用酶标仪检测OD450值。通过下列公式使用复孔的平均OD值计算细胞存活率百分比：
(O.D.测试孔–O.D.空白对照孔)/(O.D.细胞对照孔-O.D.空白对照孔)×100％。使用Graphpad Prism 6.0软件(Golden software,Golden,USA)计算IC50值。结果如图31所示。
由图31可知，化合物31在NCI-N87细胞中的IC50值为0.405μM。当用0.001nM、0.1nM或10nM浓度的多西他赛共同处理细胞时，IC50值降至0.012、0.014和0.004μM。IC50值的显著性降低表明，化合物31和多西他赛在NCI-N87细胞中具有强烈的协同抗增殖活性。
实验例14化合物31联合帕比司他(panobinostat)对胃癌细胞生长的影响
通过基于水溶性四唑盐(WST)的CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验检测抗增殖作用。简而言之，将HGC-27细胞接种于96孔板中，并用不同浓度的化合物31、帕比司他或化合物31+帕比司他联合处理24小时。处理结束后，向96孔板中加入CCK-8试剂(10μL/孔)，并与细胞一起培养2小时。计算各个浓度下每个处理组的细胞活率，结果如图32所示。
由图32可知，与单独使用化合物31或帕比司他处理细胞相比，用不同浓度的化合物31+帕比司他联合共同处理细胞使得细胞活率降低得更为显著，化合物31+帕比司他联合处理在HGC-27细胞中具有更为强烈的抗增殖活性。

Claims (9)

1.一种药物组合物，其特征在于，包含Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物以及药学上可接受的载体；所述Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂具有下述结构式：
Figure FDA0002978293840000011
所述化疗药物选自多西他赛、紫杉醇、伊立替康、顺铂。
2.如权利要求1中所述的药物组合物，其中所述化疗药物为多西他赛。
3.如权利要求1中所述的药物组合物，其中所述化疗药物为紫杉醇。
4.Bcl-2/Bcl-xL抑制剂和化疗药物在制备治疗癌症药物中的应用，所述Bcl-2/Bcl-Xl抑制剂具有下述结构式：
Figure FDA0002978293840000012
所述化疗药物选自多西他赛、紫杉醇、伊立替康、顺铂。
5.如权利要求4所述的应用，所述癌症为小细胞肺癌，所述化疗药物选自伊立替康、紫杉醇、顺铂。
6.如权利要求4所述的应用，所述癌症为对EGFR抑制剂耐药的非小细胞肺癌，所述癌症的特征在于表达突变的EGFR，所述EGFR具有以下突变：L858R、T790M和C797S，所述化疗药物选自顺铂、多西他赛。
7.如权利要求4所述的应用，所述癌症为结肠癌，所述化疗药物为伊立替康。
8.如权利要求4-7中任一项所述的应用，其中所述癌症是转移性的实体瘤。
9.如权利要求4-7中任一项所述的应用，其中所述癌症是Bcl-2/Bcl-xL和Bax阳性的。
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