CN112999411A - 具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：S1)将第一丝蛋白纳米纤维凝胶与水混合搅拌，得到流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶；将促血管再生的药物与第二丝蛋白纳米纤维凝胶混合，得到载药丝蛋白纳米纤维凝胶；S2)将所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶混合搅拌，得到具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。与现有技术相比，本发明通过调控丝蛋白纳米纤维凝胶的流变特性，实现凝胶温和压力下铺展定型形成超薄涂层的特殊功能，同时以丝蛋白纳米纤维为载体加载促血管再生药物，从而满足皮瓣均匀血管化的特殊需求。

Description

具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料、其制备方法 及应用

技术领域

本发明属于创面修复技术领域，尤其涉及一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料、其制备方法及应用。

背景技术

皮瓣移植是整形、烧伤、创伤等常用的治疗方式，能对创面提供有效保护，恢复皮肤功能。皮瓣移植成功的关键在于皮瓣和创基血管化网络的快速重构，从而能为皮瓣提供营养，避免皮瓣坏死。由于血供不足导致的皮瓣坏死是皮瓣移植手术失败的重要因素，也是制约皮瓣使用尺寸、形状和应用领域的核心问题。因此，如何提高皮瓣的促血管化能力，促进皮瓣和创基血管化网络的快速有效重构是皮瓣移植的关键问题，相关技术和产品在创面修复领域具有重要意义和广泛应用前景。

目前已有多种能够促进血管化的药物，并成功应用于临床，为实现皮瓣快速均匀血管化的要求，需要合适的载体对促血管化药物进行加载控释。具有优异生物相容性的凝胶体系不仅能够控制药物的控释，同时可为皮瓣再生提供基质，被认为是合适的载体材料，包含促血管化药物的凝胶敷料在促进真皮再生、骨组织修复等方面也表现出良好效果。然而，尽管多种生物材料载药凝胶也被尝试用于促进皮瓣的再生和血管化，由于皮瓣对血管化速率和均匀性的特殊要求，常规的载药凝胶难以获得良好预期效果。主要原因包括：(1)传统凝胶难以形成均一的涂层为皮瓣提供均匀的血管化刺激，而这种不均匀性自然带来皮瓣部分坏死；(2)尽管所载药物能够促进血管化，但凝胶本身会在皮瓣和创基之间形成物理障碍，限制两者之间血管化网络的快速形成。因此，理想的载药物凝胶敷料应该具有良好的可铺展性，能够均匀布满皮瓣和创基，同时所形成涂层应该足够薄，以避免凝胶本身的物理阻碍，根据其他研究结果，最好涂层的厚度能在200微米以下。同时，考虑到临床实际应用，具有压力可铺展性的凝胶，使用过程不会改变现有临床医生常规术式，是载药促血管化凝胶敷料的理想选择。然而，具有压力可铺展性，且所形成涂层满足低于200微米厚度要求的生物材料凝胶未见任何报道。

丝蛋白已被广泛尝试应用于创面修复领域，其具有优异的生物相容性，低炎症反应以及可吸收性。近年来，通过不同方式，研究者制备出不同构象和尺寸的丝蛋白纳米纤维凝胶和海绵，以进一步改善其对组织的修复能力。并且纳米纤维同时还可以加载不同药物，通过药物的控释实现不同功能。因此，考虑到丝蛋白在不同组织修复、凝胶制备以及不同药物加载控释等多方面的显著优势，以丝蛋白纳米纤维为基质，开发制备能满足皮瓣血管化特殊要求的凝胶敷料具有一定可行性，然而同其它生物材料相似，具有如上压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料、其制备方法及应用，该丝蛋白纳米纤维凝胶敷料可在温和压力下铺展定型形成超薄涂层。

本发明提供了一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

S1)将第一丝蛋白纳米纤维凝胶与水混合搅拌，得到流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶；

将促血管再生的药物与第二丝蛋白纳米纤维凝胶混合，得到载药丝蛋白纳米纤维凝胶；

S2)将所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶混合搅拌，得到具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

优选的，所述第一丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度为2～5wt％；所述第二丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度为0.3～2wt％；所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度为0.6～1.5wt％。

优选的，所述第一丝蛋白纳米纤维凝胶中的丝蛋白纳米纤维为高结晶丝蛋白纳米纤维；所述高结晶丝蛋白纳米纤维的结晶度大于等于40％；所述高结晶丝蛋白纳米纤维的直径为10～30nm；长度为0.1～3μm。

优选的，所述步骤S1)中混合搅拌的速率为200～5000rpm；混合搅拌的时间为1～48h；

混合的速率为10～800rpm；混合的时间为10min～12h；

混合后，离心，得到载药丝蛋白纳米纤维凝胶；

所述离心的速率为2000～15000rpm；离心的时间为5min～2h。

优选的，所述步骤S2)中流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶的体积比为(8～24)：1。

优选的，所述S2)中混合搅拌的速率为200～5000rpm；混合搅拌的时间为1～48h。

优选的，所述步骤S2)中混合搅拌后，还进行抽真空处理，得到具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

优选的，所述抽真空处理的真空度为0.01～100Pa；抽真空处理的时间为10～60min。

本发明还提供了一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料，所述丝蛋白纳米纤维凝胶敷料在压力作用下可铺展成厚度小于等于200微米的薄膜，且压力取消后仍维持铺展状态。

本发明还提供了一种上述丝蛋白纳米纤维凝胶敷料作为皮瓣移植用凝胶敷料的应用。

本发明提供了一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：S1)将第一丝蛋白纳米纤维凝胶与水混合搅拌，得到流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶；将促血管再生的药物与第二丝蛋白纳米纤维凝胶混合，得到载药丝蛋白纳米纤维凝胶；S2)将所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶混合搅拌，得到具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。与现有技术相比，本发明通过调控丝蛋白纳米纤维凝胶的流变特性，实现凝胶温和压力下铺展定型形成超薄涂层的特殊功能，同时以丝蛋白纳米纤维为载体加载促血管再生药物，从而满足皮瓣均匀血管化的特殊需求，且制备得到的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料在温和压力下可均匀铺展，在压力除去后仍可保持铺展状态，得到的涂层厚度低至200微米以下，从而消除凝胶对皮瓣和创基血管网络重建的阻碍作用；再者敷料加载的药物可缓慢释放，为皮瓣的血管化提供均匀稳定的刺激性环境，结合丝蛋白纳米纤维本身的生物相容性和促进组织修复的能力，有效改善皮瓣血管化水平，提高皮瓣的存活效率；并且该制备方法简单、得到的敷料性能稳定，易于规模化制备，促进血管化能力显著，不仅满足皮瓣血管化的需求，同时对其他创面的血管化具有良好的应用价值，市场前景广阔。

附图说明

图1为本发明提供的具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料作为创面修复凝胶敷料使用方法示意图；

图2为本发明实施例1中得到的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料及不同浓度的流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶的压力铺展效果测试图；

图3为本发明实施例1中浓度为2.5wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶稀释至0.8wt％未经剪切后的形态图；

图4为本发明实施例1中得到的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料的动物实验结果图；

图5为本发明实施例2中1wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶在搅拌前后的形态图；

图6为本发明实施例2步骤(3)中浓度为1wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶及加载60uMDFO的丝蛋白纳米纤维水凝胶的流变性能图；

图7为本发明实施例2中1wt％的丝蛋白纳米纤维水凝胶加载去铁胺前后的拉曼光谱图；

图8为本发明实施例3中加载内皮细胞生长因子后的丝蛋白纳米纤维水凝胶与1.1wt％浓度的丝蛋白纳米纤维水凝胶混合后在真空下去除气泡前后的图像；

图9为本发明实施例4中加载内皮细胞生长因子后的浓度为2wt％的丝蛋白纳米纤维水凝胶与1.3wt％浓度的丝蛋白纳米纤维水凝胶混合后在真空下去除气泡前后的图像；

图10为本发明实施例5中得到的载药丝蛋白纳米纤维凝胶的膨胀性能测试图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：S1)将第一丝蛋白纳米纤维凝胶与水混合搅拌，得到流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶；将促血管再生的药物与第二丝蛋白纳米纤维凝胶混合，得到载药丝蛋白纳米纤维凝胶；S2)将所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶混合搅拌，得到具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

本发明首先通过调整丝蛋白纳米纤维的浓度，调控丝蛋白纳米纤维凝胶的流变性到合适范围，随后通过合适的剪切作用，对流变性进行进一步调控，最终获得理想的流变性能，实现凝胶的温和压力可铺展。随后，将负载药物的丝蛋白纳米纤维同上述体系复合，通过两者比例的调整降低加入载药纳米纤维对体系流变性的影响，并通过再次搅拌的剪切处理，在实现药物均匀分散的同时，获得理想的性能。上述技术的关键在于对丝蛋白纳米纤维深度理解的基础上，优化丝蛋白纳米纤维浓度和剪切作用的协同，最终实现材料性能的突破，获得具有压力可铺展性能，且铺展后涂层厚度低于200微米的丝蛋白纳米纤维载药凝胶敷料。

并且，本发明所采用的制备方法，全部采用易于控制的物理方式，在水相中实现，方法简单可控，重复性好，有利于保持活性物质的活性，易于规模化生产，临床应用前景广阔。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

将第一丝蛋白纳米纤维凝胶与水混合搅拌，得到流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶；所述第一丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度优选为2～5wt％，更优选为2～4wt％，再优选为2～3wt％；在本发明提供的实施例中，所述第一丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度具体为2wt％、2.5wt％或3wt％；所述第一丝蛋白纳米纤维凝胶按照本领域技术人员熟知的制备方法制备即可，并无特殊的限制，在本发明中优选为：将丝蛋白纳米纤维水溶液40℃～60℃浓缩至浓度为6～12wt％的第一丝蛋白纳米纤维水溶液；将第一丝蛋白纳米纤维水溶液在20℃～35℃浓缩至浓度为18～24wt％的第二丝蛋白纳米纤维水溶液；将所述第二丝蛋白纳米纤维水溶液加水稀释至第三丝蛋白纳米纤维水溶液；将所述第三丝蛋白纳米纤维水溶液在50℃～70℃密封孵育，得到第一丝蛋白纳米纤维凝胶。所述第一丝蛋白纳米纤维凝胶中的丝蛋白纳米纤维优选为高结晶丝蛋白纳米纤维；高结晶丝蛋白纳米纤维具有高结晶度和高电荷密度，从而使得丝蛋白纳米纤维之间存在疏水作用和电荷作用的动态平衡，因此基于浓度的变化，丝蛋白纳米纤维在水中会存在由溶液态向凝胶态的逐渐转变，从而存在凝胶与溶液的中间态，能够在压力下铺展形成涂层，又能够铺展后固定在创面，为皮瓣提供持续支持；同时，丝蛋白纳米纤维高的负电荷密度赋予凝胶剪切变稀的性能，且由于负电荷导致丝蛋白纳米纤维之间的斥力，可以维持剪切处理后的流变性能，使得剪切后的凝胶在保持凝胶固态的前提下，铺展性能得到明显改善，因此，将浓度调控和剪切处理结合，在深入理解高晶丝蛋白纳米纤维内在结构和性能关系的基础上，通过浓度和剪切处理的协同作用，获得丝蛋白纳米纤维凝胶的理想状态，再结合丝蛋白纳米纤维载药特性，有望突破现有技术屏障，获得适用于皮瓣血管化的特殊丝蛋白纳米纤维凝胶敷料；所述高结晶丝蛋白纳米纤维的结晶度优选大于等于40％，更优选为40％～80％，再优选为40％～60％，最优选为40％～50％；所述高结晶丝蛋白纳米纤维的直径优选为10～30nm，更优选为15～25nm，再优选为20nm；长度优选为0.1～3μm，更优选为0.5～2.5μm，再优选为0.5～1.5μm，最优选为1μm；将第一丝蛋白纳米纤维凝胶与水混合搅拌；所述水优选为去离子水；所述混合搅拌的速率优选为200～5000rpm，更优选为500～4000rpm，再优选为600～3000rpm；在本发明提供的实施例中，所述混合搅拌的速率具体为800rpm、900rpm、600rpm、3000rpm或1600rpm；所述混合搅拌的时间优选为1～48h，更优选为2～46h；在本发明提供的实施例中，所述混合搅拌的时间具体为24h、46h、2h或3h；混合搅拌后得到的流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度优选为0.6～1.5wt％，更优选为0.8～1.3wt％；在本发明提供的实施例中，所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度具体为0.8wt％、1wt％、1.1wt％、1.3wt％、1.3wt％或1.2wt％。本发明通过特定构象和纳米结构的丝蛋白纳米纤维的选择，充分利用其疏水性和高负电性，通过纳米纤维浓度变化和剪切的协同作用调控疏水性和高负电性对凝胶理化性能的影响，最终获得能够在压力下铺展，形成厚度低于200微米涂层的丝蛋白纳米纤维凝胶，满足皮瓣再生的特殊要求。

将促血管再生的药物与第二丝蛋白纳米纤维凝胶混合；所述促血管再生的药物为本领域技术人员熟知的促血管化的药物即可，并无特殊的限制，其可为小分子药物、大分子药物或其他具有促血管化能力的功能分子，在本发明中优选为去铁胺或生长因子VEGF；所述第二丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度优选为0.3～2wt％，更优选为0.6～2wt％；在本发明提供的实施例中，所述第二丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度具体为1.2wt％、1wt％、2wt％或0.6wt％；所述第二丝蛋白纳米纤维凝胶可按照上述第一丝蛋白纳米纤维凝胶的方法进行制备即可；所述第二丝蛋白纳米纤维凝胶中丝蛋白纳米纤维也优选为高结晶丝蛋白纳米纤维；所述高结晶丝蛋白纳米纤维的结晶度优选大于等于40％，更优选为40％～80％，再优选为40％～60％，最优选为40％～50％；所述高结晶丝蛋白纳米纤维的直径优选为10～30nm，更优选为15～25nm，再优选为20nm；长度优选为0.1～3μm，更优选为0.5～2.5μm，再优选为0.5～1.5μm，最优选为1μm；所述混合的速率优选为10～800rpm，更优选为50～700rpm，再优选为100～600rpm；在本发明提供的实施例中，所述混合的速率具体为200rpm、400rpm、600rpm或100rpm；混合的时间优选为10min～12h，更优选为0.5～10h，再优选为2～10h；混合后体系中促血管再生的药物的浓度优选为0.01～5mg/ml，更优选为0.05～3mg/ml，再优选为0.06～2mg/ml；混合后，优选离心，得到载药丝蛋白纳米纤维凝胶；所述离心的速率优选为2000～15000rpm，更优选为5000～15000rpm，更优选为5000～14000rpm；在本发明提供的实施例中，所述离心的速率具体为12000rpm、14000rpm、9000rpm或5000rpm；所述离心的时间优选为5min～2h，更优选为10～100min，再优选为20～80min，最优选为25～60min。通过离心可除去未加载的药物。

在本发明中上述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶的制备并无先后顺序之分。

将所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶混合搅拌；所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶体积比优选为(8～24)：1；在本发明提供的实施例中，所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶体积比具体为8：1、15：1、24：1或12：1；所述混合搅拌的速率优选为200～5000rpm，更优选为500～4000rpm，再优选为500～2000rpm；在本发明提供的实施例中，所述混合搅拌的速率具体为1000rpm、600rpm、2000rpm或500rpm；混合搅拌的时间优选为1～48h，更优选为2～40h，再优选为2～30h，最优选为2～24h；在本发明提供的实施例中，所述混合搅拌的时间具体为6h、14h、4h、2h或24h。通过丝蛋白纳米纤维加载促血管化药物，利用相同丝蛋白纳米纤维易于相互分散的优势，实现药物在凝胶中的均匀分散，结合超薄涂层实现对皮瓣血管化的均匀作用，解决现有技术体系难以均匀作用的问题以及凝胶物理阻碍作用的问题，性能显著提高；同时药物负载在纳米纤维上，再同处理后的纳米纤维凝胶复合，并通过两者比例的调整，降低载药纳米纤维对凝胶体系本体流变性的影响，使得体系具有更高灵活性，可以根据不同要求，选择合适药物，以满足不同应用需求。

混合搅拌后，优选还进行抽真空处理，得到具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料；所述抽真空处理的真空度优选为0.01～100Pa，更优选为1～100Pa，再优选为5～100Pa，最优选为10～100Pa；抽真空处理的时间优选为10～60min，更优选为20～60min。通过抽真空处理可除去其中的气泡。

本发明通过调控丝蛋白纳米纤维凝胶的流变特性，实现凝胶温和压力下铺展定型形成超波涂层的特殊功能，同时以丝蛋白纳米纤维为载体加载促血管再生药物，从而满足皮瓣均匀血管化的特殊需求，且制备得到的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料在温和压力下可均匀铺展，在压力除去后仍可保持铺展状态，得到的涂层厚度低至200微米以下，从而消除凝胶对皮瓣和创基血管网络重建的阻碍作用；再者敷料加载的药物可缓慢释放，为皮瓣的血管化提供均匀稳定的刺激性环境，结合丝蛋白纳米纤维本身的生物相容性和促进组织修复的能力，有效改善皮瓣血管化水平，提高皮瓣的存活效率；并且该制备方法简单、得到的敷料性能稳定，易于规模化制备，促进血管化能力显著，不仅满足皮瓣血管化的需求，同时对其他创面的血管化具有良好的应用价值，市场前景广阔。

本发明还提供了一种上述方法制备的具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料，所述丝蛋白纳米纤维凝胶敷料在压力作用下可铺展成厚度小于等于200微米的薄膜，且压力取消后仍维持铺展状态。

其中，所述压力优选为500g。

本发明还提供了上述方法制备的具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料作为创面修复凝胶敷料的应用，尤其是皮瓣移植用凝胶敷料的应用。参见图1，图1为本发明提供的具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料作为创面修复凝胶敷料使用方法示意图。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料、其制备方法及应用进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

(1)将浓度为2.5wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)添加去离子水，将浓度调控到0.8wt％，利用磁力搅拌器在800rpm的速率下，搅拌24小时；

(2)将去铁胺粉末同浓度为1.2wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)混合，使得去铁胺浓度为1mg/ml，在200rpm的速率下搅拌4小时，随后在12000rpm的转速下离心30分钟，底部为载药的丝蛋白纳米纤维凝胶；

(3)将上述载药纳米纤维凝胶和(1)中搅拌处理的凝胶按照1:15的体积比混合，然后在1000rpm的转速下搅拌6小时，使得两种凝胶充分混合，且混合凝胶的流变性调整到合适程度；

(4)将上述丝蛋白载药纳米纤维凝胶在60Pa的真空度下抽真空50分钟，去除气泡，获得最终的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

同时将浓度为2.5wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)添加去离子水，将浓度调控到0.3～2wt％，利用磁力搅拌器在800rpm的速率下，搅拌24小时，得到流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

对实施例1中得到的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料及不同浓度的流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶的压力铺展效果进行测试，压力为500g，得到其结果如图2所示，其中a～c为实施例1中得到的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料的压力铺展效果图，可以看到凝胶在玻璃板和动物创面上均可以均匀铺展，且压力去除后不会收缩；图2中d为不同浓度的流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶的压力铺展效果图，可以看到，浓度过高，凝胶在压力取消后会收缩，浓度过低，凝胶流动性太好，容易流失。

图3为浓度为2.5wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶稀释至0.8wt％未经剪切后的形态图。从图3中可以看出未经剪切处理的凝胶没有合理的流动性，不具备合理的压力铺展性能。

图4为实施例1中得到的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料的动物实验结果图，其中Control为对照图，不经任何处理，SNF为步骤(1)中得到流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶，SNF-DFO为实施例1中得到的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。由图4可以看出，实施例1中得到的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料可均匀分布在皮瓣和创基之间，并铺满整个皮瓣，皮瓣的存活率和血管化网络程度均显著改善。动物实验过程中，将大鼠以4％浓度的水合氯醛腹腔注射麻醉(1ml/100g)后，剃除背部毛发，室温下大鼠以俯卧位置于手术台上，标记双侧髂后上棘位置，设计大鼠背部“乒乓拍”形狭长窄蒂皮瓣，蒂部起点为两侧髂棘连线水平，蒂宽1cm，蒂长3cm，圆形瓣部直径3cm；用75％乙醇进行皮肤消毒；手术刀沿设计线切开皮肤全层，保留蒂部连接，将皮瓣自肉膜层掀起，全层分离后，回移植，用5-0可吸收线原位缝合，间断缝合结束前自创口边缘将0.5ml材料(空白组、SNF、SNF-DFO)推注至皮瓣与基底之间，完成缝合，以指腹约500g压力于皮瓣上方轻柔按摩，使材料铺展于皮瓣下方，清洁纱布包扎，手术时长控制在30分钟内，术后不使用抗生素，大鼠分笼饲养。

实施例2

(1)将浓度为2wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)添加去离子水，将浓度调控到1wt％，利用磁力搅拌器在900rpm的速率下，搅拌24小时；

(2)将去铁胺粉末同浓度为1wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)混合，使得去铁胺浓度为2mg/ml，在200rpm的速率下搅拌6小时，随后在14000rpm的转速下离心25分钟，底部为载药的丝蛋白纳米纤维凝胶；

(3)将上述载药纳米纤维凝胶和(1)中搅拌处理的凝胶按照1:24的体积比混合，然后在600rpm的转速下搅拌14小时，使得两种凝胶充分混合，且混合凝胶的流变性调整到合适程度；

(4)将上述丝蛋白载药纳米纤维凝胶在100Pa的真空度下抽真空60分钟，去除气泡，获得最终的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

图5为浓度为1wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶在搅拌前后的形态图，可以看出，经过搅拌获得了良好的流动性和可铺展性，未经搅拌处理的凝胶没有合理的流动性，不具备合理的压力铺展性能。

图6为步骤(3)中浓度为1wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶及加载60uMDFO的丝蛋白纳米纤维水凝胶的流变性能图，从中可以看出，加入小分子药物对凝胶材料的流变性能没有明显改变，药物的加载仅使得丝蛋白纳米纤维水凝胶在低剪切速率时有少许黏度增加的现象。

图7为1wt％的丝蛋白纳米纤维水凝胶加载去铁胺前后的拉曼光谱图，加载去铁胺后的拉曼光谱上同时具有丝蛋白和去铁胺的特征峰，证实去铁胺的加载。

实施例3

(1)将浓度为2wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)添加去离子水，将浓度调控到1.1wt％，利用磁力搅拌器在600rpm的速率下，搅拌46小时；

(2)将内皮细胞生长因子粉末同浓度为1.2wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)混合，使得内皮生长因子浓度为60μg/ml，在400rpm的速率下搅拌4小时，随后在9000rpm的转速下离心60分钟，底部为载药的丝蛋白纳米纤维凝胶；

(3)将上述载药纳米纤维凝胶和(1)中搅拌处理的凝胶按照1:8的体积比混合，然后在2000rpm的转速下搅拌4小时，使得两种凝胶充分混合，且混合凝胶的流变性调整到合适程度；

(4)将上述丝蛋白载药纳米纤维凝胶在40Pa的真空度下抽真空30分钟，去除气泡，获得最终的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

图8为加载内皮细胞生长因子后的丝蛋白纳米纤维水凝胶与1.1wt％浓度的丝蛋白纳米纤维水凝胶混合后在真空下去除气泡前后的图像。

实施例4

(1)将浓度为3wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)添加去离子水，将浓度调控到1.3wt％，利用磁力搅拌器在3000rpm的速率下，搅拌2小时；

(2)将内皮细胞生长因子粉末同浓度为2wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)混合，使得内皮生长因子浓度为100μg/ml，在600rpm的速率下搅拌2小时，随后在5000rpm的转速下离心60分钟，底部为载药的丝蛋白纳米纤维凝胶；

(3)将上述载药纳米纤维凝胶和(1)中搅拌处理的凝胶按照1:12的体积比混合，然后在2000rpm的转速下搅拌2小时，使得两种凝胶充分混合，且混合凝胶的流变性调整到合适程度；

(4)将上述丝蛋白载药纳米纤维凝胶在10Pa的真空度下抽真空30分钟，去除气泡，获得最终的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

图9为加载内皮细胞生长因子后的浓度为2wt％的丝蛋白纳米纤维水凝胶与1.3wt％浓度的丝蛋白纳米纤维水凝胶混合后在真空下去除气泡前后的图像。

实施例5

(1)将浓度为2wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)添加去离子水，将浓度调控到1.2wt％，利用磁力搅拌器在1600rpm的速率下，搅拌3小时；

(2)将去铁胺粉末同浓度为0.6wt％的丝蛋白纳米纤维凝胶(丝蛋白纳米纤维的结晶度为40％，直径为20nm，长度为1μm)混合，使得去铁胺浓度为1.2mg/ml，在100rpm的速率下搅拌10小时，随后在12000rpm的转速下离心60分钟，底部为载药的丝蛋白纳米纤维凝胶；

(3)将上述载药纳米纤维凝胶和(1)中搅拌处理的凝胶按照1:12的体积比混合，然后在500rpm的转速下搅拌24小时，使得两种凝胶充分混合，且混合凝胶的流变性调整到合适程度；

(4)将上述丝蛋白载药纳米纤维凝胶在10Pa的真空度下抽真空20分钟，去除气泡，获得最终的载药丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

图10为制备所得丝蛋白纳米纤维凝胶的膨胀性能测试，经过测试，丝蛋白纳米纤维水凝胶及加载药物的丝蛋白纳米纤维水凝胶在37℃，与模拟人体内环境组织液的pH＝7.4的盐溶液接触时，在长时间(超过24h)下体积未发生明显变化(体积变化＜10％)。

Claims (10)

1.一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1)将第一丝蛋白纳米纤维凝胶与水混合搅拌，得到流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶；

将促血管再生的药物与第二丝蛋白纳米纤维凝胶混合，得到载药丝蛋白纳米纤维凝胶；

S2)将所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶混合搅拌，得到具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度为2～5wt％；所述第二丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度为0.3～2wt％；所述流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶的浓度为0.6～1.5wt％。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一丝蛋白纳米纤维凝胶中的丝蛋白纳米纤维为高结晶丝蛋白纳米纤维；所述高结晶丝蛋白纳米纤维的结晶度大于等于40％；所述高结晶丝蛋白纳米纤维的直径为10～30nm；长度为0.1～3μm。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1)中混合搅拌的速率为200～5000rpm；混合搅拌的时间为1～48h；

混合的速率为10～800rpm；混合的时间为10min～12h；

混合后，离心，得到载药丝蛋白纳米纤维凝胶；

所述离心的速率为2000～15000rpm；离心的时间为5min～2h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2)中流变性改变的丝蛋白纳米纤维凝胶与载药丝蛋白纳米纤维凝胶的体积比为(8～24)：1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2)中混合搅拌的速率为200～5000rpm；混合搅拌的时间为1～48h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2)中混合搅拌后，还进行抽真空处理，得到具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述抽真空处理的真空度为0.01～100Pa；抽真空处理的时间为10～60min。

9.一种具备压力可铺展性的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料，其特征在于，所述丝蛋白纳米纤维凝胶敷料在压力作用下可铺展成厚度小于等于200微米的薄膜，且压力取消后仍维持铺展状态。

10.权利要求1～8任意一项制备方法所述制备的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料或权利要求9所述的丝蛋白纳米纤维凝胶敷料作为皮瓣移植用凝胶敷料的应用。

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