CN112999417A - 一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料及制备方法和应用 - Google Patents

一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料及制备方法和应用，它涉及一种导电神经组织工程多糖水凝胶及其制备方法。本发明的目的是要解决现有导电神经组织工程水凝胶材料无法兼顾优导电与生物信号传导功能，导致导电神经组织工程水凝胶材料生物信号传导能力欠缺的问题。方法；一、制备羧甲基壳聚糖；二、制备邻苯二酚羧甲基壳聚糖；三、制备胆碱‑邻苯二酚羧甲基壳聚糖；四、制备胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料作为促进缺损神经修复神经组织工程材料使用。本发明可获得一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。

Description

一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料及制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种导电神经组织工程多糖水凝胶及其制备方法。
背景技术
神经损伤修复是再生医学面临的重大攻关难题，自体神经移植是治疗周围神经损伤的金标准，但健康感知神经切除导致额外伤口和感觉丧失，且有限供体神经难以满足大范围神经损伤修复来源需求。神经修复是一个动态复杂过程，依赖细胞信号因子调节，借此实现高效理想的修复效果，探索利于神经修复的细胞信号因子是神经组织工程材料开发领域亟待解决的问题。胆碱可作为保护神经、维持神经可塑性的信号物分子传递神经细胞间信息，并调节受损神经周围局部微环境平衡，实现神经修复。导电水凝胶的软湿特质和多孔特性使神经细胞可迁移并增殖，适宜的电刺激诱导神经细胞分化并促进神经元轴突生长，成为模拟细胞外基质仿生神经组织工程材料。但目前已研发制备的神经组织工程导电水凝胶材料无法兼顾优导电与生物信号传导功能，难以达到预期神经修复效果。因此，亟待胆碱等生物信号因子修饰导电水凝胶的策略探索，制备新型神经组织工程水凝胶材料，使其兼具有效可控电刺激、导电均匀稳定及信号传导等特质功能。目前，导电神经组织工程水凝胶材料复合细胞信号因子，合成制备兼具导电及细胞动态调节功能的水凝胶成为神经再生医学及生物材料研发领域的热点之一。
发明内容
本发明的目的是要解决现有导电神经组织工程水凝胶材料无法兼顾优导电与生物信号传导功能，导致导电神经组织工程水凝胶材料生物信号传导能力欠缺的问题，而提供一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料及制备方法和应用。
一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料以壳聚糖为原料，在壳聚糖C6位羟基经醚化反应引入羧基，得到羧甲基壳聚糖，然后羧甲基壳聚糖与3,4-二羟基苯甲醛经席夫碱反应，获得邻苯二酚羧甲基壳聚糖，再将胆碱接枝至邻苯二酚羧甲基壳聚糖C6位羧基，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖，最后在胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液中添加吡咯、氯化铁和氯化钙，利用溶液中酚羟基与铁离子配位作用、羧基与钙离子配位作用以及聚吡咯与多糖之间氢键作用得到胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，是按以下步骤完成的：
一、制备羧甲基壳聚糖：
①、将壳聚糖和氢氧化钠加入到异丙醇水溶液中，再溶胀碱化，得到壳聚糖的异丙醇水溶液；
②、将氯乙酸溶于异丙醇中，得到氯乙酸的异丙醇溶液；
③、将氯乙酸的异丙醇溶液加入到壳聚糖的异丙醇水溶液中，得到反应液Ⅰ；对反应液Ⅰ进行搅拌反应，最后加入乙醇溶液终止反应，再真空抽滤，得到固体反应产物Ⅰ；
④、对固体反应产物进行洗涤，得到脱水脱盐产物；将脱水脱盐产物在室温下真空干燥，得到淡黄色粉末，即为羧甲基壳聚糖；
二、制备邻苯二酚羧甲基壳聚糖：
①、将羧甲基壳聚糖加入到无水乙醇中，再溶胀，得到羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液；
②、向羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液中加入3,4-二羟基苯甲醛，再使用冰乙酸将体系的pH值调节至4～5，得到反应液Ⅱ；
③、将反应液Ⅱ进行搅拌回流反应，再真空抽滤，得到固体反应产物Ⅱ；
④、对固体反应产物Ⅱ进行洗涤，得到洗涤后的固体反应产物Ⅱ；使用无水乙醇对洗涤后的固体反应产物Ⅱ进行索氏萃取，得到萃取产物，将萃取产物进行真空干燥，得到棕黄色粉末，即为邻苯二酚羧甲基壳聚糖；
三、制备胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖：
①、将邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；向邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，再搅拌反应，得到活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；
②、向活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中加入胆碱，得到反应溶液Ⅲ；将反应溶液Ⅲ进行搅拌反应，得到反应产物Ⅲ；
③、将反应产物Ⅲ转移至透析袋中，于去离子水中透析，得到透析产物；将透析产物真空冷冻干燥，得到棕黄色粉末状产物，即为胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖；
四、制备胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料：
①、将胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；
②、将海藻酸钠溶于去离子水中，得到海藻酸钠溶液；
③、将胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合均匀，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液；
④、向胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液中加入吡咯，再超声处理，得到混合溶液Ⅰ；
⑤、将氯化铁和氯化钙溶解到去离子水中，得到混合溶液Ⅱ；
⑥、将混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ均匀混合，得到混合溶液Ⅲ；将混合溶液Ⅲ进行静置，得到胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料作为促进缺损神经修复神经组织工程材料使用。
本发明优点：
一、本发明制备的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料选用原料为壳聚糖、海藻酸钠和聚吡咯，三者均为优生物相容性高分子聚合物；
二、本发明制备的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料采用壳聚糖经多位点分步生物活性基团修饰，获得兼有邻苯二酚、席夫碱亚胺键和胆碱的新型壳聚糖衍生物；
三、本发明制备的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料采用超声辅助吡咯原位聚合，获得导电均匀优良的水凝胶材料，具体表现为：聚吡咯浓度由0.2mg/mL上升至4mg/mL时，水凝胶电导率由5.35×10-6S·cm-1提高至9.03×10-3S·cm-1；
四、本发明制备的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料利用酚羟基-铁离子和羧基-钙离子双金属阳离子配位作用交联，具有高机械性能，储能模量最高达3980Pa；
五、本发明制备的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料含有席夫碱亚胺键，亚胺基团对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均表现明显抑菌作用；
六、本发明制备的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料具有细胞外基质特性，能稳定传导电信号及神经修复信号，可作为促进缺损神经修复神经组织工程材料使用。
本发明可获得一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
附图说明
图1是实施例一步骤一的反应机理图；
图2是实施例一步骤二的反应机理图；
图3是实施例一步骤三的反应机理图；
图4是实施例一步骤四的反应机理图；
图5是实施例一步骤四的实物图；
图6是第一红外光谱图，图中a表示壳聚糖的红外光谱曲线，图中b表示实施例一步骤一④得到的羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线；
图7是第二红外光谱图，图中a表示实施例一步骤一④得到的羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线，b表示实施例一步骤二④得到的邻苯二酚羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线；
图8是第三红外光谱图，图中a表示实施例一步骤二④得到的邻苯二酚羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线，b表示实施例一步骤三③得到的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线；
图9是实施例一步骤一④得到的羧甲基壳聚糖以重水为溶剂的核磁共振氢谱图；
图10是实施例一步骤二④得到的邻苯二酚羧甲基壳聚糖以重水为溶剂的核磁共振氢谱图；
图11是实施例一步骤三③得到的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖以重水为溶剂的核磁共振氢谱图；
图12是X-射线衍射谱图，图中a表示壳聚糖的X-射线衍射谱曲线，图中b表示实施例一步骤一④得到的羧甲基壳聚糖的X-射线衍射谱曲线；图中c表示实施例一步骤二④得到的邻苯二酚羧甲基壳聚糖的X-射线衍射谱曲线；图中d表示实施例一步骤三③得到的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖的X-射线衍射谱曲线；
图13是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的差示扫描量热法谱图；
图14是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的热重分析图；
图15是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料放大5000倍的扫描电镜图；
图16是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料放大10000倍的扫描电镜图；
图17是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料放大20000倍的扫描电镜图；
图18是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的溶胀率随时间变化图；
图19是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的流变性能测试图；图中■表示水凝胶的储能模量，图中□表示水凝胶的损耗模量；
图20是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料在降解性测试中重量随时间变化曲线；图中▲表示水凝胶在磷酸盐缓冲溶液中重量随时间变化曲线，图中△表示水凝胶在含有溶菌酶的磷酸盐缓冲溶液中重量随时间变化曲线；
图21是胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率随聚吡咯投料比变化图，图中1为实施例二步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率，2为实施例三步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率，3为实施例四步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率，4为实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率，5为实施例五步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率。
图22是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈实验图；图中a为水凝胶对金黄色葡萄球菌抑菌圈实验图，图中b为水凝胶对大肠杆菌抑菌圈实验图；
图23是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌活性测试结果图；
图24是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料孵育PC-12细胞毒性结果，图中
Figure BDA0003007777790000051
表示实施例1步骤四得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶MTT实验吸光度值，图中
Figure BDA0003007777790000052
表示不含聚吡咯的多糖水凝胶MTT实验吸光度值；
图25是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料3D封装PC-12细胞后活-死细胞染色图；图中a、b、c、d分别为细胞在水凝胶内封装24h、48h、72h和96h时，经活-死细胞染色后活细胞数量；
图26是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后的小鼠步幅形态；图中A1、A2为健康小鼠在第4周和第8周时步幅形态，图中B1、B2为对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复小鼠损伤坐骨神经后，小鼠在第4周和第8周时步幅形态，图中C1、C2为实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶修复小鼠损伤坐骨神经后，小鼠在第4周和第8周时步幅形态；
图27是小鼠坐骨神经指数分析图；图中
Figure BDA0003007777790000053
表示对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复损伤坐骨神经后的小鼠坐骨神经指数，图中
Figure BDA0003007777790000054
表示实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后的小鼠坐骨神经指数；
图28是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后的坐骨神经HE染色图；图中A1、A2、A3、A4分别为健康小鼠坐骨神经放大50、100、200、400倍的HE染色图，图中B1、B2、B3、B4为对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复小鼠损伤坐骨神经后，坐骨神经放大50、100、200、400倍的HE染色图，图中C1、C2、C3、C4为实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后，坐骨神经放大50、100、200、400倍的HE染色图；
图29是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后的坐骨神经透射电镜扫描图；图中A1、A2、A3为健康小鼠坐骨神经放大2000、5000、8000的透射电镜扫描图，图中B1、B2、B3为采用对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复小鼠损伤坐骨神经后，坐骨神经放大2000、5000、8000的透射电镜扫描图，图中C1、C2、C3为采用实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后，坐骨神经放大20000、5000、8000的透射电镜扫描图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
具体实施方式一：本实施方式一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料以壳聚糖为原料，在壳聚糖C6位羟基经醚化反应引入羧基，得到羧甲基壳聚糖，然后羧甲基壳聚糖与3,4-二羟基苯甲醛经席夫碱反应，获得邻苯二酚羧甲基壳聚糖，再将胆碱接枝至邻苯二酚羧甲基壳聚糖C6位羧基，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖，最后在胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液中添加吡咯、氯化铁和氯化钙，利用溶液中酚羟基与铁离子配位作用、羧基与钙离子配位作用以及聚吡咯与多糖之间氢键作用得到胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
本实施方式所述的邻苯二酚羧甲基壳聚糖含有抑菌活性席夫碱结构，且携带交联位点邻苯二酚。
本实施方式所述的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖含有促进缺损神经修复的生物活性基团胆碱。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述的胆碱的制备方法是按以下步骤完成的：
将250μL 2-氨基乙醇加入到50mL三颈烧瓶中，然后加入20mL无水甲醇和2g无水K2CO3，再向三颈烧瓶中通入氮气，在氮气气氛和磁力搅拌条件下加入500μL碘甲烷，最后在氮气气氛、室温和搅拌条件下搅拌10h，得到反应产物；将反应产物在25℃的烘箱中干燥12h，得到2-羟基-N',N',N'-三甲基乙胺，即为胆碱。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式是一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法是按以下步骤完成的：
一、制备羧甲基壳聚糖：
①、将壳聚糖和氢氧化钠加入到异丙醇水溶液中，再溶胀碱化，得到壳聚糖的异丙醇水溶液；
②、将氯乙酸溶于异丙醇中，得到氯乙酸的异丙醇溶液；
③、将氯乙酸的异丙醇溶液加入到壳聚糖的异丙醇水溶液中，得到反应液Ⅰ；对反应液Ⅰ进行搅拌反应，最后加入乙醇溶液终止反应，再真空抽滤，得到固体反应产物Ⅰ；
④、对固体反应产物进行洗涤，得到脱水脱盐产物；将脱水脱盐产物在室温下真空干燥，得到淡黄色粉末，即为羧甲基壳聚糖；
二、制备邻苯二酚羧甲基壳聚糖：
①、将羧甲基壳聚糖加入到无水乙醇中，再溶胀，得到羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液；
②、向羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液中加入3,4-二羟基苯甲醛，再使用冰乙酸将体系的pH值调节至4～5，得到反应液Ⅱ；
③、将反应液Ⅱ进行搅拌回流反应，再真空抽滤，得到固体反应产物Ⅱ；
④、对固体反应产物Ⅱ进行洗涤，得到洗涤后的固体反应产物Ⅱ；使用无水乙醇对洗涤后的固体反应产物Ⅱ进行索氏萃取，得到萃取产物，将萃取产物进行真空干燥，得到棕黄色粉末，即为邻苯二酚羧甲基壳聚糖；
三、制备胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖：
①、将邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；向邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，再搅拌反应，得到活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；
②、向活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中加入胆碱，得到反应溶液Ⅲ；将反应溶液Ⅲ进行搅拌反应，得到反应产物Ⅲ；
③、将反应产物Ⅲ转移至透析袋中，于去离子水中透析，得到透析产物；将透析产物真空冷冻干燥，得到棕黄色粉末状产物，即为胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖；
四、制备胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料：
①、将胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；
②、将海藻酸钠溶于去离子水中，得到海藻酸钠溶液；
③、将胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合均匀，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液；
④、向胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液中加入吡咯，再超声处理，得到混合溶液Ⅰ；
⑤、将氯化铁和氯化钙溶解到去离子水中，得到混合溶液Ⅱ；
⑥、将混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ均匀混合，得到混合溶液Ⅲ；将混合溶液Ⅲ进行静置，得到胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤一①中所述的异丙醇水溶液中异丙醇和水的体积比为1:1；步骤一①中所述的壳聚糖与氢氧化钠的质量比为1:(8～12)；步骤一①中所述的壳聚糖异丙醇水溶液中壳聚糖的浓度为1.0mmol/mL～1.5mmol/mL；步骤一①中所述的溶胀碱化的温度为50℃～60℃，时间为60min～90min；步骤一②中所述的氯乙酸的异丙醇溶液的浓度为1.0mol/L～2.0mol/L；步骤一③中所述的反应液Ⅰ中氯乙酸与壳聚糖的摩尔比为10:1；步骤一③中所述的搅拌反应温度为50℃～70℃，搅拌速度为700r/min～1100r/min，搅拌反应的时间为4h～8h；步骤一③中所述的乙醇溶液的质量分数为70％～100％。其它步骤与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三至四之一不同点是：步骤一④中依次使用质量分数为70％乙醇溶液、质量分数为80％乙醇溶液、质量分数为90％乙醇溶液和无水乙醇对固体反应产物进行洗涤，得到脱水脱盐产物；步骤二①中所述的溶胀的温度为70℃～90℃，溶胀时间为2h～4h；步骤二①中所述的羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液的浓度为1.0mmol/mL～1.5mmol/mL；步骤二②中所述的反应溶液Ⅱ中3,4-二羟基苯甲醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:1。其它步骤与具体实施方式三至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三至五之一不同点是：步骤二③中所述的搅拌回流反应的温度为70℃～80℃，搅拌速度为700r/min～1100r/min，搅拌回流反应的时间为4h～6h；步骤二④中使用无水乙醇对固体反应产物Ⅱ进行洗涤3～4次，得到洗涤后的固体反应产物Ⅱ；步骤二④中所述的索氏萃取的温度为80℃～90℃，时间为4h～6h；步骤二④中将萃取产物在温度为70℃～90℃下进行真空干燥5h～7h。其它步骤与具体实施方式三至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三至六之一不同点是：步骤三①中所述的邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1.2mmol/mL～2.0mmol/mL；步骤三①中所述的搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的速度为700r/min～1100r/min，搅拌反应的时间为2h～4h；步骤三①中所述的活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中邻苯二酚羧甲基壳聚糖的浓度为1.2mmol/mL～2.0mmol/mL，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为3.6mmol/mL～6.0mmol/mL；步骤三②中所述的反应溶液Ⅲ中活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖与胆碱的摩尔比为1:1；步骤三②中所述的搅拌反应的温度为室温，搅拌速度为700r/min～1100r/min，搅拌反应的时间为8h～12h；步骤三②中所述的胆碱的制备方法是按以下步骤完成的：将250μL 2-氨基乙醇加入到50mL三颈烧瓶中，然后加入20mL无水甲醇和2g无水K2CO3，再向三颈烧瓶中通入氮气，在氮气气氛和磁力搅拌条件下加入500μL碘甲烷，最后在氮气气氛、室温和搅拌条件下搅拌10h，得到反应产物；将反应产物在25℃的烘箱中干燥12h，得到2-羟基-N',N',N'-三甲基乙胺，即为胆碱。其它步骤与具体实施方式三至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式三至七之一不同点是：步骤三③中所述的透析时间为48h～72h，透析袋截留分子量为3500～4500；步骤三③中所述的真空冷冻干燥的温度为-60℃～-45℃，真空冷冻干燥的时间为24h～48h；步骤四①中所述的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液的浓度为10mg/mL～20mg/mL；步骤四②中所述的海藻酸钠溶液的浓度为20mg/mL～40mg/mL。其它步骤与具体实施方式三至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式三至八之一不同点是：步骤四③中所述的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:2；步骤四④中所述的超声处理的功率为800W～1000W，超声处理的时间为30min～60min；步骤四④中所述的混合溶液Ⅰ中吡咯的浓度为0.2mg/mL～4mg/mL；步骤四⑤中所述的混合溶液Ⅱ中氯化铁的浓度为0.02mmol/mL～0.08mmol/mL，氯化钙的浓度为0.05mmol/mL～0.10mmol/mL；步骤四⑥中所述的静置时间为1min～10min，静置温度为室温；步骤四⑥中所述的混合溶液Ⅲ中胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖与氯化铁的摩尔比为3:(1～2)。其它步骤与具体实施方式三至八相同。
具体实施方式十：本实施方式是一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料作为促进缺损神经修复神经组织工程材料使用。
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。
实施例一：一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，是按以下步骤完成的：
一、制备羧甲基壳聚糖：
①、将壳聚糖和氢氧化钠加入到异丙醇水溶液中，再溶胀碱化，得到壳聚糖的异丙醇水溶液；
步骤一①中所述的异丙醇水溶液中异丙醇和水的体积比为1:1；
步骤一①中所述的壳聚糖与氢氧化钠的质量比为1:10；
步骤一①中所述的壳聚糖异丙醇水溶液中壳聚糖的浓度为1.0mmol/mL；
步骤一①中所述的溶胀碱化的温度为50℃，时间为90min；
②、将氯乙酸溶于异丙醇中，得到氯乙酸的异丙醇溶液；
步骤一②中所述的氯乙酸的异丙醇溶液的浓度为2.0mol/L；
③、将氯乙酸的异丙醇溶液加入到壳聚糖的异丙醇水溶液中，得到反应液Ⅰ；对反应液Ⅰ进行搅拌反应，最后加入乙醇溶液终止反应，再真空抽滤，得到固体反应产物Ⅰ；
步骤一③中所述的反应液Ⅰ中氯乙酸与壳聚糖的摩尔比为10:1；
步骤一③中所述的搅拌反应温度为60℃，搅拌速度为800r/min，搅拌反应的时间为6h；
步骤一③中所述的乙醇溶液的质量分数为70％；
④、对固体反应产物进行洗涤，得到脱水脱盐产物；将脱水脱盐产物在室温下真空干燥，得到淡黄色粉末，即为羧甲基壳聚糖；
步骤一④中依次使用质量分数为70％乙醇溶液、质量分数为80％乙醇溶液、质量分数为90％乙醇溶液和无水乙醇对固体反应产物进行洗涤，得到脱水脱盐产物；
二、制备邻苯二酚羧甲基壳聚糖：
①、将羧甲基壳聚糖加入到无水乙醇中，再溶胀，得到羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液；
步骤二①中所述的溶胀的温度为85℃，溶胀时间为2h；
步骤二①中所述的羧甲基壳聚糖的乙醇溶液的浓度为1.0mmol/mL；
②、向羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液中加入3,4-二羟基苯甲醛，再使用冰乙酸将体系的pH值调节至4，得到反应液Ⅱ；
步骤二②中所述的反应液Ⅱ中3,4-二羟基苯甲醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:1；
③、将反应液Ⅱ进行搅拌回流反应，再真空抽滤，得到固体反应产物Ⅱ；
步骤二③中所述的搅拌回流反应的温度为80℃，搅拌速度为800r/min，搅拌回流反应的时间为6h；
④、对固体反应产物Ⅱ进行洗涤，得到洗涤后的固体反应产物Ⅱ；使用无水乙醇对洗涤后的固体反应产物Ⅱ进行索氏萃取，得到萃取产物，将萃取产物进行真空干燥，得到棕黄色粉末，即为邻苯二酚羧甲基壳聚糖；
步骤二④中使用无水乙醇对固体反应产物Ⅱ进行洗涤4次，得到洗涤后的固体反应产物Ⅱ；
步骤二④中所述的索氏萃取的温度为85℃，时间为6h；
步骤二④中将萃取产物在温度为80℃下进行真空干燥6h；
三、制备胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖：
①、将邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；向邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，再搅拌反应，得到活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；
步骤三①中所述的邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1.2mmol/mL；
步骤三①中所述的搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的速度为800r/min，搅拌反应的时间为2h；
步骤三①中所述的活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中邻苯二酚羧甲基壳聚糖的浓度为1.2mmol/mL，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为3.6mmol/mL；
②、向活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中加入胆碱，得到反应溶液Ⅲ；将反应溶液Ⅲ进行搅拌反应，得到反应产物Ⅲ；
步骤三②中所述的反应溶液Ⅲ中活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖与胆碱的摩尔比为1:1；
步骤三②中所述的搅拌反应的温度为室温，搅拌速度为800r/min，搅拌反应的时间为12h；
步骤三②中所述的胆碱的制备方法是按以下步骤完成的：
将250μL 2-氨基乙醇加入到50mL三颈烧瓶中，然后加入20mL无水甲醇和2g无水K2CO3，再向三颈烧瓶中通入氮气，在氮气气氛和磁力搅拌条件下加入500μL碘甲烷，最后在氮气气氛、室温和搅拌条件下搅拌10h，得到反应产物；将反应产物在25℃的烘箱中干燥12h，得到2-羟基-N',N',N'-三甲基乙胺，即为胆碱；
③、将反应产物Ⅲ转移至透析袋中，于去离子水中透析，得到透析产物；将透析产物真空冷冻干燥，得到棕黄色粉末状产物，即为胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖；
步骤三③中所述的透析时间为72h，透析袋截留分子量为3500；
步骤三③中所述的真空冷冻干燥的温度为-60℃，真空冷冻干燥的时间为48h；
四、制备胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料：
①、将胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；
步骤四①中所述的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液的浓度为10mg/mL；
②、将海藻酸钠溶于去离子水中，得到海藻酸钠溶液；
步骤四②中所述的海藻酸钠溶液的浓度为10mg/mL；
③、将胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合均匀，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液；
步骤四③中所述的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:2；
④、向胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液中加入吡咯，再超声处理，得到混合溶液Ⅰ；
步骤四④中所述的超声处理的功率为1000W，超声处理的时间为30min；
步骤四④中所述的混合溶液Ⅰ中吡咯的浓度为2mg/mL；
⑤、将氯化铁和氯化钙溶解到去离子水中，得到混合溶液Ⅱ；
步骤四⑤中所述的混合溶液Ⅱ中氯化铁的浓度为0.02mmol/mL，氯化钙的浓度为0.05mmol/mL；
⑥、将混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ均匀混合，得到混合溶液Ⅲ；将混合溶液Ⅲ进行静置，得到胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料；
步骤四⑥中所述的静置时间为2min，静置温度为室温；
步骤四⑥中所述的混合溶液Ⅲ中胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖与氯化铁的摩尔比为3:2。
对比实施例：不含胆碱的多糖水凝胶是按以下步骤制备的：
①、将邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到溶液Ⅰ，浓度为10mg/mL；②、将海藻酸钠溶于去离子水中，得到溶液Ⅱ，浓度为10mg/mL；③、将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ均匀混合，得到混合溶液Ⅰ，所述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ体积比为1:2，向混合溶液Ⅰ中加入吡咯，超声频率为1000W条件处理30min，得到混合溶液Ⅱ，所述吡咯浓度为2mg/mL；④、配制氯化铁和氯化钙混合溶液Ⅲ，将混合溶液Ⅱ、混合溶液Ⅲ均匀混合，其中氯化铁的浓度为0.02mmol/mL，氯化钙的浓度为0.05mmol/mL；保持邻苯二酚羧甲基壳聚糖与氯化铁摩尔比为3:2，静置2min，静置温度为室温，得到不含胆碱的多糖水凝胶水凝胶。
图1是实施例一步骤一的反应机理图；
图2是实施例一步骤二的反应机理图；
图3是实施例一步骤三的反应机理图；
图4是实施例一步骤四的反应机理图；
从图4可知，本发明利用胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖侧链的邻苯二酚基团与铁离子配位交联形成第一物理交联网络，利用海藻酸钠支链的羧基与钙离子配位交联形成第二物理交联网络，最后利用吡咯被铁离子原位氧化聚合，形成导电聚合物聚吡咯，聚吡咯的仲胺与多糖上的羧基、羟基之间通过氢键作用结合，吸附至多糖骨架上，得到双交联多网络导电水凝胶，即胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
图5是实施例一步骤四的实物图；
图5中成胶前即为实施例一步骤四⑥得到的混合溶液Ⅲ，成胶后即为实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
图6是第一红外光谱图，图中a表示壳聚糖的红外光谱曲线，图中b表示实施例一步骤一④得到的羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线；
由图6可以看出，壳聚糖与羧甲基壳聚糖具有类似红外峰型，表明两者具有相似化学结构。但在羧甲基壳聚糖红外光谱图1600cm-1处和1420cm-1处出现羧基不对称伸缩振动吸收峰和对称伸缩振动吸收峰，说明羧甲基接枝至壳聚糖主链，得到羧甲基壳聚糖。
图7是第二红外光谱图，图中a表示实施例一步骤一④得到的羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线，b表示实施例一步骤二④得到的邻苯二酚羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线；
由图7可以看出，邻苯二酚羧甲基壳聚糖红外光谱图中，1565cm-1处为苯环骨架特征吸收峰；1258cm-1处为酚羟基的弯曲振动吸收峰，表明邻苯二酚基团已接枝至羧甲基壳聚糖。
图8是第三红外光谱图，图中a表示实施例一步骤二④得到的邻苯二酚羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线，b表示实施例一步骤三③得到的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖的红外光谱曲线；
由图8可知，在胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖的红外光谱图中，1397cm-1为与壳聚糖主链相连酯基中C-O伸缩振动特征吸收峰，1659cm-1处为酯基中C＝O伸缩振动特征吸收峰，证实借助酯化反应将胆碱接枝至邻苯二酚羧甲基壳聚糖。
图9是实施例一步骤一④得到的羧甲基壳聚糖以重水为溶剂的核磁共振氢谱图；
由图可知，4.34ppm处为羧甲基壳聚糖结构中C6羧甲基氢原子，说明壳聚糖发生羧甲基化。
图10是实施例一步骤二④得到的邻苯二酚羧甲基壳聚糖以重水为溶剂的核磁共振氢谱图；
由图10可知，6.7～7.3ppm处出现邻苯二酚基团中苯环1、2、3号氢原子，9.35ppm处为邻苯二酚基团中4号酚羟基氢原子，说明邻苯二酚基团成功接枝至羧甲基壳聚糖。
图11是实施例一步骤三③得到的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖以重水为溶剂的核磁共振氢谱图；
由图11可知，3.0ppm为季铵基团氢原子化学位移，3.57～3.65ppm为与季铵基团相连的甲基氢原子化学位移，表明特征官能团胆碱引入邻苯二酚羧甲基壳聚糖结构中。
图12是X-射线衍射谱图，图中a表示壳聚糖的X-射线衍射谱曲线，图中b表示实施例一步骤一④得到的羧甲基壳聚糖的X-射线衍射谱曲线；图中c表示实施例一步骤二④得到的邻苯二酚羧甲基壳聚糖的X-射线衍射谱曲线；图中d表示实施例一步骤三③得到的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖的X-射线衍射谱曲线；
从图12可以看出，图a中壳聚糖在10.3°、15.6°和19.7°处出现三个特征衍射峰，图b、c、d的羧甲基壳聚糖、邻苯二酚羧甲基壳聚糖、胆碱-羧甲基壳聚糖在10.3°和15.6°附近的衍射峰明显减弱，说明对壳聚糖修饰改性后破坏了其原有晶体结构，生成新物质。
图13是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的差示扫描量热法谱图；
由图13可知，水凝胶材料在188.5℃出现一个明显吸热峰，在329.33℃处出现第二个吸热峰，在568.83℃出现第三个吸热峰，三者分别为羧基-钙离子、酚羟基-铁离子及氢键三种物理作用力断裂所致，在573℃附近金属离子配位作用重新键合，出现放热峰，说明实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料存在可逆双金属阳离子配位作用及氢键作用力。
图14是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的热重分析图；
从图14可知，第一次质量显著下降出现于室温至180℃，质量损失约为7％，此为结合水挥发所致；温度继续上升，从230℃出现第二次明显质量下降，直至644℃左右逐渐平缓，质量损失约为54.02％，分析可能因为水凝胶三维交联网络中金属阳离子配位键断裂，分子结构开始降解，对应图12差示扫描量热法谱图，水凝胶网络交联作用力双金属阳离子配位作用破坏发生在此阶段。
图15是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料放大5000倍的扫描电镜图；
图16是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料放大10000倍的扫描电镜图；
图17是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料放大20000倍的扫描电镜图；
由图15～图17可知，实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料具有典型三维网状结构，孔洞相连，呈现良好凝胶状。经不同倍数放大，水凝胶表现出致密的微观孔洞结构，此为聚吡咯与多糖骨架通过氢键结合，分子链间距离拉近所致。
将实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料在温度为37℃条件下浸泡于去离子水中，在各时间节点取出，滤纸吸取表面水分后称重，直至质量稳定，见图18所示；
图18是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的溶胀率随时间变化图；
由图18可知，实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料在12h内溶胀率增加至348％后便趋于平稳，表现出优溶胀性能。
图19是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的流变性能测试图；图中■表示水凝胶的储能模量，图中□表示水凝胶的损耗模量；
从图19中可以看出，实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的储能模量大于耗能模量，表明样品呈类固体凝胶态；水凝胶材料储能模量存在动态频率依赖性，最低为2600Pa，最高为3980Pa，随剪切频率升高而增加，表明水凝胶具有较好动态力学性能。
图20是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料在降解性测试中重量随时间变化曲线；图中▲表示水凝胶在磷酸盐缓冲溶液中重量随时间变化曲线，图中△表示水凝胶在含有溶菌酶的磷酸盐缓冲溶液中重量随时间变化曲线；
由图20可知，水凝胶在磷酸盐缓冲溶液中未降解，表明实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料具有较好稳定性；在含有溶菌酶的磷酸盐缓冲溶液中，水凝胶开始降解，至20d时，降解率达50％，表明水凝胶具有较优生物降解性。
实施例二：本实施例与实施例一的不同点是：步骤四④中所述的混合溶液Ⅰ中吡咯的浓度为0.2mg/mL。其它步骤及参数与实施例一均相同。
实施例三：本实施例与实施例一的不同点是：步骤四④中所述的混合溶液Ⅰ中吡咯的浓度为0.5mg/mL。其它步骤及参数与实施例一均相同。
实施例四：本实施例与实施例一的不同点是：步骤四④中所述的混合溶液Ⅰ中吡咯的浓度为1mg/mL。其它步骤及参数与实施例一均相同。
实施例五：本实施例与实施例一的不同点是：步骤四④中所述的混合溶液Ⅰ中吡咯的浓度为4mg/mL。其它步骤及参数与实施例一均相同。
改变实施例四④中所述的混合溶液Ⅰ中吡咯的浓度，得到胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率随聚吡咯投料比变化图，见图21；
图21是胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率随聚吡咯投料比变化图，图中1为实施例二步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率，2为实施例三步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率，3为实施例四步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率，4为实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率，5为实施例五步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的电导率。
从图21中可以看出，聚吡咯含量升高致使水凝胶电导率显著上升，可达9.03×10- 3S·cm-1，说明水凝胶具有良好导电性能。
图22是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈实验图；图中a为水凝胶对金黄色葡萄球菌抑菌圈实验图，图中b为水凝胶对大肠杆菌抑菌圈实验图；
表1是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性；
表1
抑菌圈直径(mm) 胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶
金黄色葡萄球菌 12.9±0.11
大肠杆菌 12.5±0.06
图23是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌活性测试结果图；
由图22、表1和图23可知，含有席夫碱亚胺结构的水凝胶(即实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料)对金黄葡萄球菌及大肠杆菌展现出明显的抑菌作用，说明水凝胶具有抑菌活性。
图24是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料孵育PC-12细胞毒性结果，图中
Figure BDA0003007777790000161
表示实施例1步骤四得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶MTT实验吸光度值，图中
Figure BDA0003007777790000162
表示不含聚吡咯的多糖水凝胶MTT实验吸光度值；由图24可知，聚吡咯对细胞增殖几乎未产生影响，随细胞培养时间增延长，样品吸光度逐渐升高，说明细胞在水凝胶中均可正常生长、增殖，保持旺盛的增殖活力，表明水凝胶具有良好生物相容性。
图25是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料3D封装PC-12细胞后活-死细胞染色图；图中a、b、c、d分别为细胞在水凝胶内封装24h、48h、72h和96h时，经活-死细胞染色后活细胞数量；由图25可知，水凝胶内部细胞均大量存活，且伴随培养时间延长，活细胞数量显著增多，表明水凝胶对细胞生长未有显著影响，具有较高生物相容性。
实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料是应用方法试验：
小鼠麻醉后采用手术刀切开小鼠皮肤，用镊子小心拨开大腿肌肉暴露坐骨神经，采用手术钳压力损伤小鼠坐骨神经，施用实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料进行小鼠坐骨神经组织修复，分别在术后4周与8周对小鼠进行步态分析，在8周后取出小鼠坐骨神经，进行HE染色及透射电镜扫描，研究实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料对损伤神经的修复性能；再施用对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶进行小鼠坐骨神经组织修复，分别在术后4周与8周对小鼠进行步态分析，在8周后取出小鼠坐骨神经，进行HE染色及透射电镜扫描，研究对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶对损伤神经的修复性能；
图26是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后的小鼠步幅形态；图中A1、A2为健康小鼠在第4周和第8周时步幅形态，图中B1、B2为对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复小鼠损伤坐骨神经后，小鼠在第4周和第8周时步幅形态，图中C1、C2为实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶修复小鼠损伤坐骨神经后，小鼠在第4周和第8周时步幅形态；从图26中可以看出，使用对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶的小鼠步态印迹缺失、印迹浅淡，表明由坐骨神经主导的运动机能损失较严重。胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶组的实验小鼠步态虽与健康小鼠步态相比印迹仍较较浅，但步态形状较完整，说明水凝胶在一定程度上促进坐骨神经修复。
图27是小鼠坐骨神经指数分析图；图中
Figure BDA0003007777790000171
表示对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复损伤坐骨神经后的小鼠坐骨神经指数，图中
Figure BDA0003007777790000172
表示实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后的小鼠坐骨神经指数；从图27中可以看出，随术后恢复时间延长，实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料实验组的坐骨神经指数表现出一定程度增长，由-62.35增长至-48.57，而对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶实验组的小鼠坐骨神经指数在第4周与第8周分别为-85.57和-86.64，与胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料实验组产生显著差异，说明该实验组小鼠运动功能丧失较完全，此水凝胶未产生神经修复效果。说明实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料对神经的修复和再生起到了促进作用。
图28是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后的坐骨神经HE染色图；图中A1、A2、A3、A4分别为健康小鼠坐骨神经放大50、100、200、400倍的HE染色图，图中B1、B2、B3、B4为对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复小鼠损伤坐骨神经后，坐骨神经放大50、100、200、400倍的HE染色图，图中C1、C2、C3、C4为实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后，坐骨神经放大50、100、200、400倍的HE染色图；从图28中可以看出，对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复后的近端神经组织中神经纤维结构松散，分布散乱，其间还存在大量空泡组织，表明不含胆碱的多糖水凝胶未有效促进受损神经组织修复。采用实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复坐骨神经后，受损神经得到明显改善，其神经纤维结构逐渐恢复，有新生轴突出现，并且轴突周围依稀可见薄层髓鞘结构，神经纤维结构紧密，分布规则，空泡组织消失，表明水凝胶促进了受损神经组织修复，另外，染色结果未观察到白细胞的呈现，表明未引起炎症反应。
图29是实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后的坐骨神经透射电镜扫描图；图中A1、A2、A3为健康小鼠坐骨神经放大2000、5000、8000的透射电镜扫描图，图中B1、B2、B3为采用对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复小鼠损伤坐骨神经后，坐骨神经放大2000、5000、8000的透射电镜扫描图，图中C1、C2、C3为采用实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复小鼠损伤坐骨神经后，坐骨神经放大20000、5000、8000的透射电镜扫描图。
由图29可知，使用对比实施例制备的不含胆碱的多糖水凝胶修复后，坐骨神经内轴突产生偏移，神经纤维产生大面积空洞，髓鞘结构膨胀、松散，鞘板发生病变，出现明显脱髓现象，线粒体固缩、消失，产生空泡变，表明神经细胞有较明显损伤。采用实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料修复后，神经细胞周围施旺细胞增多，新生有髓神经纤维增加，线粒体未发生固缩或空泡变，髓鞘排列紧密，微丝在神经纤维内均匀分布，未出现明显脱髓现象，表明该组神经组织受损后发生修复改善，说明实施例一步骤四⑥得到的胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料具有良好促进缺损神经修复的性能，该功能性生物组织材料在神经组织工程材料中具有一定的应用前景。

Claims (10)

1.一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料，其特征在于一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料以壳聚糖为原料，在壳聚糖C6位羟基经醚化反应引入羧基，得到羧甲基壳聚糖，然后羧甲基壳聚糖与3,4-二羟基苯甲醛经席夫碱反应，获得邻苯二酚羧甲基壳聚糖，再将胆碱接枝至邻苯二酚羧甲基壳聚糖C6位羧基，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖，最后在胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液中添加吡咯、氯化铁和氯化钙，利用溶液中酚羟基与铁离子配位作用、羧基与钙离子配位作用以及聚吡咯与多糖之间氢键作用得到胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
2.根据权利要求1所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料，其特征在于所述的胆碱的制备方法是按以下步骤完成的：
将250μL 2-氨基乙醇加入到50mL三颈烧瓶中，然后加入20mL无水甲醇和2g无水K2CO3，再向三颈烧瓶中通入氮气，在氮气气氛和磁力搅拌条件下加入500μL碘甲烷，最后在氮气气氛、室温和搅拌条件下搅拌10h，得到反应产物；将反应产物在25℃的烘箱中干燥12h，得到2-羟基-N',N',N'-三甲基乙胺，即为胆碱。
3.如权利要求1所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，其特征在于一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法是按以下步骤完成的：
一、制备羧甲基壳聚糖：
①、将壳聚糖和氢氧化钠加入到异丙醇水溶液中，再溶胀碱化，得到壳聚糖的异丙醇水溶液；
②、将氯乙酸溶于异丙醇中，得到氯乙酸的异丙醇溶液；
③、将氯乙酸的异丙醇溶液加入到壳聚糖的异丙醇水溶液中，得到反应液Ⅰ；对反应液Ⅰ进行搅拌反应，最后加入乙醇溶液终止反应，再真空抽滤，得到固体反应产物Ⅰ；
④、对固体反应产物进行洗涤，得到脱水脱盐产物；将脱水脱盐产物在室温下真空干燥，得到淡黄色粉末，即为羧甲基壳聚糖；
二、制备邻苯二酚羧甲基壳聚糖：
①、将羧甲基壳聚糖加入到无水乙醇中，再溶胀，得到羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液；
②、向羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液中加入3,4-二羟基苯甲醛，再使用冰乙酸将体系的pH值调节至4～5，得到反应液Ⅱ；
③、将反应液Ⅱ进行搅拌回流反应，再真空抽滤，得到固体反应产物Ⅱ；
④、对固体反应产物Ⅱ进行洗涤，得到洗涤后的固体反应产物Ⅱ；使用无水乙醇对洗涤后的固体反应产物Ⅱ进行索氏萃取，得到萃取产物，将萃取产物进行真空干燥，得到棕黄色粉末，即为邻苯二酚羧甲基壳聚糖；
三、制备胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖：
①、将邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；向邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，再搅拌反应，得到活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；
②、向活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中加入胆碱，得到反应溶液Ⅲ；将反应溶液Ⅲ进行搅拌反应，得到反应产物Ⅲ；
③、将反应产物Ⅲ转移至透析袋中，于去离子水中透析，得到透析产物；将透析产物真空冷冻干燥，得到棕黄色粉末状产物，即为胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖；
四、制备胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料：
①、将胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液；
②、将海藻酸钠溶于去离子水中，得到海藻酸钠溶液；
③、将胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液混合均匀，得到胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液；
④、向胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖和海藻酸钠的混合溶液中加入吡咯，再超声处理，得到混合溶液Ⅰ；
⑤、将氯化铁和氯化钙溶解到去离子水中，得到混合溶液Ⅱ；
⑥、将混合溶液Ⅰ和混合溶液Ⅱ均匀混合，得到混合溶液Ⅲ；将混合溶液Ⅲ进行静置，得到胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料。
4.根据权利要求3所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤一①中所述的异丙醇水溶液中异丙醇和水的体积比为1:1；步骤一①中所述的壳聚糖与氢氧化钠的质量比为1:(8～12)；步骤一①中所述的壳聚糖异丙醇水溶液中壳聚糖的浓度为1.0mmol/mL～1.5mmol/mL；步骤一①中所述的溶胀碱化的温度为50℃～60℃，时间为60min～90min；步骤一②中所述的氯乙酸的异丙醇溶液的浓度为1.0mol/L～2.0mol/L；步骤一③中所述的反应液Ⅰ中氯乙酸与壳聚糖的摩尔比为10:1；步骤一③中所述的搅拌反应温度为50℃～70℃，搅拌速度为700r/min～1100r/min，搅拌反应的时间为4h～8h；步骤一③中所述的乙醇溶液的质量分数为70％～100％。
5.根据权利要求4所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤一④中依次使用质量分数为70％乙醇溶液、质量分数为80％乙醇溶液、质量分数为90％乙醇溶液和无水乙醇对固体反应产物进行洗涤，得到脱水脱盐产物；步骤二①中所述的溶胀的温度为70℃～90℃，溶胀时间为2h～4h；步骤二①中所述的羧甲基壳聚糖的无水乙醇溶液的浓度为1.0mmol/mL～1.5mmol/mL；步骤二②中所述的反应溶液Ⅱ中3,4-二羟基苯甲醛与羧甲基壳聚糖的摩尔比为1:1。
6.根据权利要求5所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤二③中所述的搅拌回流反应的温度为70℃～80℃，搅拌速度为700r/min～1100r/min，搅拌回流反应的时间为4h～6h；步骤二④中使用无水乙醇对固体反应产物Ⅱ进行洗涤3～4次，得到洗涤后的固体反应产物Ⅱ；步骤二④中所述的索氏萃取的温度为80℃～90℃，时间为4h～6h；步骤二④中将萃取产物在温度为70℃～90℃下进行真空干燥5h～7h。
7.根据权利要求6所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤三①中所述的邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液的浓度为1.2mmol/mL～2.0mmol/mL；步骤三①中所述的搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的速度为700r/min～1100r/min，搅拌反应的时间为2h～4h；步骤三①中所述的活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液中邻苯二酚羧甲基壳聚糖的浓度为1.2mmol/mL～2.0mmol/mL，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为3.6mmol/mL～6.0mmol/mL；步骤三②中所述的反应溶液Ⅲ中活化邻苯二酚羧甲基壳聚糖与胆碱的摩尔比为1:1；步骤三②中所述的搅拌反应的温度为室温，搅拌速度为700r/min～1100r/min，搅拌反应的时间为8h～12h；步骤三②中所述的胆碱的制备方法是按以下步骤完成的：将250μL 2-氨基乙醇加入到50mL三颈烧瓶中，然后加入20mL无水甲醇和2g无水K2CO3，再向三颈烧瓶中通入氮气，在氮气气氛和磁力搅拌条件下加入500μL碘甲烷，最后在氮气气氛、室温和搅拌条件下搅拌10h，得到反应产物；将反应产物在25℃的烘箱中干燥12h，得到2-羟基-N',N',N'-三甲基乙胺，即为胆碱。
8.根据权利要求7所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤三③中所述的透析时间为48h～72h，透析袋截留分子量为3500～4500；步骤三③中所述的真空冷冻干燥的温度为-60℃～-45℃，真空冷冻干燥的时间为24h～48h；步骤四①中所述的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液的浓度为10mg/mL～20mg/mL；步骤四②中所述的海藻酸钠溶液的浓度为20mg/mL～40mg/mL。
9.根据权利要求8所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的制备方法，其特征在于步骤四③中所述的胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:2；步骤四④中所述的超声处理的功率为800W～1000W，超声处理的时间为30min～60min；步骤四④中所述的混合溶液Ⅰ中吡咯的浓度为0.2mg/mL～4mg/mL；步骤四⑤中所述的混合溶液Ⅱ中氯化铁的浓度为0.02mmol/mL～0.08mmol/mL，氯化钙的浓度为0.05mmol/mL～0.10mmol/mL；步骤四⑥中所述的静置时间为1min～10min，静置温度为室温；步骤四⑥中所述的混合溶液Ⅲ中胆碱-邻苯二酚羧甲基壳聚糖与氯化铁的摩尔比为3:(1～2)。
10.如权利要求1～9任意一项所述的一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料的应用，其特征在于一种胆碱多糖导电神经组织工程水凝胶材料作为促进缺损神经修复神经组织工程材料使用。
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