CN113016606A - 一种甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，以芥菜型油菜萝卜胞质恢复系RLM198为母本，甘蓝型油菜Yu7‑120为父本，通过不断回交将芥菜型油菜萝卜胞质的恢复基因导入到甘蓝型油菜基因组中，再经过自交获得纯合稳定的恢复系，采用遗传连锁和全基因组重测序的分析方法，证明获得的恢复系的萝卜区段较短，位于A10染色体的末端，所获得的新型恢复系花粉量充足，恢复率较好，结籽正常，无连锁累赘现象，可以直接应用于我国油菜杂交种生产。

Description

一种甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法

技术领域

本发明属于油菜育种领域，具体涉及一种新型甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法。

背景技术

细胞质雄性不育是利用作物杂种优势的主要方式，在多种作物的杂交种生产中得到利用。在分子机理上，细胞质雄性不育是细胞核和细胞质共同作用的结果，具体表现为：线粒体基因组上某些特异的开放阅读框(Open reading frames,ORFs) 大量表达，并在花粉发育时期通过反向调控途径致使花粉败育，而细胞核基因组上相应的恢复基因(Restoreof fertility,Rf)则正向的作用于该ORFs上，致使其发生降解或不能正常转录或翻译，从而使育性得到恢复(Chen and Liu,2014)。

油菜作为我国重要的油料作物之一，其杂种优势利用在我国油菜产业发展中发挥了重要作用。同时我国是世界上杂交油菜应用最成功的国家。这既得益于良好的授粉控制系统的发现，如傅廷栋在1972年发现了“国际上第一个具有实用价值的细胞质不育系”Polima细胞质雄性不育系(cytoplasmic male sterility,CMS)，又要归功于低芥酸和低硫苷的品质改良。目前国内主要利用的细胞质不育系依然是Polima CMS和陕2A CMS，两者恢保关系相同，并且具有恢复源广的优点。但该不育系胞质只在某些特定遗传背景中稳定败育，多数遗传背景中不育性受温度影响易产生微粉。而欧洲普遍使用的萝卜Ogura胞质不育系具有败育稳定，恢复源单一的优点。

Ogura CMS是芸苔属中败育最彻底的不育系，被广泛应用于十字花科的蔬菜和作物育种中。它是1968年日本科学家小仓在日本野生萝卜的一个未知品种中发现的不育系，并以小仓的名字命名Ogura CMS。尽管其发现于日本，但并未得到利用，因为在日本萝卜材料中并没有找到相应的恢复材料。直到将其胞质导入到欧洲萝卜中后，才发现少数能使其育性得到恢复的欧洲萝卜种质。欧洲科学家随后将该萝卜与甘蓝型油菜进行种间杂交并不断回交，在甘蓝型油菜中导入了Ogura不育胞质。虽然这种异源Ogura胞质的甘蓝型油菜表现败育，但由于萝卜Ogura胞质叶绿体与甘蓝型油菜的细胞核之间出现调控紊乱，这些不育系都表现出叶片缺绿，低温黄化的现象。为了克服这种花叶现象，欧洲科学家将这种不育系与正常甘蓝型油菜再一次进行叶肉细胞质体融合，得到了稳定败育、叶片发育正常的OguraCMS甘蓝型油菜(Yamagishi and Bhat,2014)。细胞学研究证实， Ogura CMS败育最早出现于四分体时期，并且在小孢子液泡化时期绒毡层就过早的发生了程序化死亡(Gonzalez-Melendi et al.,2008)。

为了生产利用Ogura CMS，欧洲科学家将能够恢复Ogura CMS的欧洲萝卜与甘蓝型油菜进行远缘杂交，以期将恢复基因所在的萝卜区段导入到甘蓝型油菜基因组中。在萝卜中Ogura CMS的育性受两对恢复基因控制，而转入到油菜基因组中发现Ogura CMS能够被单一显性的恢复基因Rfo恢复。同样日本萝卜 kosena CMS也是受两对基因Rfk1和Rfk2控制。虽然育性能够得到恢复，但转入油菜基因组中的萝卜片段较长，导致出现结实率偏低和硫苷含量较高的连锁累赘现象。经过多年的传统改良，恢复系的结实率获得提升，但依然携带大片段的萝卜基因组区段。直到2005年法国农科院采用γ射线处理，才在众多后代中筛选到一株硫苷位点缺失的恢复系，命名R2000，并开发了一系列连锁标记 (US007812217B2)(Primard-Brisset et al.,2005)。Feng等用细胞遗传学和遗传连锁标记的方法证实含有恢复基因的萝卜区段位于油菜C09染色体的末端(Feng et al., 2009)。

为了在芥菜型油菜中利用ogura CMS，法国科学家将萝卜恢复区段从甘蓝型油菜导入到芥菜型油菜中。但芥菜型油菜背景中的恢复系因为连锁累赘，表现出较低的恢复率和种子活力。Tian等在恢复系杂交后代群体中利用萝卜标记扫描，获得改良的具有较好结实率、生长活力和黄籽的芥菜型油菜恢复系，同时将恢复区段定位于A09染色体(Tian etal.,2014)。Gudi等通过重测序5个不同的芥菜型油菜恢复系，结合萝卜和C基因组特异SSR标记，证实在芥菜型油菜恢复系创建的过程中，萝卜恢复基因区段两端携带了部分甘蓝型油菜C基因组的序列 (Gudi et al.,2020)。

作为理想的不育授粉系统，Ogura CMS被广泛杂交转入到其它十字花科作物和蔬菜中(Kirti et al.,1995；Ren et al.,2020；Tian et al.,2014；Xing et al.,2018；Yuet al.,2020)。叶用和茎用的十字花科蔬菜可以利用该不育系用于制种，而国内甘蓝型油菜制种利用则受到Ogura恢复源专利的限制。因此国内的研究单位也进行了相关的探索，尝试创建自己的Ogura恢复源材料。1997年，李琳等将油菜与萝卜变种兰花子进行远缘杂交，从后代分离出恢复系Ad-6。但该材料并未达到遗传稳定，属于附加系，并伴有减数分裂不稳定的现象(李琳et al.,1997；李旭锋 et al.,2001)。陈卫江等利用特殊的材料萝-蓝(AACCRR，2n＝58)与甘蓝型油菜通过嫁接的方法，育成了纯合的恢复系CLR650，该恢复系由于导入的萝卜染色体较大，仍会出现染色体落后和染色体桥等减数分裂异常现象，同时自交结实率较差(陈卫江et al.,2012)。后续对该材料继续进行遗传改良，获得了新型的恢复系CLR6430，仍含有较长的萝卜区段，导致在不同的分离群体中出现偏分离的现象(Wang etal.,2020)。

发明内容

本发明旨在甘蓝型油菜中通过远缘杂交从芥菜型油菜中导入创建一个新型的萝卜胞质恢复系，并通过遗传学和生物信息学的方法对恢复基因所在的萝卜区段的大小和染色体的位置进行鉴定，以证明该恢复系区别于欧洲所用的专利恢复系，为今后用于我国甘蓝型油菜杂交种生产提供理论支撑。

本发明主要包括通过远缘杂交结合回交转育的方法，将萝卜胞质恢复基因从芥菜型油菜导入甘蓝型油菜基因组中。所获得的新型恢复系花粉量充足，恢复率较好，结籽正常，无连锁累赘现象，可以直接应用于我国油菜杂交种生产。具体方法如下：

(1)以芥菜型油菜萝卜胞质恢复系RLM198为母本，甘蓝型油菜Yu7-120 为父本进行人工授粉得到杂交F1代；

(2)挑选F1代中的可育单株与甘蓝型油菜Yu7-120回交得到BC₁F₁代，选取BC₁F₁代中的可育单株与甘蓝型油菜Yu7-120再进行回交，直至回交后代中出现与甘蓝型油菜Yu7-120外型相同的可育单株，即叶片粉状蜡质、叶缘卵圆型无缺刻、株型伞形分枝、花蕾椭圆形；

(3)在回交后代中选择表型和甘蓝型油菜Yu7-120相同的可育单株进行自交，筛选纯合的可育单株即为甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)芥菜型油菜萝卜胞质恢复系RLM198是从甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系与芥菜型油菜杂交后代中分离出来的优异株系，具有恢复能力强，无连锁累赘和花粉量大等优点。而甘蓝型油菜Yu7-120在与芥菜型油菜进行杂交时，具有亲和性好，结籽较多和易于转化等优点；

(2)本发明获得的恢复系，没有连锁累赘，萝卜区段较短，且位于A10染色体上，规避了欧洲专利的限制；

(3)利用该方法结合育性筛选可以依此转化到其他十字花科作物或蔬菜中用以生产杂交种，且周期较短。

附图说明

图1甘蓝型油菜萝卜胞质新型恢复系206R花药照片。(图中a和b是恢复系206R的花和花药照片，c和d是甘蓝型油菜萝卜胞质不育系的花和花药照片)。

图2恢复系206R和R2000在萝卜R09区段上的差异，图中不同的颜色区块分别代表不同的连锁区段。

图3芥菜型油菜F₂群体和甘蓝型油菜F₂群体进行油菜60K SNP芯片检测后差异SNP在染色体上的分布情况。

图4甘蓝型油菜F₂群体混池重测序ΔSNPindex分布。

图5芥菜型油菜重测序数据中C09染色体特异k-mer的分布情况。

图6恢复系206R、R2000和CLR650重测序数据中萝卜R09染色体特异 k-mer在染色体上的分布情况两条红色的垂直虚线区间表示恢复系206R所包含的R09区段。

图7恢复系206R连锁图谱及对应的染色体物理位置图中上部分位连锁图谱，下部分为染色体物理位置；n＝706表示F₂群体中隐性单株的总数；上部分中直线以上表示连锁标记，直线以下表示发生染色体重组的单株数目；下部分中下面的数字代表标记对应的物理位置，黄色区块代表C09染色体的部分序列和相应的位置，蓝色区块代表萝卜染色体区段。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1利用远缘杂交结合回交转育，将萝卜胞质恢复基因从芥菜型油菜导入甘蓝型油菜

(1)2013年10月-2014年5月：芥菜型油菜萝卜胞质恢复系RLM198(简称芥菜型油菜RLM198)是由印度科学家Prakash教授改良的萝卜胞质恢复系，并已公开发表(Kirti etal.,1995)，以其作为母本。甘蓝型油菜Yu7-120来源于一个甘蓝型油菜轮回改良群体，也已公开发表(Zhao et al.,2016)，以其作为父本。华中农业大学油菜研究室保存有芥菜型油菜RLM198和甘蓝型油菜Yu7-120，并保证从申请日起二十年内向公众发放该生物材料用于实验研究。将父本(甘蓝型油菜Yu7-120)与母本(芥菜型油菜RLM198)进行人工剥蕾授粉，得到杂种F₁代。由于不同甘蓝型油菜的遗传背景不同，导致其与芥菜型油菜萝卜胞质恢复系间杂交亲和性不同，因此需要选用多种背景的甘蓝型油菜作为轮回父本。本发明用到的甘蓝型油菜Yu7-120与芥菜型油菜RLM198之间杂交亲和性较好，选取了5株芥菜型油菜萝卜胞质恢复系RLM198进行人工授粉得到杂交F₁代；由于所选取的芥菜型油菜萝卜胞质恢复系的恢复位点杂合，因此杂交F₁代和后续的回交群体中都会出现育性分离，其中可育单株与不育单株的比例符合1：1。

(2)2014年5月-2014年9月：在华中农业大学西北研究基地种植F1代 200株。该F₁代由于融合了两个物种的基因组，外观形态差异会比较大，并且会有不育株和可育株同时出现。挑选F₁代中的80株可育单株与甘蓝型油菜Yu7-120 继续进行回交，其中每个授粉单株平均能够收获0-2粒饱满种子，人工脱粒后，即得到约100粒BC₁F₁代。

(3)2014年10月-2015年5月：在穴盘中播种BC₁F₁代，待长至四片真叶时移栽至田间。继续挑选BC₁F₁代中的40株可育单株与甘蓝型油菜Yu7-120继续进行回交，其中每个授粉单株平均能够收获1-2粒饱满种子，人工脱粒后，即得到约60粒BC₂F₁代。

(4)分别在2015年5月-2015年9月、2015年10月-2016年5月和2016 年5月-2016年9月三个油菜生长季节，继续挑选20株可育单株与甘蓝型油菜 Yu7-120进行回交，分别得到BC₃F₁、BC₄F₁和BC₅F₁代。其中每个世代单株授粉后得到的饱满种子不断增多，且外观形态不断接近甘蓝型油菜，其中叶片表皮蜡质由针状叶刺变为粉状蜡质，叶缘由大叶缺刻变为卵圆型无缺刻，株型由多分枝多花序变为伞形分枝，花蕾由锥形变为椭圆形，同时可育单株花粉量充足，花粉全可育，不育单株花药变小发白，花丝短小，无正常花粉。

(5)2016年9月-2017年5月，在BC₅ F₁后代中选择叶型、叶色和株型等性状上和轮回亲本完全相同的可育单株(即叶片粉状蜡质、叶缘卵圆型无缺刻、株型伞形分枝、花蕾椭圆形)10株进行套袋自交，得到BC₅F₂代。

(6)2017年5月-2017年9月，在种植的BC₅F₂代的10个株系中，依据株系中可育单株和不育单株的比例，挑选全可育的株系中的10株单株自交，即得到纯合的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系，并命名为206R。如图1所示，所获得的甘蓝型油菜萝卜胞质新型恢复系206R(简称甘蓝型油菜206R)相对于不育系花粉量充足，蜜腺发育正常。

实施例2恢复基因连锁标记验证

甘蓝型油菜萝卜不育胞质恢复系R2000是法国农科院经过辐射诱变改良的优良恢复系，既去除了高硫苷位点的连锁累赘，达到国际低硫苷标准，又具有较好结实率，同时开发了一系列连锁的遗传标记(US008766040B2)用于扫描萝卜恢复基因区段。该恢复系的连锁标记一共分为5组，而控制硫苷含量的位点处于第4组，因此采用该套标记即可扫描并比较各恢复系间萝卜区段的大小。

比较湖南省农科院陈卫江老师创建的恢复系CLR650、法国农科院创建的恢复系R2000、本发明中创建的甘蓝型油菜恢复系206R和芥菜型油菜恢复系BJO，并以华油杂62(HYZ62)作为阴性对照。详细的连锁标记验证结果如表1所示。从5组连锁标记的验证中可以看出，CLR650包含最长的萝卜区段，并伴有个别标记的缺失，表明CLR650所插入的萝卜恢复基因区段与R2000之间具有基因组序列上的差异；R2000恢复系的连锁标记包含RMA01到RMC32 3的3组标记，缺少了包含高硫苷位点的第4组标记，硫苷含量达到正常水平；本发明所创建的恢复系206R和芥菜型油菜恢复系BJO具有一致的标记类型，说明该恢复系在芥菜型油菜亲本中已经包含较短的萝卜恢复基因区段。如图2所示，恢复系 206R只包含RMB01到RMC23的两组标记，比R2000的区段缺少第1组标记，且第3组标记中缺少RMC24到RMC32这一段序列。阴性对照HYZ62缺少萝卜区段的多数连锁标记，仅包含部分第5组标记，说明萝卜的该区段与油菜基因组的同源性较高。

表1各甘蓝型油菜萝卜质恢复系间连锁标记比较

+表示该材料含有该标记；空格表示不含有该标记。

先锋公司在2014曾对一个新的较短的萝卜区段恢复系SRF申请了专利(US8766040B2)，该恢复系由多年的回交和标记比较筛选而来，其中SRF-R1815 具有和本发明创建的恢复系206R相似的标记，包含标记RMB01到RMC23，而 SRF-R1931具有更短的萝卜区段，只包含标记RMB01到RMC16的区段。而206R 中缺少标记RMC16，与SRF恢复系仍然不同。

实施例3构建F₂群体，利用油菜60K SNP芯片和混池重测序的方法，对恢复基因进行遗传定位

利用芥菜型油菜RLM198与芥菜型油菜中国芥Y-1杂交构建了一个F₂育性分离群体，对其中可育、不育单株分别取适量幼嫩叶片，采用改良的CTAB法提取DNA。用2.5倍的冰乙醇沉淀DNA，冰箱放置半小时后，用100ul枪头将析出的DNA挑出到1ml 70％酒精中，以确保DNA的纯度。提取后的DNA经RNA 酶消化和质检，交由上海派森诺生物技术有限公司进行Illumina二代建库，并在 Hiseq X-TEN测序仪上进行测序。对甘蓝型油菜206R与甘蓝型油菜中双11杂交构建的F₂群体采取同样的建库测序方法，并在Hiseq2500测序仪上进行测序。

对两个F₂群体分别取30株可育和不育单株DNA进行等量混合，按照 Illumina公司的芯片处理流程对其进行油菜60K SNP芯片(购自美国Illumina公司)检测。对SNP芯片分型数据进行统计，计算每条染色体上变异SNP的位点和总数目。

测序原始数据经FastQC v0.11.5进行数据质量检测后，利用fastap软件进行测序接头处理、质量剪裁、过滤短序列、碱基矫正和质量过滤(Chen et al.,2018)。得到的高质量测序数据经BWA软件比对到甘蓝型油菜中双11 (http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/)的参考基因组上，并利用Samtools软件得到Sam 文件。最后利用VarScan进行差异SNP和Indel检测 (https://github.com/dkoboldt/varscan)。对可育和不育混池中差异的SNP计算ΔSNPindex并以50kb作为窗口，25kb作为步长的滑动窗口进行SNP频率计算，最终结果在Rstudio中利用ggplot2包进行展示，相关的计算脚本可参考链接 https://github.com/dontkme/BSAscmd。

利用油菜60K SNP芯片，对芥菜型油菜RLM198和和甘蓝型油菜206R分别构建的F₂群体进行SNP检测，差异SNP的分布如图3所示。其中差异SNP 位点均集中分布在A10染色体上。说明在芥菜型油菜和甘蓝型油菜的背景中，恢复系的萝卜区段很有可能位于A10染色体的末端。

通过对甘蓝型油菜206R构建的F₂群体中可育单株和不育单株混池进行全基因组重测序，将测序数据比对到中双11参考基因组，利用ΔSNPindex结合滑动窗口分析的方法，如图4所示，差异SNP同样集中分布在A10染色体的末端。

实施例4基于染色体特异k-mer的分析方法，对恢复基因所在的萝卜区段进行鉴定

为了确定甘蓝型油菜萝卜胞质新型恢复系206R中萝卜片段的插入大小，分别对ZS11的C09染色体和中国农科院蔬菜所测序的萝卜R09染色体以100bp作为k-mer长度进行提取，并以中双11、芥菜型油菜基因组V1.5、白菜Z1、甘蓝 HDEM和萝卜基因组作为参考，寻找C09和R09染色体特异的k-mer(Belser et al., 2018；Song et al.,2020；Yang et al.,2016；Zhang et al.,2015)。恢复系CLR650和 R2000的二代测序数据均来自于本实验室未发表数据，结合可育混池的测序数据，分别进行染色体特异k-mer扫描。最后以1Mb作为窗口，100kb作为步长进行 k-mer个数统计，并用R ggplot2包进行结果展示。

对芥菜型油菜RLM198的F₂群体中，可育和不育单株混池测序数据比对到相应的k-mer，最后在染色体上进行滑动窗口统计kmer的个数。如图5所示，在芥菜型油菜F₂群体的重测序数据中可以检测到甘蓝型油菜C09染色体的特异 k-mer，并且呈现双峰分布。说明包含萝卜质恢复系的片段在通过有性杂交方式导入到甘蓝型油菜后，可能定位于如图C09染色体双峰之间的位置，即C09染色体45.2-47.6Mb和59.8-61.7Mb之间。可以推测在将原始恢复系从甘蓝型油菜导入到芥菜型油菜的过程中，萝卜片段将C09染色体的两端序列同时携带进入到芥菜型油菜的染色体中。此结果与前人通过C基因组SSR标记验证的结果相近(Gudiet al.,2020)。为了进一步确定所创建的新型恢复系与R2000不同，利用 206R、R2000和CLR650的重测序数据，并分析了R09染色体特异k-mer的分布。如图6所示，恢复系CLR650包含最大的R09染色体区段，而新型恢复系206R 所覆盖的R09区段比R2000要小，此结果与萝卜区段连锁标记的扫描结果相同。

实施例5对恢复基因所在的萝卜区段构建遗传连锁图谱

基于以上在芥菜型油菜RLM198的F₂群体和甘蓝型油菜206R的F₂群体的芯片、重测序和k-mer分析结果，对恢复系206R进行遗传连锁标记开发，进一步确定其连锁位置。通过对一个包含706株隐性单株的F₂群体进行连锁标记验证，如图7所示，发现只有甘蓝型油菜A10染色体的SSR标记与恢复基因连锁，随着标记向染色体末端靠近，发生染色体重组的单株数目不断减少，染色体最末端的标记wSSR156位于26477000bp的位置，与恢复基因共分离。而基于R09 开发的显性标记和C09的部分标记均与恢复基因共分离。连锁标记具体的信息、物理位置和遗传距离见表2。因此猜测恢复系206R的恢复基因区段位于A10染色体的末端，且根据R09连锁标记的信息可以判断，206R所包含的萝卜基因组序列的大小为1.9Mb，位于R09染色体8.4Mb-10.3Mb之间。恢复基因区段两端携带了部分C09的染色体序列，分别是C09染色体45.2-47.6Mb和C09染色体 59.8-61.7Mb。所以恢复系206R在染色体A10的末端插入了约5.9Mb的嵌合染色体序列。

表2恢复系连锁标记信息

在本发明中所提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明所讲述内容后，本领域的技术人员可以对本发明做各种改动或者修改，这些等价形式同样属于本申请所附的权利要求书所限定的范围。

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Claims (2)

1.一种甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系的选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以芥菜型油菜萝卜胞质恢复系RLM198为母本，甘蓝型油菜Yu7-120为父本进行人工授粉得到杂交F1代；

（2）挑选F1代中的可育单株与甘蓝型油菜Yu7-120回交得到BC₁F₁代，选取BC₁F₁代中的可育单株与甘蓝型油菜Yu7-120再进行回交，直至回交后代中出现与甘蓝型油菜Yu7-120外型相同的可育单株，即叶片粉状蜡质、叶缘卵圆型无缺刻、株型伞形分枝、花蕾椭圆形；

（3）在回交后代中选择表型和甘蓝型油菜Yu7-120相同的可育单株进行自交，筛选纯合的可育单株即为甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系。

2.按照权利要求1所述方法构建的甘蓝型油菜萝卜胞质恢复系在甘蓝型油菜三系杂交种生产中的应用。

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