CN113018312A - 一种降低肿瘤辐射抗性的纳米放疗增敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种降低肿瘤辐射抗性的纳米放疗增敏剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低肿瘤辐射抗性的纳米放疗增敏剂及其制备方法和应用，所述纳米放疗增敏剂包含Pt粒子、人血清白蛋白(HSA)和肉桂醛(CA)，其中人血清白蛋白分别与Pt粒子和肉桂醛键合。本发明的Pt@HSA/CA纳米材料体系，肉桂醛通过基团‑C＝N‑与HSA结合，因此可在血液循环过程中保护肉桂醛，并将其递送至肿瘤部位，并在微酸环境下释放，以诱导氧化应激，从而为铂催化反应的进行提供额外的过氧化氢，以缓解肿瘤细胞乏氧，并中和还原性物质。因此能够通过从两种途径协同降低肿瘤的辐射抗性，以协同提高高原子序数元素铂纳米簇的放疗增敏能力。

Description

一种降低肿瘤辐射抗性的纳米放疗增敏剂及其制备方法和 应用
本申请要求享有申请人于2021年1月11日向国家知识产权局提交的申请号为202110033309.0，名称为“一种降低肿瘤辐射抗性的纳米放疗增敏剂及其制备方法和应用”的中国发明专利在先申请的优先权。该在先申请的全文以引用的方式结合至本文中。
技术领域
本发明涉及肿瘤放疗技术领域，特别是涉及一种降低肿瘤辐射抗性的纳米放疗增敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
放射治疗(“放疗”)是常规肿瘤治疗方法中的一种主要手段，在癌症治疗中发挥了重要作用。据报道，超过50％的癌症患者接受放疗或采用放疗与其他疗法相结合的方式进行治疗。然而，放疗的疗效受到多种因素的制约。首先，放疗会对电离辐射途径上的正常组织造成损伤，导致毒副作用；其次，肿瘤的乏氧环境会引起肿瘤对于电离辐射的抗性；最后，肿瘤细胞中高浓度的还原性物质如谷胱甘肽会显著淬灭放疗过程中产生的活性氧。针对放疗过程中存在的上述问题，研究者们开发了各种纳米体系以增强放疗疗效。刘庄教授报道了一种装载有全氟化碳的中空硒化铋纳米粒子，该纳米粒子可以吸收X射线和近红外光，实现放疗增敏和光热治疗。同时，该体系在近红外光的照射下产生的热量使得全氟化碳吸收的氧气发生爆发式的释放，以提高肿瘤部位的氧合水平，从而降低辐射抗性，进一步提高了放疗的疗效。赵宇亮院士，谷战军研究员和刘向峰教授开发了一种异质结结构的WO2.9-WSe2纳米放疗增敏剂，该纳米粒子具有很强的X射线衰减能力和近红外吸收能力，可实现放疗增敏以及光热治疗，轻度的高温不仅可以在一定程度上诱发肿瘤部位局部的免疫原性细胞死亡，同时还可以增加血液流量，以改善肿瘤部位的氧合水平，从而增强放疗的疗效。然而，尽管上述方法在一定程度上缓解了肿瘤部位的乏氧状态，但是，氧气载体在血液循环过程中会不可避免的发生氧气泄漏，从而降低递送至肿瘤部位的氧气含量，影响肿瘤部位乏氧状态的缓解程度。
虽然已有催化肿瘤细胞中过氧化氢原位分解产生氧气的研究，但作为催化产氧的原料，仍存在肿瘤细胞中过氧化氢的含量不足的问题。除此之外，肿瘤细胞中还原性物质对放疗的杀伤作用仍然存在很大的影响。
发明内容
为了改善上述问题，本发明提供一种结合物，包含Pt粒子、人血清白蛋白(HSA)和肉桂醛(CA)，其中人血清白蛋白分别与Pt粒子和肉桂醛键合。
根据本发明的实施方案，所述Pt粒子为Pt纳米粒子。优选地，所述Pt粒子外表面的至少一部分与人血清白蛋白键合。更优选地，所述人血清白蛋白还与肉桂醛键合。
根据本发明的实施方案，所述Pt粒子与人血清白蛋白通过配位作用连接，例如，可通过Pt-O和/或Pt-N的配位作用连接。
根据本发明的实施方案，所述人血清白蛋白与肉桂醛通过基团-C＝N-连接。
根据本发明的实施方案，所述结合物中，Pt粒子的质量百分比可以为65～75％，优选为65～70％。
根据本发明的实施方案，所述结合物中，人血清白蛋白的质量百分比可以为20～35％，优选为28～33％。
根据本发明的实施方案，所述结合物中，肉桂醛的质量百分比可以为1～2％，优选为1.2～1.8％。
根据本发明的实施方案，所述结合物为纳米放疗增敏剂。
本发明还提供上述结合物的制备方法，包括将Pt粒子、人血清白蛋白和肉桂醛混合反应，制得所述结合物。
根据本发明的实施方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将Pt粒子与人血清白蛋白反应；
(2)将步骤(1)得到的产品与肉桂醛反应。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中：
优选地，所述反应在氯铂酸的存在下进行。
优选地，所述人血清白蛋白和氯铂酸均以溶液形式加入反应体系中。例如，先分别配制人血清白蛋白和氯铂酸的水溶液，再将两种溶液混合，得到混合溶液。
根据本发明的实施方案，所述人血清白蛋白水溶液的浓度为40～60mg/mL，示例性为40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL，优选为50mg/mL。
根据本发明的实施方案，所述氯铂酸水溶液的浓度为6～10mg/mL，示例性为6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL，优选为8mg/mL。
根据本发明的实施方案，所述人血清白蛋白(HSA)与氯铂酸的质量比为10:(0.5～5)，优选为10:(0.8～3)。
根据本发明的实施方案，所述反应的温度为60～100℃，优选为70～90℃，示例性为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。
根据本发明的实施方案，所述反应的时间为1～4h，示例性为1h、2h、3h、4h，优选为2h。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中：还包括待反应结束后，对反应体系进行固液分离得到反应产物的过程。例如，所述固液分离可以采用本领域已知手段，比如超滤离心。优选地，所述超滤离心管的截留分子量可以为20～40kDa，示例性为20kDa、30kDa、40kDa，优选为30kDa。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中：还包括对固液分离得到的反应产物进行洗涤。例如，向反应产物中加水稀释后再次超滤离心。又如，所述洗涤的次数可以为一次、两次或更多次，优选为三次。
根据本发明的实施方案，步骤(1)中：还包括将洗涤后的产品加水稀释的步骤。例如，稀释至产品浓度为1～5mg/mL，示例性为1mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL，优选为2.5mg/mL。
根据本发明的实施方案，步骤(2)中：
优选地，步骤(1)得到的产品水溶液和肉桂醛在丙酮中反应。优选地，先将肉桂醛溶解于丙酮中，再与步骤(1)得到的产品水溶液混合。
根据本发明的实施方案，肉桂醛与丙酮按照体积比为1:(20～80)混合，示例性为1:20、1:50、1:80，优选为1:50。
根据本发明的实施方案，步骤(1)得到的产品水溶液和肉桂醛丙酮溶液的体积比为100:(0.1～5)，优选为10:(0.5～3)。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括对上述混合溶液进行搅拌。例如，搅拌的时间为24h以上；示例性为24h、30h、36h、48h，优选为24h。进一步地，搅拌的温度为40℃以下；例如，搅拌的温度为35℃、30℃、室温。
根据本发明的实施方案，所述制备方法还包括对反应液进行纯化以去除未反应的试剂。例如，所述纯化可以为透析。优选地，所述透析溶剂为pH 7.0～7.5的PBS缓冲液，优选为pH 7.4的PBS缓冲液。进一步地，透析时间为1～4天，示例性为1天、2天、3天、4天，优选为3天。
根据本发明示例性的实施方案，所述制备方法包括如下步骤：
1)Pt@HSA纳米粒子的制备：将人血清白蛋白溶解在超纯水中，在搅拌下将氯铂酸加入至HSA溶液中，随后将混合溶液搅拌反应；待反应结束后将其冷却至室温，并转移至超滤管中离心以去除未反应的试剂，去除滤过液后加超纯水稀释，重复多次；随后加入超纯水将其稀释备用；
2)Pt@HSA/CA的制备：将肉桂醛溶解于丙酮中，在搅拌下将其缓慢加入步骤1)制得的Pt@HSA溶液中，室温下搅拌24小时，然后将反应液在PBS缓冲液中透析以去除未反应的试剂。
本发明还提供上述结合物在制备肿瘤放射性治疗增敏剂中的应用。
优选地，所述放射性治疗为利用放射性同位素产生的α、β、γ射线，X射线，电子线，或质子束进行治疗。更优选地，利用放射性同位素产生X射线进行治疗。
本发明还提供一种肿瘤放射性治疗的方法，将所述结合物作为肿瘤放射性治疗的增敏剂。
本发明的有益效果:
铂是高原子序数的元素，可以有效的吸收电离辐射的能量，增加局部辐射剂量，具有放疗增敏能力。该体系通过EPR效应富集到肿瘤部位，在肿瘤微酸环境下可发生化学键的断裂，释放出肉桂醛(CA)，诱导肿瘤细胞产生活性氧。一方面减少了还原性物质对放疗产生的活性氧的淬灭，另一方面，活性氧中的过氧化氢可被铂催化分解为氧气，降低了乏氧导致的辐射抗性。
基于上述发现，本发明具有如下优势：
(1)本发明的Pt@HSA/CA纳米材料体系，肉桂醛通过基团-C＝N-与HSA结合，因此可在血液循环过程中保护肉桂醛，并将其递送至肿瘤部位，并在微酸环境下释放，以诱导氧化应激，从而为铂催化反应的进行提供额外的过氧化氢，以缓解肿瘤细胞乏氧，并中和还原性物质。因此能够通过两种途径协同降低肿瘤的辐射抗性，以协同提高高原子序数元素铂纳米簇的放疗增敏能力。
(2)铂是一种高原子序数的元素，能够比软组织更好的吸收电离辐射的能量。当铂受到电离辐射时，铂原子与电离辐射的相互作用会产生光电效应，康普顿效应等，从而发射出光电子、康普顿电子等。一方面，光电子、康普顿电子等可直接造成DNA损伤，对肿瘤细胞造成杀伤；另一方面，铂纳米材料在X射线作用下，可以加速肿瘤细胞中活性氧的生成，以诱导细胞凋亡。因此，铂纳米材料可以增强放疗的疗效。除此之外，铂纳米材料具有优异的催化能力，可催化肿瘤细胞中过氧化氢的分解，产生氧气。
(3)肉桂醛是一种FDA批准的食品添加剂，并具有多种药理活性如抗微生物，抗炎等。肉桂醛已被证实可以有效破坏肿瘤细胞的氧化还原稳态。作为一种氧化治疗剂，肉桂醛可以通过提高细胞内活性氧水平增强氧化应激，一方面降低了细胞内还原性物质对活性氧的中和，使得放疗产生的活性氧更好的破坏肿瘤细胞；另一方面提高了肿瘤细胞内过氧化氢的含量，为铂的催化提供了更多的原料，有效的缓解肿瘤部位的乏氧。
附图说明
图1为Pt@HSA/CA纳米粒子的制备流程图及CA释放示意图。
图2为Pt@HSA/CA纳米粒子的透射电子显微镜表征图。
图3为Pt@HSA/CA纳米粒子对过氧化氢的催化性能结果图。
图4为不同浓度的PBS，CA，Pt@HSA和Pt@HSA/CA纳米粒子的细胞毒性实验结果图。
图5为PBS，CA，Pt@HSA和Pt@HSA/CA纳米粒子诱导活性氧产生的测试结果图。
图6为PBS，Pt@HSA，Pt@HSA/CA，PBS+X-ray，Pt@HSA+X-ray和Pt@HSA/CA+X-ray的放疗增敏性能结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
Pt@HSA/CA纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)Pt@HSA纳米粒子的制备：将500mg人血清白蛋白(HSA)完全溶解在10mL超纯水中，在搅拌条件下，将6mL 8mg/mL的氯铂酸溶液加入至HSA溶液中，随后将混合溶液置于80℃油浴下搅拌，反应2小时。反应结束后将其冷却至室温，转移至50mL 30kDa的超滤管中离心以去除未反应的试剂，去除滤过液后加超纯水稀释，重复3次。随后加入超纯水将其定容至10mL备用；
2)Pt@HSA/CA的制备：将2μL肉桂醛(CA)溶解于100μL丙酮中，在搅拌条件下，将其缓慢加入10mL 2.5mg/mL的Pt@HSA溶液中，室温下搅拌24小时。将反应液在pH 7.4的PBS缓冲液中透析3天以去除未反应的试剂。
通过ICP法测得Pt@HSA/CA中Pt粒子的质量百分比，通过紫外可见光谱法分别检测透析液中未反应的人血清白蛋白(HSA)、肉桂醛(CA)的浓度以计算出HSA、CA的质量百分比。
由上述方法测得：本实施例制得的Pt@HSA/CA结合物中，Pt粒子的质量百分比为67.1％，人血清白蛋白的质量百分比为31.6％，肉桂醛的质量百分比为1.3％。
通过透射电子显微镜观察Pt@HSA/CA纳米粒子的结构与粒径，结果如图2所示。
通过紫外-可见分光光度计测定纳米粒子的催化能力。
1.纳米粒子的催化性能检测
TMB是常见的过氧化氢酶发色底物，通过TMB的发色反应可以验证纳米粒子的催化性能。具体实验方法如下：
1)将2mL 1.6mM的TMB溶液与2mL 0.5M的过氧化氢溶液混合后，进行紫外吸收光谱测试；
2)向上述混合液中加入1mL 2.5mg/mL的Pt@HSA/CA溶液，5分钟后再次进行紫外吸收光谱测试；
3)随后向步骤2)的混合液中加入1mL 2M的H2SO4终止，5分钟后进行紫外吸收光谱测试。
图3中结果显示：在过氧化氢存在下，Pt@HSA/CA纳米粒子可催化TMB发生氧化反应，生成蓝色产物，其在625nm和370nm处有最大吸光度特征吸收峰；而加入H2SO4终止反应后，会进一步反应生成黄色的二亚胺，其在450nm处有吸收峰。由此可知：本发明制得的Pt@HSA/CA纳米粒子具有与过氧化氢酶类似的催化性能。
2.细胞毒性实验
将HepG2细胞接种在96孔板中并在细胞培养箱中培养24小时(培养条件为本领域公知的方法)。然后将不同浓度的PBS(pH 7.4)，CA，Pt@HSA和Pt@HSA/CA分别加入孔中并继续孵育6小时。使用剂量为4Gy的X射线对细胞进行照射，随后继续培养18小时。加入MTT溶液培养4小时后，加入DMSO。
使用酶标仪检测加入不同浓度的PBS，CA，Pt@HSA和Pt@HSA/CA后细胞混合液的吸光度，结果如图4所示。图4中结果显示：浓度为200μg/mL的Pt@HSA/CA+X射线组的细胞杀伤效果达到76.95％。
3.诱导活性氧产生测试
将HepG2接种在6孔板中并在细胞培养箱中培养24小时(培养条件为本领域公知的方法)。然后将PBS(pH 7.4)，浓度为50μg/mL的CA，Pt@HSA，Pt@HSA/CA分别加入孔中并孵育6小时。吸出培养液，使用PBS洗涤三次，加入含DCFH-DA的培养基孵育30分钟，随后进行X射线照射。
使用荧光显微镜对孵育后的细胞进行观察，结果如图5所示。由图中结果可知：Pt@HSA/CA+X射线组的荧光强度最高，由此表明在X射线作用下，Pt@HSA/CA纳米材料可以加速肿瘤细胞中活性氧的生成，以诱导细胞凋亡，从而能够增强放疗的疗效。
4.抑瘤实验
将小鼠随机分为六组(PBS，Pt@HSA，Pt@HSA/CA，PBS+X-ray，Pt@HSA+X-ray和Pt@HSA/CA+X-ray)。在肿瘤体积达到150mm3后，通过尾静脉分别将100μL PBS(pH 7.4)，Pt@HSA(2mg/mL)和Pt@HSA/CA(2mg/mL)注射到小鼠体内。注射4小时后，使用剂量为4Gy的X射线照射小鼠。每隔两天测量肿瘤体积，并绘制肿瘤体积变化曲线，结果如图6所示。图中结果从动物水平上证明本发明的Pt@HSA/CA纳米材料具有较高的放疗增敏效果。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种结合物，其特征在于，所述结合物包含Pt粒子、人血清白蛋白(HSA)和肉桂醛(CA)，其中人血清白蛋白分别与Pt粒子和肉桂醛键合。
优选地，所述Pt粒子为Pt纳米粒子。
优选地，所述Pt粒子外表面的至少一部分与人血清白蛋白键合。更优选地，所述人血清白蛋白还与肉桂醛键合。
优选地，所述Pt粒子与人血清白蛋白通过配位作用连接。例如，可通过Pt-O和/或Pt-N的配位作用连接。
优选地，所述人血清白蛋白与肉桂醛通过基团-C＝N-连接。
2.如权利要求1所述的结合物，其特征在于，所述结合物中，Pt粒子的质量百分比可以为65～75％，优选为65～70％。
优选地，所述结合物中，人血清白蛋白的质量百分比可以为20～35％；
优选地，所述结合物中，肉桂醛的质量百分比可以为1～2％；
优选地，所述结合物为纳米放疗增敏剂。
3.权利要求1或2所述结合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将Pt粒子、人血清白蛋白和肉桂醛混合反应，制得所述结合物。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将Pt粒子与人血清白蛋白反应；
(2)将步骤(1)得到的产品与肉桂醛反应。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：所述反应在氯铂酸的存在下进行。
优选地，所述人血清白蛋白和氯铂酸均以溶液形式加入反应体系中。例如，先分别配制人血清白蛋白和氯铂酸的水溶液，再将两种溶液混合，得到混合溶液。
优选地，所述人血清白蛋白水溶液的浓度为40～60mg/mL。
优选地，所述氯铂酸水溶液的浓度为6～10mg/mL。
5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述人血清白蛋白(HSA)与氯铂酸的质量比为10:(0.5～5)；
优选地，所述反应的温度为60～100℃，优选为70～90℃。
优选地，所述反应的时间为1～4h。
6.如权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：还包括待反应结束后，对反应体系进行固液分离得到反应产物的过程。例如，所述固液分离可以为超滤离心。
优选地，所述超滤离心管的截留分子量可以为20～40kDa。
优选地，步骤(1)中：还包括对固液分离得到的反应产物进行洗涤。例如，向反应产物中加水稀释后再次超滤离心。又如，所述洗涤的次数可以为一次、两次或更多次，优选为三次。
优选地，步骤(1)中：还包括将洗涤后的产品加水稀释的步骤。例如，稀释至产品浓度为1～5mg/mL。
7.如权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：步骤(1)得到的产品水溶液和肉桂醛在丙酮中反应。
优选地，先将肉桂醛溶解于丙酮中，再与步骤(1)得到的产品水溶液混合。
优选地，肉桂醛与丙酮按照体积比为1:(20～80)混合。
优选地，步骤(1)得到的产品水溶液和肉桂醛丙酮溶液的体积比为100:(0.1～5)，优选为10:(0.5～3)。
优选地，所述制备方法还包括对上述混合溶液进行搅拌。例如，搅拌的时间为24h以上。优选地，所述搅拌的温度为40℃以下。
优选地，所述制备方法还包括对反应液进行纯化以去除未反应的试剂。例如，所述纯化可以为透析。
优选地，所述透析溶剂为pH 7.0～7.5的PBS缓冲液。
优选地，透析时间为1～4天。
8.如权利要求3-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)Pt@HSA纳米粒子的制备：将人血清白蛋白溶解在超纯水中，在搅拌下将氯铂酸加入至HSA溶液中，随后将混合溶液搅拌反应；待反应结束后将其冷却至室温，并转移至超滤管中离心以去除未反应的试剂，去除滤过液后加超纯水稀释，重复多次；随后加入超纯水将其稀释备用；
2)Pt@HSA/CA的制备：将肉桂醛溶解于丙酮中，在搅拌下将其缓慢加入步骤1)制得的Pt@HSA溶液中，室温下搅拌24小时，然后将反应液在PBS缓冲液中透析以去除未反应的试剂。
9.权利要求1-2任一项所述的结合物和/或权利要求3-7任一项所述的制备方法制得的结合物在制备肿瘤放射性治疗增敏剂中的应用。
优选地，所述放射性治疗为利用放射性同位素产生的α、β、γ射线，X射线，电子线，或质子束进行治疗。更优选地，所述放射性治疗为利用放射性同位素产生X射线进行治疗。
10.一种肿瘤放射性治疗的方法，其中将权利要求1-2任一项所述的结合物和/或权利要求3-7任一项所述的制备方法制得的结合物作为肿瘤放射性治疗的增敏剂。
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