CN113009034A - 一种头孢拉定的高效液相分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种头孢拉定高效液相分析方法，该方法采用磷酸盐缓冲液及甲醇为流动相，采用特殊键合C18色谱柱，该方法可实现头孢拉定中11个杂质的质量控制，增加新关注杂质四甲基胍的定性及定量分析，利于实现对原料药杂质更好的质控。

Description

一种头孢拉定的高效液相分析方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，特别涉及一种头孢拉定的质量控制方法。
背景技术
头孢拉定化学名称：(6R,7R)-7-[(R)-2-氨基-2-(1,4-环己二烯-1-基)乙酰氨基]-3-甲基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，分子式：C16H19N3O4S分子量：349.40。结构式为：
Figure BDA0002961055920000011
头孢拉定为β-内酰胺类抗生素，用于敏感菌所致的急性咽炎、扁桃体炎、中耳炎、支气管炎和肺炎等呼吸道感染、泌尿生殖道感染及皮肤软组织感染等。为保证头孢拉定的质量和药效，对其进行有关物质的控制和检测具有很大的必要性。
目前，ChP、USP、BP等各国药典对头孢拉定有关物质的检测方法均有收录，如下所示：
根据欧洲药典(EP10.0)记载，采用碳十八烷基硅胶色谱柱；以磷酸盐缓冲液为流动相A相；以甲醇为流动相B相，按照下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0002961055920000012
Figure BDA0002961055920000021
在实际操作过程中，发现现有方法存在以下不足：
1)采用该方法色谱柱和洗脱条件不利于头孢拉定有关物质Ⅰ中新关注杂质四甲基胍的分离，其谱峰拖尾因子严重，不能实现对原料药杂质更好的质控。
2)采用该方法的色谱条件不能同时满足有关物质Ⅰ中的11个不同杂质实现基线分离，不利于杂质的定量和定性检测，不适用于头孢拉定有关物质Ⅰ的检测。
现有技术公开的头孢拉定分析方法多以水/甲醇：醋酸铵作为流动相洗脱体系，采用不同填料的色谱柱或者通过气相色谱等检测手段分离杂质，此类分析方法通常不能满足头孢拉定有关物质Ⅰ中11个不同杂质同时实现基线分离的效果，也不能对新关注杂质四甲基胍实现定性及定量检测。
因此为更好的监控头孢拉定中有关物质Ⅰ项下的杂质质量，本方案提供一种头孢拉定的高效液相分析方法，可以在实现对有关物质I检测的基础上，增加原料药中新关注杂质四甲基胍的定量和定性分析，拖尾因子符合标准；并且能够同时满足头孢拉定有关物质Ⅰ中各杂质实现基线分离；更好的控制杂质质量以及原料药质量分析，有关物质Ⅰ结构见附录Ⅰ杂质表。
附录I
Figure BDA0002961055920000022
Figure BDA0002961055920000031
Figure BDA0002961055920000041
发明内容
本发明的目的是提供一种头孢拉定的高效液相分析方法，具有同时实现有关物质Ⅰ中11个不同杂质基线分离的效果，有利于实现头孢拉定更好的质量控制以及增加对原料药中杂质的定性及定量方法。
本发明的目的是通过下述技术方案实现：
一种头孢拉定的高效液相分析方法，采用碳十八烷基键合五氟苯基硅胶色谱柱，流动相为磷酸缓冲盐/甲醇，以线性梯度洗脱的方式，实现头孢拉定中11个不同杂质的定量及定性分析，其中主要是增加新关注杂质四甲基胍的检测，实现对原料药的杂质更好的质控。
其中，包括以下色谱参数：
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液
B相：甲醇
色谱柱：ACE C18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶)
柱温：25℃～35℃
进样量：25μL
检测波长：220nm
流速：0.9mL/min～1.2mL/min
所述一种头孢拉定高效液相分析方法，包含以下步骤：
1.溶液配制
2.进样
3.采用线性梯度法洗脱，梯度设置如下：
阶段 V<sub>A</sub>相：V<sub>B</sub>相 洗脱时间
0 100:0 0-3min
1 98:2-96:4 3-9min
2 76:24-73:27 12-22min
3 62:38-48:52 4-12min
4 21:79-18:82 4-12min
5 100:0 8-14min
具体的，所述流动相A的配制方法为取磷酸二氢钾2.72g，加水溶解并稀释至1000mL，用稀磷酸调节pH至3.0即得；所述稀磷酸的配制方法为量取磷酸69mL，用水稀释至1000mL，摇匀即得。
精密称取头孢拉定适量，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml含头孢拉定6mg的溶液摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用流动相A定量稀释制成每lml中含60μg的溶液，作为对照溶液；另精密称取头孢氨苄、双氢苯甘氨酸、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸适量，置同一量瓶中，先加7.3％盐酸溶液4ml，超声使溶解，再用对照溶液定量稀释制成每1ml中含上述各杂质约12μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
所述一种头孢拉定高效液相分析方法的色谱柱是实现检测效果的重要技术关键之一；具体的，研究人员发现，采用不同C18键合填料色谱柱，其对杂质的分离效果存在差异，因此，本发明对不同填料的C18色谱柱进行具体的筛选，对于本发明而言，可选用的填料有：C18反相多孔硅胶填料；C18键合五氟苯基硅胶填料、C18键合苯基硅胶填料、C18键合酰胺硅胶填料，有机硅胶杂化烷基填料、C18键合氰基硅胶等，其对应的色谱柱包括GL SciencesInertsil ODS 3(C18反相多孔硅胶)、ACE Excel3 C18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶)、ACEExcel3 C18-AR(C18键合苯基硅胶)、ACE Excel 3 C18-Amide(C18键合酰胺硅胶)、ACE Excel3CN-ES(C18键合氰基硅胶)、Titank C8 3u(有机硅胶杂化烷基)等色谱柱；
具体的，本发明的研究人员发现，采用GL Sciences Inertsil ODS 3(C18反相多孔硅胶)色谱柱分析有关物质I，其中四甲基胍的拖尾因子较大，为2.996，不能同时实现头孢拉定11个不同杂质的基线分离，不利于定量和定性分析，不适用于头孢拉定有关物质I的检测；ACE Excel3 C18-AR(C18键合苯基硅胶)色谱柱检测有关物质I，其项下杂质E峰和杂质F峰的分离度为0.813，分离效果不佳，峰形重合，不适用于有关物质I杂质的分离；采用ACEExcel 3 C18-Amide(C18键合酰胺硅胶)色谱柱分析，结果显示，四甲基胍峰和杂质B峰分离度为1.025，杂质C,和杂质D峰的分离度为0.819，不利于杂质C和杂质D以及杂质B和四甲基胍的分离，分离度不佳，不能实现杂质的定量和定性分析；Titank C83u(有机硅胶杂化烷基)色谱柱，研究发现，其杂质A峰和N-甲基乙酰胺峰重合，未达到有效分离，不利于头孢拉定有关物质I项下杂质的检测；采用ACE Excel3 CN-ES(C18键合氰基硅胶)色谱柱分析有关物质I，发现杂质F与其他杂质峰重合在一起，不利于杂质有效分离；采用ACE Excel3 C18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶)色谱柱分析有关物质I项下杂质，发现不仅可以实现11个不同杂质基线分离，而且也增加新关注原料药杂质四甲基胍，并保证四甲基胍的拖尾因子符合要求，达到有关物质I项下杂质的有效分离；但是综合考虑，在长时、柱压以及四甲基胍的拖尾因子等因素的影响下，我们优选同类型的长柱ACE C18-PFP。
所述头孢拉定的质量控制方法中的梯度洗脱设置是实现分离效果的关键技术，具体的，研究人员发现，采用药典设置的洗脱体系，不能实现四甲基胍的基线分离，而且拖尾因子大，不符合分离的要求；也不能实现有关物质I的定量及定性分析，不能保证11个不同杂质同时实现基线分离；因此优化洗脱体系，快速、高效的洗脱不同杂质，并保证不同杂质间的洗脱峰型及各峰的分离度，所述梯度洗脱设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 100:0 0-3min
1 98:2-96:4 3-9min
2 76:24-73:27 12-22min
3 62:38-48:52 4-12min
4 21:79-18:82 4-12min
5 100:0 8-14min
上述梯度洗脱设置中，所述洗脱时间指代该阶段所持续的时长，流动相的比例(VA相：VB相)指代到达该洗脱时间终点时流动相的比例，其中阶段0指代流动相的起始比例，即：在该洗脱时间段内，流动相的比例由前一个时间段的终点值变至本时间段的终点值，无特指，优选的，流动相的比例在洗脱时间内为匀速改变。
具体的，上述梯度洗脱设置的阶段3可以进一步细化为阶段3、4，有利于更好的分离杂质，如下：
Figure BDA0002961055920000071
Figure BDA0002961055920000081
本发明一个优选的头孢拉定的高效液相分析方法，其梯度设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 100:0 2min
1 97:3 8min
2 75:25 20min
3 50:50 5min
4 50:50 5min
5 20:80 10min
6 100:0 10min
本发明一个优选的头孢拉定的高效液相分析方法，，其梯度设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 100:0 2min
1 97:3 4min
2 75:25 14min
3 60:40 3min
4 60:40 5min
5 20:80 5min
6 100:0 12min
所述头孢拉定质量控制方法的温度需要控制在25-35℃，过低柱温会严重影响柱效，而温度过高对色谱柱的损耗增大，当温度低于25℃，其峰形受到影响，拖尾因子显著增加，不仅不能实现10个不同杂质的定量和定性检测，而且也不利于对新关注杂质四甲基胍的分离；当温度高于35℃时，虽分离度提高，但是峰形变窄变细，并且对长时使用的色谱柱损耗增倍，优选的，当色谱柱温度为30℃时，既保证10个不同杂质的基线分离，同时也实现对新关注杂质四甲基胍定性及定量检测，并且拖尾因子符合规定，而且各杂质的出峰时间及峰形最佳，检测效果最好。
所述头孢拉定的质量控制方法的流速需要控制在0.9mL/min-1.2mL/min，具体的，流动相的流速大于1.2mL/min，会加快洗脱速度，影响出峰时间，不利于实现分离效果，流速小于0.9mL/min，流速过低，不仅会延迟洗脱时间，而且会拉宽10个不同杂质的峰宽，不能实现分离杂质的效果，更具体的，所述流动相的流速控制在0.9mL/min-1.2mL/min时，不仅满足了个杂质间的有效分离，还保证了分离度和检测效率，当流速选择1.0mL/min时，对杂质的检测效果最佳。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
所述头孢拉定的质量控制方法可以在实现对有关物质I检测的基础上，增加新关注的原料药杂质四甲基胍的定量和定性分析且可以达到基线分离，拖尾因子符合标准；并且能够同时实现头孢拉定有关物质Ⅰ中各杂质的基线分离；更好的实现杂质质量控制以及原料药质量分析。
附图说明
图1是实施例1所得HPLC谱图；
图2是实施例2所得HPLC谱图；
图3是实施例3所得HPLC谱图；
图4是实施例4所得HPLC谱图；
图5是对比实施例1所得HPLC谱图；
图6是对比实施例2所得HPLC谱图；
图7是对比实施例3所得HPLC谱图；
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液
B相：甲醇
色谱柱：ACEC18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶填料)
柱温：30℃
进样量：25μL
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
所述一种头孢拉定的高效液相分析方法，包含以下步骤：
1)溶液配制
所述流动相A的配制方法为取磷酸二氢钾2.72g，加水溶解并稀释至1000mL，用稀磷酸调节pH至3.0即得；所述稀磷酸的配制方法为量取磷酸69mL，用水稀释至1000mL，摇匀即得。
精密称取本品适量，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml含头孢拉定6mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用流动相A定量稀释制成每lml中含60μg的溶液，作为对照溶液；另精密称取头孢氨苄、双氢苯甘氨酸、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸适量，置同一量瓶中，先加7.3％盐酸溶液4ml，超声使溶解，再用对照溶液定量稀释制成每1ml中含上述各杂质约12μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
2)进样
3)采用线性梯度法洗脱，梯度设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 100:0 2min
1 97:3 8min
2 75:25 20min
3 50:50 5min
4 50:50 5min
5 20:80 10min
6 100:0 10min
所得HPLC谱图如图1所示，可以看出共检出11个杂质，杂质峰形良好，结果显示，在增加新关注杂质四甲基胍(t＝15.188)的基础上，还克满足其他不同杂质的分离度，并且各杂质的出峰顺序为杂质A、双氢苯甘氨酸甲基邓钠盐、杂质B、四甲基胍、杂质C、D、F、E、头孢氨苄、4’-5’-双氢头孢拉定、杂质G，其中四甲基胍为原料药中的杂质，采用该梯度洗脱方法，在满足11个杂质同时分离的条件下，还对原料药质量实现更好的监控，且各杂质间分离度符合要求，梯度平缓。
实施例2
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液
B相：甲醇
色谱柱：ACE C18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶填料)
柱温：30℃
进样量：25μL
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
所述头孢拉定质量控制方法，包含以下步骤
1)溶液配制
溶液配制方法，参照实施例1
2)进样
3)采用线性梯度法洗脱，梯度设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 100:0 2min
1 97:3 8min
2 75:25 15min
3 50:50 5min
4 50:50 10min
5 20:80 10min
6 100:0 10min
所得HPLC谱图如图2所示，可以看出共检出11个杂质，杂质峰形良好，还增加了新关注杂质四甲基胍(t＝15.188)的监控，各杂质的出峰顺序为杂质A、双氢苯甘氨酸甲基邓钠盐、杂质B、四甲基胍、杂质C、D、F、E、头孢氨苄、4’-5’-双氢头孢拉定、杂质G，其中四甲基胍为原料药中的杂质，结果显示，各杂质峰形完好，符合标准，采用该梯度洗脱方法，不仅实现11个杂质同时达到基线分离且分离度符合要求，还满足各不同杂质的定性及定量分析。
实施例3
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液，
B相：甲醇
色谱柱：ACE C18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶填料)
柱温：30℃
进样量：25μL
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
所述头孢拉定质量控制方法，包含以下步骤
1)溶液配制
溶液配制方法，参照实施例1
2)进样
3)采用线性梯度法洗脱，梯度设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 100:0 2min
1 97:3 8min
2 75:25 15min
3 60:40 5min
4 60:40 10min
5 20:80 10min
6 100:0 10min
所得HPLC谱图如图3所示，可以得出共检出11个杂质，杂质峰形良好，在检测到其他杂质的基础上，增加新关注杂质四甲基胍(t＝13.273)的分离，且各杂质的出峰顺序为杂质A、双氢苯甘氨酸甲基邓钠盐、杂质B、四甲基胍、杂质C、D、F、E、头孢氨苄、4’-5’-双氢头孢拉定、杂质G，各杂质峰形完好，符合标准，其中四甲基胍为原料药中的杂质，采用该梯度洗脱方法，不仅可以实现11个杂质同时达到基线分离且分离度符合要求，而且满足各不同杂质的定性及定量分析。
实施例4
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液，
B相：甲醇
色谱柱：ACE C18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶填料)
柱温：30℃
进样量：25μL
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
所述头孢拉定质量控制方法，包含以下步骤
1)溶液配制
溶液配制方法，参照实施例1
2)进样
3)采用线性梯度法洗脱，梯度设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 100:0 2min
1 97:3 4min
2 75:25 14min
3 60:40 3min
4 60:40 5min
5 20:80 5min
6 100:0 12min
所得HPLC谱图如图4所示，可以得出该色谱条件可以同时检出11个杂质且保证各杂质分离度以及分离效率；在原有杂质检测的基础上，增加新关注杂质四甲基胍(t＝12.844)的定性及定量分析；采用该方法，不仅能够实现头孢拉定有关物质Ⅰ中11个杂质的同时检出且符合要求，而且还增加对原料药中四甲基胍杂质的定性及定量分析，利于头孢拉定更好的质控。
对比实施例1
根据欧洲药典(EP10.0)记载，固定相为碳十八烷基硅胶色谱柱：以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.72g，加水溶解并稀释至1000ml，用稀磷酸调节pH至3.0±0.05)为流动相A，以甲醇为流动相B，按照下表进行梯度洗脱：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 99.5：0.5 0min
1 97:3 2.5min
2 75:25 8.5min
3 60:40 2min
4 60:40 3min
5 20:80 3min
6 99.5:0.5 0.1min
7 99.5:0.5 9.9min
所得HPLC谱图如图5所示，结果显示N-甲基乙酰胺峰与杂质A分离度为1.091，双氢苯甘氨酸邓钠盐峰与杂质B峰重合在一起，头孢拉定二次加合物和头孢拉定重合在一起，而且四甲基胍的拖尾因子较大为2.996，不符合分离要求，说明该色谱条件不适用于头孢拉定有关物质I的检测。
本发明技术人员采用ACE C18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶填料)色谱柱以及与欧洲药典(EP10.0)相同的梯度洗脱条件分离头孢拉定有关物质I杂质，结果显示，不能实现同时使11个杂质实现基线分离，而且对于新关注的杂质四甲基胍分离度大于2.0，不能满足定性及定量检测要求，因此并不适用于头孢拉定有关物质I的检测。
对比实施例2
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液，
B相：甲醇
色谱柱：ACE Excel3 C18-AR(C18键合苯基硅胶填料)
柱温：30℃
进样量：25μL
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
所述头孢拉定质量控制方法，包含以下步骤
1)溶液配制
溶液配制方法，参照实施例1
2)进样
3)梯度设置如下：
阶段 V<sub>A相</sub>：V<sub>B相</sub> 洗脱时间
0 99.5：0.5 0min
1 97:3 2.5min
2 75:25 8.5min
3 60:40 2min
4 60:40 3min
5 20:80 3min
6 99.5:0.5 0.1min
7 99.5:0.5 9.9min
所得HPLC谱图如图6所示，结果显示，N-甲基乙酰胺峰与杂质A峰重合在一起双氢苯甘氨酸甲基邓钠盐峰与杂质B重合在一起，头孢拉定二次加合物和头孢拉定峰重合在一起，杂质E和杂质F峰的分离度为0.813，四甲基胍拖尾因子为1.495，该方法并不能分离有关物质I中杂质E和杂质F且原料药四甲基胍的拖尾因子不符合要求，不能满足定量及定性分析，说明该色谱条件不适用头孢拉定有关物质I的检测。
对比实施例3
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液，
B相：甲醇
色谱柱：ACE Excel 3 C18-Amide(C18键合酰胺硅胶填料)
柱温：30℃
进样量：25μL
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
所述头孢拉定质量控制方法，包含以下步骤：
1)溶液配制
溶液配制方法，参照实施例1
2)进样
3)梯度设置如下：
Figure BDA0002961055920000171
Figure BDA0002961055920000181
所得HPLC如图7所示，结果表明，N-甲基乙酰胺峰与杂质A峰重合在一起，双氢苯甘氨酸甲基邓钠盐峰与杂质B峰重合在一起，头孢拉定二次加合物峰和头孢拉定峰重合在一起，四甲基胍峰和杂质B峰的分离度为1.025，杂质C和杂质D峰的分离度为0.819，采用该色谱柱ACE Excel 3 C18-Amide(C18键合酰胺硅胶)不能实现头孢拉定有关物质I的检测，更不能同时满足分离11个不同杂质并实现其定性及定量分析；
根据以上实施例1、2、3、4之一的色谱方法，不仅可以同时实现有关物质I中11个不同杂质的有效分离，而且还增加原料药杂质四甲基胍的定性及定量检测，实现对原料药更好的质控，同时保证头孢拉定其他杂质的分离度及分离效率，与现有技术公开的检测方法相比(对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3)具有更好得普适性和稳定性且分离效率更好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种头孢拉定的高效液相分析方法，其特征在于色谱柱采用填充剂为C18键合五氟苯基硅胶，其检测条件如下：
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液
B相：甲醇
检测波长：220nm
柱温：25-35℃
进样量：25μL
流速：0.9-1.2mL/min
包括如下步骤：
1)溶液配制
2)进样
3)采用线性梯度法洗脱，梯度设置如下：
阶段 V<sub>A</sub>相：V<sub>B</sub>相 洗脱时间 0 100:0 0-3min 1 98:2-96:4 3-9min 2 76:24-73:27 12-22min 3 62:38-48:52 4-12min 4 21:79-18:82 4-12min 5 100:0 8-14min
。
2.根据权利要求1所述的一种头孢拉定的高效液相分析方法，其特征在于：所述色谱柱为ACE C18-PFP。
3.根据权利要求1所述一种头孢拉定的高效液相分析方法，其特征在于：所述柱温为30℃，进样量为25μL。
4.根据权利要求1所述一种头孢拉定的高效液相分析方法，其特征在于：所述的流动相流速为1.0mL/min。
5.根据权利要求1所述一种头孢拉定的高效液相分析方法，其特征在于：所述的梯度设置如下：
阶段 V<sub>A</sub>相：V<sub>B</sub>相 洗脱时间 0 100:0 0-3min 1 98:2-96:4 3-9min 2 76:24-73:27 12-22min 3 62:38-48:52 2-6min 4 62:38-48:52 2-6min 5 21:79-18:82 4-12min 6 100:0 8-14min
。
6.根据权利要求1所述一种头孢拉定的高效液相分析方法，其特征在于，所述的梯度设置如下：
阶段 V<sub>A</sub>相：V<sub>B</sub>相 洗脱时间 0 100:0 2min 1 97:3 8min 2 75:25 20min 3 50:50 5min 4 50:50 5min 5 20:80 10min 6 100:0 10min
。
7.根据权利要求1所述一种头孢拉定的高效液相分析方法，其特征在于，所述的梯度设置如下：
阶段 V<sub>A</sub>相：V<sub>B</sub>相 洗脱时间 0 100:0 2min 1 97:3 4min 2 75:25 14min 3 60:40 3min 4 60:40 5min 5 20:80 5min 6 100:0 12min
。
8.一种头孢拉定的高效液相分析方法，其特征在于检测条件如下：
流动相：
A相：磷酸盐缓冲液
B相：甲醇
色谱柱：ACE C18-PFP(C18键合五氟苯基硅胶填料)
柱温：30℃
进样量：25μL
检测波长：220nm
流速：1.0ml/min
包括以下步骤：
1)溶液配制
所述流动相A的配制方法为取磷酸二氢钾2.72g，加水溶解并稀释至1000mL，用稀磷酸调节pH至3.0即得；所述稀磷酸的配制方法为量取磷酸69mL，用水稀释至1000mL，摇匀即得；
精密称取本品适量，加流动相A溶解并定量稀释制成每1ml含头孢拉定6mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用流动相A定量稀释制成每lml中含60μg的溶液，作为对照溶液；另精密称取头孢氨苄、双氢苯甘氨酸、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸适量，置同一量瓶中，先加7.3％盐酸溶液4ml，超声使溶解，再用对照溶液定量稀释制成每1ml中含上述各杂质约12μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
2)进样
3)采用线性梯度法洗脱，梯度设置如下：
阶段 V<sub>A</sub>相：V<sub>B</sub>相 洗脱时间 0 100:0 2min 1 97:3 8min 2 75:25 20min 3 50:50 5min 4 50:50 5min 5 20:80 10min 6 100:0 5min
。
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