CN113004137A - 一种降血糖降血脂聚酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用南极中山站土壤来源链霉菌Streptomycessp.HDN15176（保藏编号:CGMCC No.17648）生产聚酮类化合物的制备方法，同时涉及该类化合物在降血糖降血脂中的用途，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；其可通过链霉菌Streptomycessp.HDN15176发酵培养来获取含有该类化合物的发酵产物，然后采用VLC正相柱层析分离、C‑18 ODS反相柱层析分离和半制备HPLC等方法分离纯化得到。本发明旨在从真菌来源的次级代谢产物中提供一种结构新颖的具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性的新化合物的方法，该化合物可作为新型降血糖降血脂药，用于高血糖及高血脂的治疗。

Description

一种降血糖降血脂聚酮类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及用链霉菌Streptomycessp.HDN15176 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（保藏编号: CGMCC No.17648，保藏日期：2019年4月29日）生产聚酮类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在降血糖降血脂中的用途。
背景技术
蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phospatase，PTP）又叫做蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型1(tyrosine-protein phosphatase non-reeeptor type l)。PTP1B是PTP家族第一个被分离纯化出来的酶，能负向调节胰岛素信号通路和瘦素信号通路。PTP1B因能调控葡萄糖内稳态及能量消耗等重要生理过程而成为2型糖尿病和肥胖的潜在的、重要的、有效的药物靶点。随着对PTP1B研究的深入，人们发现PTP1B与肿瘤也密切相关。因此，开发PTP1B 抑制剂对预防、治疗Ⅱ型糖尿病、肥胖症或肿瘤具有重要意义。本发明人从一株南极中山站土壤链霉菌Streptomycessp.HDN15176液体发酵产物中分离出一个具有PTP1B抑制作用的聚酮类化合物。研究发现所示聚酮类化合物具有显著的降血糖降血脂活性，表明上述聚酮类化合物具有进一步开发成新型降血糖降血脂药物的潜力。
发明内容
本发明旨在提供一种结构新颖的具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制作用的新化合物。其结构式是
Figure 549659DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ
本发明的式Ⅰ化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵物，然后对发酵粗提物采用VLC正相柱层析、C-18 ODS反相柱层析和半制备HPLC等方法分离纯化得到。
本发明的下述实施例中列举了利用链霉菌Streptomyces sp. HDN15176制备本发明式Ⅰ化合物的实例。
具体实施方式：
在如下的实施例中所指的化合物Ⅰ的化学结构（结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位）是：
Figure 372122DEST_PATH_IMAGE002
化合物Ⅰ
实施例1 化合物Ⅰ的发酵生产及分离精制
1 发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取链霉菌Streptomyces sp. HDN15176适量，接种到2216E固体斜面培养基上，在28℃培养箱中培养5天。
取斜面培养5天的链霉菌Streptomyces sp. HDN15176适量，接种到装有150 mL培养基[培养基组成（克/升）：可溶性淀粉10 g，酵母膏10 g，KH2PO4 0.5 g，玉米浆3 g，葡萄糖20 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，牛肉膏1 g，CaCO3 2 g]的500 mL锥型瓶中，在28 ℃摇床（180rmp）培养8天，获得发酵产物。
2 浸膏的获得
发酵液用纱布过滤得到上清液。用等量乙酸乙酯萃取三次，合并所有乙酸乙酯相，减压浓缩得到粗浸膏，共75克。
3 化合物的分离精制
浸膏（75.0克）用甲醇溶解后，使用95%甲醇溶解，使用石油醚萃取，出去油脂成分，蒸干后以甲醇-二氯甲烷为洗脱体系进行正相层析柱层析，分为2个流份。组分1先以甲醇-水为流动相进行C-18 ODS反相柱层析，梯度洗脱后再经反相半制备高效液相色谱（甲醇：水=70:30）得化合物Ⅰ（3.2 mg）。
化合物Ⅰ为棕色固体, 分子式C18H22O3, HR-ESI-MS m/z： 287.1643 [M + H]+,(计算值：287.1642)； IR (KBr)ν max 3330, 2955, 2869, 1686, 1619, 1569, 1465,1365, 1217, 1083, 840, 762 cm-1; 1H and 13C NMR见表1。
Figure 639155DEST_PATH_IMAGE003
a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s（单重峰）、d（二重峰）、t（三重峰）和q（四重峰）、m（多重峰）表示。
b)此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
c)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。
实施例2 化合物的PTP1B抑制活性测试
1 实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施1中分离精制的化合物Ⅰ纯品。精密称取适量样品，用DMSO配置成10 mg/mL的母液，测试终浓度为33.4μg/ml、66.7μg/ml、133.3μg/ml、200μg/ml；阳性药（熊果酸）测试终浓度为12.5 μM，供测活性。
PTP1B抑制活性采用分子生物学方法，使用实验室大肠杆菌表达系统制得含 His标签的融合蛋白，利用含有磷酸的多肽para-NitrophenylPhosphate（pNPP）被PTP1B酶解掉一个磷酸后的产物对硝基苯酚（pNP）在波长405nm处有强的光吸收的原理，并以PTP1B作用后生成pNP的量表示PTP1B酶活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况。
含 His 标签的融合蛋白的制备:将含有His标签的融合蛋白的质粒转化BL21感受态细胞，挑出单菌落于LB液体培养基37℃摇床培养至OD600为0.6左右加入0.5mM IPTG诱导4h，然后超声破碎菌体。最后过Ni-NTA柱纯化融合蛋白，最后将蛋白透析除去咪唑，加入30%- 50%甘油分装冻存于-80℃冰箱，避免反复冻融。
检测与分析：
监测体系为50 mM柠檬酸盐，pH 6.0，2 mM pNPP，蛋白酪氨酸磷酸酶1B。化合物，阳性对照，37 ℃黑暗条件下，孵育15 min，加入50 μL 2 mol/L的NaOH溶液终止反应，于波长405nm处测定吸光度值。按如下公式计算化合物PTP1B酶活力抑制率。
抑制率＝(阴性对照组A值-实验组A值)/阴性对照组A值× 100％
其中，A表示吸光度值。
2. 实验结果
在降糖活性测试中，化合物I对PTP1B抑制活性结果见表2。
Figure 900372DEST_PATH_IMAGE004
3 结论
化合物Ⅰ活性筛选结果显示化合物Ⅰ对蛋白酪氨酸磷酸酶1B有明显的抑制作用，可作为新型降血糖降血脂药，用于高血糖及高血脂的治疗。

Claims (3)

1.如下式结构所示的化合物
Figure 194489DEST_PATH_IMAGE001
权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：链霉菌Streptomycessp. HDN15176 （保藏编号：CGMCC No.17648）先在2216E固体培养基上于28℃培养箱中培养5天，再次接种于液体发酵培养基中对该菌株进行28℃摇床条件（180 rpm）发酵培养8天.发酵液过滤得到发酵液，用等量乙酸乙酯萃取三次，合并所有乙酸乙酯相，减压浓缩得到粗浸膏。
2.权利要求2所述的制备方法，将所述粗浸膏通过VLC正相柱层析梯度分离，以甲醇/二氯甲烷为流动相进行梯度洗脱；再经C-18 ODS反相柱层析分离，以甲醇/水为流动相进行梯度洗脱；最后经反相半制备高效液相色谱分离纯化得权利要求1所述化合物，制备梯度为甲醇：水=70 : 30，其中所述发酵培养基成分为可溶性淀粉10 g，酵母膏10 g，KH2PO4 0.5 g，玉米浆3 g，葡萄糖20 g，MgSO4 •7H2O 0.5 g，牛肉膏1 g，CaCO3 2 g ，水1 L。
3.权利要求1所述化合物具有的蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性，及在制备降血糖降血脂药物中的用途。
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王皓天等: "美替拉酮对放线菌Streptomyces sp.LXF-80代谢途径的影响", 《中国海洋生物》 *

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