CN113016613B - 利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基为1/2MS、氯化钙水溶液。氯化钙水溶液的浓度为4.40 g/500mL，用量为75~100 mL。氯化钙水溶液的用量为25~100 mL。第一培养基为0.3 mg/LNAA、20.0 g/L蔗糖、4.0 g/L琼脂粉、0.5 g/L活性炭。本发明通过添加外源钙离子调节大叶千斤拔活性成分的积累，可有效提高大叶千斤拔组培苗中染料木苷和染料木素的含量。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物繁育技术领域。更具体地说，本发明涉及一种利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法。
背景技术
大叶千斤拔(Flemingia macrophylla(Willd.) Merr.，又名大猪尾、千斤力、千金红、红药头和白马屎等，是西南少数民族常用的民族民间药物，常应用于壮族、哈尼族、瑶族、傣族等民族药，具有很高的营养和药用价值，是药食两用植物。性甘、微温、平，具有抗炎、镇痛、止血、化淤的功效。大叶千斤拔为目前市场上千斤拔药材的主流品种之一，为妇科千金片、金鸡胶囊、壮腰健肾丸等中成药的主要原料。目前大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量较低，影响大叶千斤拔的利用率。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，其通过添加外源钙离子调节大叶千斤拔活性成分的积累，可有效提高大叶千斤拔染料木苷和染料木素的含量。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基包括1/2MS、氯化钙水溶液。
优选的是，氯化钙水溶液的浓度为4.40 g/500mL，用量为5~150 mL。
优选的是，氯化钙水溶液的用量为25~100 mL。
优选的是，第一培养基还包括0.3 mg/LNAA+20.0 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂粉+0.5g/L活性炭。
优选的是，培养条件为：温度为25~28℃，光照时间为10~14h/d，60d。
优选的是，在第一培养基中培养结束后，将大叶千斤拔组培苗置于第二培养基中培养，第二培养基包括1/2MS、0.1 mg/L萘乙酸、1 mg/L赤霉素、5 g/L蔗糖、4.0 g/L琼脂粉、0.5 g/L活性炭、2 g/L生姜提取物，其中，生姜提取物的制备方法为：
S1、将生姜置于60℃条件下烘干并粉碎，得到姜粉；
S2、取姜粉总质量10倍量的95%的乙醇溶液、2倍量的丙酮、1倍量的N,N-二甲基甲酰胺、0.01倍量的二甲亚砜混合，并加入姜粉总质量0.1倍量的质量分数为15%的有机酸、0.01倍量的乙酸酐，搅拌15min，得到第一混合溶液；
S3、将姜粉加入第一混合溶液中，并置于60℃条件下加热12 h，过滤除去滤渣并浓缩滤液，得到浓缩物；
S4、将浓缩物进行柱层析，洗脱体系为乙酸乙酯-石油醚体系，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为10~12:1的洗脱液，并浓缩，得到生姜提取物。
有机酸为质量比为1:1的柠檬酸和苹果酸。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，其通过添加外源钙离子调节大叶千斤拔活性成分的积累，可有效提高大叶千斤拔染料木苷和染料木素的含量，进而实现提高大叶千斤拔的利用率。
第二、本发明通过将大叶千斤拔组培苗置于第二培养基培养及在第二培养基中添加生姜提取物，可有效促进大叶千斤拔组培苗的生根，便于后期大叶千斤拔组培苗的移栽，本发明中生姜提取物的制备方法能够有效提高生姜提取物中有效成分的含量，促进大叶千斤拔组培苗的生根。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例的大叶千斤拔组培苗中染料木苷的含量图；
图2为本发明其中一个实施例的大叶千斤拔组培苗中染料木素的含量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基包括1/2MS、氯化钙水溶液。
氯化钙水溶液的浓度为4.40 g/500mL。
氯化钙水溶液的用量为25 mL。
第一培养基还包括0.3 mg/LNAA+20.0 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂粉+0.5 g/L活性炭。
培养条件为：温度为25~28℃，光照时间为10h/d，60d。
<实施例2>
利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基包括1/2MS、氯化钙水溶液。
氯化钙水溶液的浓度为4.40 g/500mL。
氯化钙水溶液的用量为50 mL。
第一培养基还包括0.3 mg/LNAA+20.0 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂粉+0.5 g/L活性炭。
培养条件为：温度为25~28℃，光照时间为10h/d，60d。
<实施例3>
利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基包括1/2MS、氯化钙水溶液。氯化钙水溶液的浓度为4.40 g/500mL。
氯化钙水溶液的用量为75 mL。
第一培养基还包括0.3 mg/LNAA+20.0 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂粉+0.5 g/L活性炭。
培养条件为：温度为25~28℃，光照时间为10h/d，60d。
<实施例4>
利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基包括1/2MS、氯化钙水溶液。氯化钙水溶液的浓度为4.40 g/500mL。
氯化钙水溶液的用量为100 mL。
第一培养基还包括0.3 mg/LNAA+20.0 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂粉+0.5 g/L活性炭。
培养条件为：温度为25~28℃，光照时间为10h/d，60d。
<实施例5>
利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基包括1/2MS、氯化钙水溶液。
氯化钙水溶液的浓度为4.40 g/500mL。
氯化钙水溶液的用量为75 mL。
第一培养基还包括0.3 mg/LNAA+20.0 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂粉+0.5 g/L活性炭。
培养条件为：温度为25~28℃，光照时间为10h/d，60d。
在第一培养基中培养结束后，将大叶千斤拔组培苗置于第二培养基中培养，第二培养基包括1/2MS、0.1 mg/L萘乙酸、1 mg/L赤霉素、5 g/L蔗糖、4.0 g/L琼脂粉、0.5 g/L活性炭、2 g/L生姜提取物，其中，生姜提取物的制备方法为：
S1、将生姜置于60℃条件下烘干并粉碎，得到姜粉；
S2、取姜粉总质量10倍量的95%的乙醇溶液、2倍量的丙酮、1倍量的N,N-二甲基甲酰胺、0.01倍量的二甲亚砜混合，并加入姜粉总质量0.1倍量的质量分数为15%的有机酸、0.01倍量的乙酸酐，搅拌15min，得到第一混合溶液；
S3、将姜粉加入第一混合溶液中，并置于60℃条件下加热12 h，过滤除去滤渣并浓缩滤液，得到浓缩物；
S4、将浓缩物进行柱层析，洗脱体系为乙酸乙酯-石油醚体系，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为10~12:1的洗脱液，并浓缩，得到生姜提取物。
有机酸为质量比为1:1的柠檬酸和苹果酸。
<实施例6>
利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基包括1/2MS、氯化钙水溶液。
氯化钙水溶液的浓度为4.40 g/500mL。
氯化钙水溶液的用量为75 mL。
第一培养基还包括0.3 mg/LNAA+20.0 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂粉+0.5 g/L活性炭。
培养条件为：温度为25~28℃，光照时间为10 h/d，60d。
在第一培养基中培养结束后，将大叶千斤拔组培苗置于第二培养基中培养（培养条件采用现有技术，参见 在第一培养基中培养），第二培养基包括1/2MS、0.1 mg/L萘乙酸、1mg/L 赤霉素、5 g/L蔗糖、4.0 g/L琼脂粉、0.5 g/L活性炭、2 g/L生姜提取物，其中，生姜提取物的制备方法为：
S1、将生姜置于60℃条件下烘干并粉碎，得到姜粉；
S2、取姜粉总质量10倍量的95%的乙醇溶液、2倍量的丙酮、1倍量的N,N-二甲基甲酰胺、0.01倍量的二甲亚砜混合，并加入姜粉总质量0.1倍量的质量分数为15%的有机酸、0.01倍量的乙酸酐，搅拌15min，得到第一混合溶液；
S3、将姜粉加入第一混合溶液中，并置于60℃条件下加热12 h，过滤除去滤渣并浓缩滤液，得到浓缩物；
S4、将浓缩物进行柱层析，洗脱体系为乙酸乙酯-石油醚体系，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为10~12:1的洗脱液，并浓缩，得到生姜提取物。
有机酸为质量比为1:1的柠檬酸和苹果酸。
本技术方案还可以包括以下技术细节，以更好地实现技术效果，在第二培养基中培养的方法为：将大叶千斤拔组培苗置于黑暗条件下培养1 h，然后再置于450W的红外线辐射型灯泡照射1.5 h，以黑暗-红外线照射交替培养4 d，其中，当在黑暗条件下培养20 min（每次在黑暗条件培养1h时，当培养至第20min时）时向大叶千斤拔组培苗中喷洒改良剂（改良剂的喷洒量根据组培苗的数量进行确定，例如每株组培苗喷洒1 mL），所述改良剂包括质量比为1:20的华山松提取物和水的混合溶液，其中，华山松提取物的制备方法为：先将华山松叶粉碎，得到粉碎料，然后向粉碎料中加入其总质量10倍量的水、5倍量的乙醇、0.1倍量的食盐混合并置于60℃的条件加热8 h，过滤，得到第一提取液；向提取液中加入其总质量0.5倍量的活性炭进行脱色处理，过滤，得到第二提取液；向第二提取液中加入其总质量0.06倍量的白砂糖，并置于80℃的条件下加热1 h，最后进行浓缩，即得到华山松提取物。
<对比例1>
采用实施例3的方法进行培养，其中，不同的是：氯化钙水溶液的用量为0 mL，其余条件相同。
<对比例2>
采用实施例5的方法进行培养，其中，不同的是：生姜提取物的制备方法为将生姜粉碎得到生姜粉，然后向生姜粉中加入其总质量10倍量的95%的乙醇溶液，并置于60℃条件下加热12 h，过滤除去滤渣并浓缩滤液，即得到生姜提取物。
<对比例3>
采用实施例6的方法进行培养，其中，不同的是：在第二培养基中培养的方法为将大叶千斤拔组培苗置于黑暗条件下培养1 h，然后再置于450W的红外线辐射型灯泡照射1.5h，以黑暗-红外线照射交替培养4 d，其中，当在红外线照射条件下培养20 min时，向大叶千斤拔组培苗中喷洒改良剂。
<对比例4>
采用实施例6的方法进行培养，其中，不同的是：在第二培养基中培养的方法为光照时间为10h/d，并每间隔2 h向大叶千斤拔组培苗中喷洒改良剂。
<实验表征>
1、染料木苷和木素的含量
采用实施例1-4、对比例5的方法进行培养大叶千斤拔组培苗，每组中有300株大叶千斤拔组培苗，测定每组中平均每株大叶千斤拔中根、茎叶、全株的染料木苷和木素的含量，染料木苷的测定结果如图1所示，染料木素的测定结果如图2所示，其中，T0Ca对应于对比例1，T1Ca对应于实施例1，T2Ca对应于实施例2，T3Ca对应于实施例3，T4Ca对应于实施例4，每个条形为平均值±标准差，n =3，每个部位（根、茎叶、根）中小写字母不同表示不同处理间含量差异显著(P <0.05)；
外源钙对大叶千斤拔组培苗不同部位中染料木苷和染料木素的合成均产生显著的影响。随着钙浓度的增加，大叶千斤拔的根部、整株中的染料木苷含量以及整株中染料木素含量均呈先增加后降低的趋势，其根部、茎叶中染料木素含量呈逐渐增加的趋势。从图中可以看出，大叶千斤拔染料木苷和染料木素成分主要富集在根部分，茎叶中的含量显著低于根部。
从根部测定结果可知，实施例3处理时，根中的染料木苷含量最高（11.03 mg/g），显著高于对比例1、实施例1和实施例4处理，是对比例1处理的2.26倍。实施例4处理时，根中的染料木素含量最高（0.72 mg/g），显著高于对比例1、实施例1处理，是对比例1处理的1.33倍，但与实施例2、实施例3处理下染料木素含量差异不显著。
从茎叶测定结果可知，随钙浓度增加，大叶千斤拔茎叶中染料木苷和染料木素含量均呈逐渐增加的趋势。实施例4处理时，茎叶中的染料木苷和染料木素含量均最高，分别为0.91 mg/g和0.07mg/g，比对比例1处理分别提高了85.9%和271%。实施例4处理时，茎叶中的染料木苷和染料木素含量显著高于对比例1、实施例1处理下的含量。
从全株测定结果可知，随钙浓度增加，全株中染料木苷和染料木素含量均呈先增加后下降的趋势。实施例3处理时，全株染料木苷和染料木素含量最高，分别为6.79 mg/g和0.45mg/g，比对比例1处理分别提高了81.1%和49.1%。实施例3处理时，全株染料木苷和染料木素含量显著高于对比例1以及其他外源钙处理下的含量。
综上可知，实施例3处理时，大叶千斤拔中根部、全株的染料木苷，以及全株的染料木素含量均为最高值；实施例4处理时，大叶千斤拔中茎叶的染料木苷，以及根部、茎叶的染料木素含量均为最高值，说明施加外源钙能够促进大叶千斤拔染料木苷和染料木素含量的积累。
2、生根株数
采用实施例3、实施例5、实施例6、对比例1-4的方法进行培养大叶千斤拔组培苗，每组中有400株大叶千斤组培苗，培养结束后统计每组中生根的大叶千斤组培苗的株数，结果如表1所示；
表1每组中生根的大叶千斤拔组培苗株数
| 组别 | 生根株数 |
| 实施例3 | 372 |
| 实施例5 | 389 |
| 实施例6 | 392 |
| 对比例1 | 360 |
| 对比例2 | 377 |
| 对比例3 | 384 |
| 对比例4 | 373 |
对比分析实施3、实施例5、实施例6及对比例1-4可知，本发明采用在黑暗-红外线照射交替的条件下进行培养，且在黑暗条件下培养时配合喷洒改良剂（华山松提取物），可有效促进大叶千斤拔组培苗的生根。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (2)
1.利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，其特征在于，将大叶千斤拔组培苗置于第一培养基中培养，其中，第一培养基为1/2MS、4.40 g/500mL的氯化钙水溶液、0.3 mg/LNAA、20.0 g/L蔗糖、4.0 g/L琼脂粉、0.5 g/L活性炭，其中氯化钙水溶液的用量为75 mL~100 mL，培养条件为：温度为25~28℃，光照时间为10~14 h/d，60d；在第一培养基中培养结束后，将大叶千斤拔组培苗置于第二培养基中培养，第二培养基为1/2MS、0.1mg/L萘乙酸、1 mg/L赤霉素、5 g/L蔗糖、4.0 g/L琼脂粉、0.5 g/L活性炭、2 g/L生姜提取物，其中，生姜提取物的制备方法为：
S1、将生姜置于60℃条件下烘干并粉碎，得到姜粉；
S2、取姜粉总质量10倍量的95%的乙醇溶液、2倍量的丙酮、1倍量的N,N-二甲基甲酰胺、0.01倍量的二甲亚砜混合，并加入姜粉总质量0.1倍量的质量分数为15%的有机酸、0.01倍量的乙酸酐，搅拌15min，得到第一混合溶液；
S3、将姜粉加入第一混合溶液中，并置于60℃条件下加热12 h，过滤除去滤渣并浓缩滤液，得到浓缩物；
S4、将浓缩物进行柱层析，洗脱体系为乙酸乙酯-石油醚体系，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为10~12:1的洗脱液，并浓缩，得到生姜提取物。
2.如权利要求1所述的利用钙提高大叶千斤拔中染料木苷和染料木素含量的方法，其特征在于，有机酸为质量比为1:1的柠檬酸和苹果酸。
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