CN112985636B - 单细胞温度分布的激光拉曼测量方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单细胞温度分布的激光拉曼测量方法及其用途。该方法包括：制备用于加热细胞的微米电极阵列芯片和温度传感器；获得二维材料导热层拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系；使细胞直接生成在绝缘导热层上；使二维材料导热层与细胞接触，通过微米电极阵列对细胞进行加热，并逐点测量目标细胞上方二维材料导热层的拉曼光谱信号，获得全场的拉曼光谱分布图；基于二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系和二维材料导热层中每一点的拉曼光谱特征峰的波数偏移量，获得目标细胞全场的温度分布。该方法能解决测量活体细胞全场温度分布的难题，加深对细胞生理行为的了解，促进疾病病理研究、药物研发等相关领域的进一步发展。
Description
技术领域
本发明属于活体细胞生物特征测量领域，具体而言，涉及单细胞温度分布的激光拉曼测量方法及其用途。
背景技术
细胞是生物学中构成生物体基本的结构和功能单位，通过对细胞进行观测与实验分析不仅能够深入了解细胞内各项生理活动的进行过程，更有利于对各种疾病开展病理研究并促进药物研发、疾病诊疗等相关领域的发展。温度是影响细胞内各种生化反应(如能量转化、基因表达、分裂分化等)的极其重要的物理参数，因此人们对在单细胞尺度上进行无创精确的温度测量产生了浓厚的兴趣。由于单个细胞温度测量需要同时满足高温度分辨率、高时空分辨率、抗环境干扰能力强等多重要求，传统常规的测温方式如热电偶测温、红外热像仪测温空间分辨率低(目前可以达到的空间分辨率约10μm)，很难在细胞水平上得以应用。值得欣慰的是，随着微纳加工技术的发展，越来越多的亚微米高分辨率测温技术涌现出来。
目前已有的测量单个细胞温度的方法主要分为发光式细胞测温技术与非发光式细胞测温技术两大类。发光式测温技术可以通过荧光标记物的荧光发射强度、温度依赖性荧光寿命、量子点发光峰波长漂移等将细胞温度实时测量出来，例如Kohki等利用FPT荧光聚合物的荧光寿命作为温度相关的参数，辅以荧光寿命成像显微镜于2011年首次对外公布了单个细胞的温度图谱，该方法的空间分辨率为200nm，温度分辨率在0.18-0.58℃之间。非发光式细胞测温技术则包括了多种测温方法，如(1)扫描热显微镜：其在原子力显微镜(AFM：Atomic Force Microscope)悬臂梁探针尖端放置金属热电偶结，由于点接触结的热电动势仅依赖于接触点的局部温度，因此通过测量接触点的热电动势即可得到对应的温度，温度分辨率在0.01K左右，空间分辨率小于100nm；(2)碳纳米管温度计：在323-773K的温度范围内Ga(镓)的热膨胀系数呈线性和可重复性变化，故此法通过碳纳米管内一维纳米液体Ga(镓)的热膨胀来对温度进行测量；(3)基于生物实体的测温技术：活细胞能够感知生理生长范围内的温度变化和有害的温度上升或下降，并诱导所谓的冷休克或热休克蛋白，这样的温度感应是通过蛋白质或核酸的构象变化直接响应或者通过复杂的调节电路间接响应来实现的。
从现如今已有的测温方法来看，在发光式测温技术中，有机荧光团容易受到光漂白的破坏，导致无法进行连续长期的温度测量，这对跟踪不同时间尺度的温度变化非常不利；量子点测温技术的主要局限性表现为量子点材料不良的溶解性、不稳定性及对生物细胞的毒性，此外在连续照射条件下，量子点发光的蓝移、漂白、闪烁也会对结果造成影响；扫描热显微镜虽然具有亚微米的空间分辨率且能够采集全场的温度分布，但是接触式热电偶容易破坏细胞的完整性，测量过程中热电偶和柔性细胞膜也难以保证良好接触，此外细胞复杂的电场也会影响测温精度；基于生物实体的测温技术因其具有生物特异性与选择性，难以广泛用于一般细胞的温度测量。现有某些RNA温度计在真细菌中可以使用，但仍需要根据给定菌种的生长特性进行修正。
综上所述，现有的细胞测温方法存在诸多局限：易受环境影响、无法测量活体细胞、稳定性不强、缺乏普适性、无法进行全场测温等等，尚缺乏一种可以准确测量活体细胞温度分布的原位无损方法，制约了单细胞内在生理活动的深入研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出单细胞温度分布的激光拉曼测量方法及其用途。该测量方法能够解决测量活体细胞全场温度分布的难题，加深对细胞生理行为的了解，促进疾病病理研究、药物研发等相关领域的进一步发展。
根据本发明的第一个方面，本发明提出了一种激光拉曼测量单细胞温度分布的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)制备用于加热细胞的微米电极阵列芯片，所述芯片中电极层上方形成有适于细胞生长的绝缘导热层；
(2)在光学玻璃上形成二维材料导热层，以便得到温度传感器；
(3)测量所述二维材料导热层在不同温度下的拉曼光谱图，以便获得所述二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系；
(4)使细胞直接生成在所述绝缘导热层上；
(5)使所述二维材料导热层与所述细胞接触，通过所述微米电极阵列对所述细胞进行加热，并逐点测量目标细胞上方二维材料导热层的拉曼光谱信号，获得全场的拉曼光谱分布图；
(6)基于所述二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系和所述二维材料导热层中每一点的拉曼光谱特征峰的波数偏移量，获得目标细胞全场的温度分布。
本发明上述实施例的激光拉曼测量单细胞温度分布的方法至少具有以下有益效果：(1)通过使用二维材料导热层作为温度传感器，能够原位无损的测量活体单细胞的温度分布，具体地，可以将二维材料导热层贴合在单细胞表面，利用二维材料拉曼光谱特征峰频率的温度依赖性实现细胞温度分布的准确测量；(2)可结合扫描振镜和可移动平台实现纳米量级的空间分辨率，测量单细胞温度分布；(3)二维材料拉曼光谱特征峰的高温度灵敏度可以保证细胞温度测量结果的精确性和可信度；(4)该方法为非接触式定量测量方法，选择适当的激光功率及微电极加热功率，可以保证测量过程对生物细胞无损伤，实现活体细胞的温度测量；(5)该方法在单细胞生理活性、病理研究和药物开发等领域有广阔的应用前景。
另外，根据本发明上述实施例的激光拉曼测量单细胞温度分布的方法还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，步骤(1)至少满足以下条件之一：所述微米电极阵列为蛇形结构、螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构；所述微米电极阵列为串联和/或并联结构；所述微米电极阵列包括多个加热区，相邻两个所述加热区通过电极线相连，多个所述加热区和电极线构成蛇形结构、螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构；所述微米电极阵列包括多个加热区，相邻两个所述加热区通过电极线相连，每个所述加热区分别独立地由电极线构成蛇形结构、螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构；任选地，连接相邻两个所述加热区的电极线宽不大于100μm，每个所述加热区中的电极线宽不大于5μm；任选地，连接相邻两个所述加热区的电极线宽为20～100μm，每个所述加热区中的电极线宽为1～5μm。
在本发明的一些实施例中，步骤(1)中，所述微米电极阵列芯片采用如下步骤制备得到：
(1-1)在硅基底上形成紫外光刻胶层，利用紫外光刻法将所述紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案；或者，预先利用反应离子刻蚀法在硅基底上形成凹槽，再在所述凹槽内形成紫外光刻胶层，利用紫外光刻法将所述紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案；
(1-2)在步骤(1-1)得到的硅基底上依次沉积粘附层和电极层；
(1-3)去除所述光刻胶层及其上沉积的粘附层和电极层，以便得到目标结构的电极阵列；
(1-4)在步骤(1-3)得到的硅基底上沉积绝缘导热层，以便覆盖所述电极阵列，得到微米电极阵列芯片。
在本发明的一些实施例中，至少满足以下条件之一：所述粘附层的厚度为8～12nm，所述电极层的厚度为100～300nm；所述绝缘导热层为二氧化硅层；所述粘附层为钛层，所述电极层为铂层；所述粘附层为铬层，所述电极层为金层。
在本发明的一些实施例中，步骤(2)至少满足以下条件之一：所述二维材料为二维纳米材料；所述二维材料导热层的总厚度不大于1nm；所述二维材料导热层为选自石墨烯层、二硫化钼层、二硫化钨层和二硒化钼层中的至少之一；所述二维材料导热层为单层石墨烯层；所述温度传感器采用如下步骤制备得到：(2-1)在铜箔上形成二维材料导热层，并在所述二维材料导热层上形成支撑层；(2-2)去除所述铜箔，并利用所述支撑层将所述二维材料导热层转移至光学玻璃上；(2-3)去除所述支撑层，以便得到所述温度传感器。
在本发明的一些实施例中，步骤(3)进一步包括：
(3-1)将承载有所述二维材料导热层的光学玻璃置于控温平台上，利用所述控温平台将所述二维材料导热层加热至T1，并测量所述二维材料在T1温度下的拉曼光谱图，记录拉曼光谱目标特征峰对应的波数w1；
(3-2)将所述控温平台的温度调整到Tn，测量所述二维材料在Tn温度下的拉曼光谱图，记录其在Tn温度下拉曼光谱目标特征峰对应的波数wn，其中，Tn为不同于T1的任意温度；
(3-3)重复步骤(3-2)的操作，以便得到所述二维材料在多个不同温度下其拉曼光谱目标特征峰分别对应的波数；
(3-4)基于所述二维材料在多个不同温度下其拉曼光谱目标特征峰对应的波数与温度的一一对应关系，获得其拉曼光谱目标特征峰对应的波数与温度的线性关系，其中所述线性关系为：
ωg＝ω0+χTg，
Tg为任意温度；
ωg为在温度Tg下所述二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数；
ω0为温度Tg为0K时所述二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数；
χ为所述二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数随温度变化的一阶线性系数。
在本发明的一些实施例中，至少满足以下条件之一：所述二维材料拉曼光谱目标特征峰在Tn温度下对应的波数wn随温度变化的系数值χn为
所述线性系数χ为多个不同温度下获得的系数值经线性拟合得到的；所述二维材料导热层为单层石墨烯层，其拉曼光谱目标特征峰为G峰(～1580cm-1)。
在本发明的一些实施例中，步骤(4)中至少满足以下条件之一：所述细胞生长的面密度为10～20个/500μm2；预先对所述芯片进行消毒，再将所述芯片置于细胞培养箱中；使所述二维材料导热层与所述细胞接触后，在所述光学玻璃周围涂抹凡士林进行密封。
在本发明的一些实施例中，步骤(5)进一步包括：将直流电源、高精度电流表和电压表接到微米电极阵列芯片的引脚上，测量微米电极加热区两端的电压U和流过的电流I，计算电阻R和加热功率P，通过改变电加热功率P以精确控制微米电极的温度。
根据本发明的第二个方面，本发明提出了上述激光拉曼测量单细胞温度分布的方法在活体细胞生物特征测量、药物研发、疾病病理研究中的用途。相对于现有细胞测温方法存在的易受环境影响、无法测量活体细胞、稳定性不强、缺乏普适性、无法进行全场测温等的缺陷，采用本发明上述实施例的激光拉曼测量单细胞温度分布的方法不仅可以实现活体细胞温度分布的原位无损测量，还可以保证细胞温度测量结果的精确性和可信度，解决了测量活体细胞全场温度分布的难题。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的激光拉曼测量单细胞温度分布的方法流程图；
图2是根据本发明再一个实施例的激光拉曼测量单细胞温度分布的方法流程图；
图3是根据本发明一个实施例的微米电极阵列排布示意图及单电极加热区结构示意图；
图4是根据本发明一个实施例的成功培养的目标细胞的SEM图像，其中图4中(a)和(b)分别对应不同的区域；
图5是根据本发明一个实施例的原位无损、快速高精度的拉曼成像装置示意图；
图6是根据本发明一个实施例的温度传感器与目标细胞对正贴合的3D示意图；
图7是根据本发明一个实施例的测量温度分布时的装置结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的第一个方面，本发明提出了一种激光拉曼测量单细胞温度分布的方法。根据本发明的实施例，该方法如图1所示，该方法在测温时采用非接触式加热法对细胞进行加热，使用二维材料导热层作为温度传感器，能够原位无损的测量活体单细胞的温度分布，具体地，可以将二维材料导热层贴合在单细胞表面，利用二维材料拉曼光谱特征峰频率的温度依赖性实现细胞温度分布的准确测量，其中，采用的原位无损、快速高精度的拉曼成像装置示意图可以如图5所示，由此可以解决现有技术中测量活体细胞全场温度分布的难题，加深对细胞生理行为的了解，促进疾病病理研究、药物研发等相关领域的进一步发展。
下面参考图1～7对本发明上述实施例的激光拉曼测量单细胞温度分布的方法进行详细描述。
S100:制备用于加热细胞的微米电极阵列芯片，芯片中电极层上方形成有适于细胞生长的绝缘导热层
根据本发明的实施例，可以预先在芯片基底上形成适于对细胞进行加热的微米电极阵列，再在微米电极阵列上方覆盖一层适于作为生长基底培养合适类型细胞的绝缘导热层，在测温时通过绝缘导热层对细胞进行间接加热，并结合温度传感器对单细胞进行原位温度测量，可以有效避免对活体细胞造成损伤。
根据本发明的一个具体实施例，本发明中在芯片基底上形成的微米电极阵列可以为如图3所示的蛇形结构，也可以为螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构等，由此能够有效增大受热面积，使得整个区域内的细胞被均匀加热至目标温度。需要说明的是，本发明中形成的微米电极阵列中将芯片划分为不同的电极加热区，不同电极加热区的电极的连接方式可以包括串联和/或并联结构。具体地，参考图3所示，微米电极阵列可以包括多个加热区，相邻两个加热区可以通过电极线相连，多个加热区和电极线可以构成蛇形结构、螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构(宏观结构)；进一步地，参考图3中其中一个加热区的放大图所示，每个加热区还可以分别独立地由电极线构成蛇形结构、螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构(微观结构)，由此可以进一步提高整个区域内细胞受热的均匀性。另外，需要说明的是，本发明微米电极阵列中的电极线宽并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，例如，连接相邻两个加热区的电极线宽(如图3中d2所示的距离)可以不大于100μm，如可以为10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm等；每个加热区中的电极线宽(如图3中d1所示的距离)可以不大于5μm，如可以为1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm等。优选地，连接相邻两个加热区的电极线宽可以为20～100μm，每个加热区中的电极线宽可以为1～5μm。根据本发明的一个具体示例，以图3中蛇形结构的微米电极阵列为例，连接相邻两个加热区的电极线宽d2可以为20μm，每个加热区中的电极线宽d1可以为1μm。
根据本发明的再一个具体实施例，微米电极阵列的结构可以借助紫外光刻胶及紫外光刻法、物理和/或化学气相沉积法得到，具体地，参考图2所示，微米电极阵列芯片可以采用如下步骤制备得到：
(1-1)参考图2中①所示，在硅基底上形成紫外光刻胶层，利用紫外光刻法将紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案，采用该方式获得芯片中，当使二维材料导热层与细胞接触后，可以在光学玻璃周围涂抹凡士林进行密封。
或者，可以预先利用反应离子刻蚀法在硅基底上形成凹槽，再在凹槽内形成紫外光刻胶层，利用紫外光刻法将紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案。例如，可以在硅基底上预先加工长宽为100μm×100μm，深度为50～100μm的深槽，再在深硅槽内旋涂一层厚度为10μm左右的紫外光刻胶层，结合紫外光刻技术形成与目标电极阵列结构匹配的图案。采用该方式可以使最终形成的芯片中的绝缘导热层略低于硅基底的边缘，由此当将二维材料导热层与细胞接触时，硅基底的边缘可以起到一定的支撑和密封作用，从而既可以省去涂抹凡士林的操作，也可以避免出现使二维材料导热层与细胞接触时因压合力过大而损伤活体细胞的情况。
(1-2)参考图2中②所示，在步骤(1-1)得到的硅基底上依次沉积粘附层和电极层。通过预先形成粘附层再形成电极层可以进一步提高电极层与硅基底的结合强度，其中，可以采用电子束物理气相沉积法沉积粘附层和电极层，当粘附层为钛层时，电极层可以为铂层；当粘附层为铬层时，电极层可以为金层。鉴于铂的热效应更加明显，可以优选以钛作为粘附材料，以铂作加热电极材料。进一步地，粘附层的厚度可以为8～12nm，例如可以为8nm、9nm、10nm、11nm或12nm等，电极层的厚度可以为100～300nm，例如可以为100nm、120nm、140nm、160nm、180nm、200nm、220nm、240nm、260nm、280nm或300nm等，通过控制粘附层和电极层为上述厚度范围，可以保证电极层具有良好的机械强度和导电性，提高测量设备的可靠性和实用性。
(1-3)去除光刻胶层及其上沉积的粘附层和电极层，以便得到目标结构的电极阵列。具体地，可以将步骤(1-2)得到的芯片浸入45℃的ZDMAC(二甲基乙酰胺)溶液中10min去胶，之后将芯片浸入去离子水中漂洗，实现非电极阵列区域的光刻胶及其上沉积的粘附层和电极层的去除。
(1-4)参考图2中③所示，在步骤(1-3)得到的硅基底上沉积绝缘导热层，以便覆盖电极阵列，得到微米电极阵列芯片。其中，可以采用等离子体增强化学气相沉积法在芯片上沉积绝缘导热层，绝缘导热层可以为二氧化硅层。需要说明的是，本发明中绝缘导热层的厚度并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，例如可以为250～350nm，本发明中所述的绝缘导热层的厚度指的是位于电极层上方的绝缘导热层的厚度。
S200:在光学玻璃上形成二维材料导热层，得到温度传感器
根据本发明的实施例，参考图2中⑤所示，可以使用二维材料导热层作为温度传感器，将二维材料导热层贴合在单细胞表面，利用二维材料拉曼光谱特征峰频率的温度依赖性实现细胞温度分布的准确测量，以实现原位无损的测量活体单细胞的温度分布。
根据本发明的一个具体实施例，二维材料可以为二维纳米材料，二维材料导热层的总厚度可以不大于1nm，例如可以为0.4nm、0.6nm、0.8nm或1nm等，发明人发现，若二维材料导热层的厚度过大，二维材料自身的热容和热传导会显著影响测量的灵敏度，本发明中通过选用总厚度不大于1nm的二维材料导热层，可以进一步保证细胞温度测量结果的精确性和可信度。需要说明的是，二维材料导热层的总厚度指二维材料导热层在厚度方向上的总厚度。
根据本发明的再一个具体实施例，本发明中二维材料导热层的材质并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，例如可以为选自石墨烯层、二硫化钼(MoS2)层、二硫化钨层(WS2)和二硒化钼(MoSe2)层中的至少之一。优选地，该二维材料导热层可以为石墨烯层，石墨烯作为最早被成功分离出的二维材料，其拉曼光谱的特征波数范围在800-3000cm-1，其中在1350、1580、2700cm-1附近分别发现了三个主要峰，即D峰、G峰和2D峰。对Si/SiO2衬底上石墨烯拉曼光谱的G峰频率进行温度依赖性实验发现，在488nm激光激发下-190℃至100℃范围内G峰频率随温度的升高而下降，呈线性关系，且得到了温度系数的实验值。该温度效应引起的峰位位移大致可分为声子模非谐耦合引起的“自能”位移和晶体热膨胀引起的位移。2D峰也同样存在此类温度依赖性，且单层石墨烯2D峰位置的温度灵敏度为G峰灵敏度的2倍左右。另一方面，石墨烯仅有一个碳原子的厚度，用作温度传感器贴合在目标物体表面时因自身热容引起的温度响应滞后可以完全忽略不计，尤其适用于微纳米材料的表面温度测量，如细胞等生物材料的表面温度测量。具体地，当二维材料导热层为石墨烯层时，石墨烯层可以由1～3层的单层石墨烯形成，更优选地，二维材料导热层可以为单层石墨烯层，由此可以进一步避免因石墨烯层自身热容引起的温度响应滞后问题，提高细胞温度测量结果的精确性和可信度。
根据本发明的又一个具体实施例，温度传感器可以采用如下步骤制备得到：(2-1)在铜箔上形成二维材料导热层，并在二维材料导热层上形成支撑层；(2-2)去除铜箔，并利用支撑层将二维材料导热层转移至光学玻璃上；(2-3)去除支撑层，以便得到温度传感器。例如，以石墨烯层为例，可以采用传统的化学气相沉积法在铜箔上制备单层石墨烯(SLG：Single-layer graphene)，随后再在其表面旋涂一层高分子有机物(如PMMA，聚甲基丙烯酸甲酯)作为支撑层，使用过硫酸铵溶液(50-80g/L)去除铜箔，并将其转移到250μm厚的光学玻璃上，然后切割成1cm×1cm大小的方片用于后续测量；接着，去除SLG的保护层：PMMA涂层，实施时，将SLG样品浸入60℃丙酮溶液中浸泡2小时，以去除上面的PMMA涂层；之后将SLG样品浸入去离子水中漂洗。其中，需要注意的是，去除PMMA涂层时，适当的温度和足够的浸泡时间对于获得纯净的SLG样品是非常重要的。
S300:测量二维材料导热层在不同温度下的拉曼光谱图，获得二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系
根据本法的实施例，发明人发现，本发明采用的二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度是存在有线性关系的，通过在测量前对温度传感器进行温度标定，即在不同温度条件下测量二维材料导热层拉曼特征峰的波数变化，准确标定二维材料拉曼特征峰波数偏移量和温度变化量的线性关系，可以基于该线性关系和二维材料导热层中每一点的拉曼光谱特征峰的波数偏移量，获得目标细胞全场的温度分布。
根据本发明的一个具体实施例，二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系可以采用如下步骤获得：
(3-1)将承载有二维材料导热层的光学玻璃置于控温平台上，利用控温平台将二维材料导热层加热至T1，并测量二维材料在T1温度下的拉曼光谱图，记录拉曼光谱目标特征峰对应的波数w1。其中，控温平台的温度可以使用温控仪进行精确控制。
(3-2)将控温平台的温度调整到Tn，测量二维材料在Tn温度下的拉曼光谱图，记录其在Tn温度下拉曼光谱目标特征峰对应的波数wn，其中，Tn为不同于T1的任意温度；
(3-3)重复步骤(3-2)的操作，此时可以使Tn选择多个不同的温度(如Tn1、Tn2、Tn3…等)，以便得到二维材料在多个不同温度下其拉曼光谱目标特征峰分别对应的波数；
(3-4)基于二维材料在多个不同温度下其拉曼光谱目标特征峰对应的波数与温度的一一对应关系，获得其拉曼光谱目标特征峰对应的波数与温度的线性关系，其中线性关系为：
ωg＝ω0+χTg，
其中，Tg可以为任意温度；ωg为在温度Tg下二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数；ω0为温度Tg为0K时二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数；χ为二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数随温度变化的一阶线性系数。
根据本发明的一个具体实施例，二维材料拉曼光谱目标特征峰在Tn温度下对应的波数wn随温度变化的系数值χn为
当Tn取不同的温度值时，二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数wn和二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数随温度变化的系数值χn也会发生相应的变化，线性系数χ可以为多个不同温度下获得的系数值经线性拟合得到，由此可以进一步保证最终得到的二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系的准确性；优选地，还可以在后续单细胞温度分布测量过程中不断对该线性关系进行修正。
根据本发明的再一个具体实施例，当二维材料导热层为单层石墨烯层时，其拉曼光谱目标特征峰可以为G峰(～1580cm-1)。
根据本发明的又一个具体实施例，当利用控温平台将二维材料导热层加热至特定温度时，如T1或Tn时，可以保持10～20分钟以使二维材料导热层达到均温状态，由此可以进一步保证最终得到的二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系的准确性。
S400:使细胞直接生成在所述绝缘导热层上
根据本发明的一个具体实施例，可以预先对芯片进行消毒，再将芯片置于细胞培养箱中用作细胞的生长基底。进一步地，参考图2中④和图6所示，可以选择合适类型的细胞直接生长在芯片的绝缘导热层表面，并控制细胞生长的面密度为10～20个/500μm2，例如可以为10个/500μm2、12个/500μm2、16个/500μm2或20个/500μm2等。
S500:使所述二维材料导热层与所述细胞接触，通过微米电极阵列对细胞进行加热，并逐点测量目标细胞上方二维材料导热层的拉曼光谱信号，获得全场的拉曼光谱分布图；基于二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系和二维材料导热层中每一点的拉曼光谱特征峰的波数偏移量，获得目标细胞全场的温度分布
根据本发明的一个具体实施例，当步骤(1-1)为在硅基底上形成紫外光刻胶层，利用紫外光刻法将紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案时，使在绝缘导热层上培养的细胞与承载二维材料导热层的光学玻璃小心对正并贴合时，使细胞与二维材料导热层直接接触，而后在光学玻璃周围涂抹凡士林进行密封，达到减少培养液蒸发、延长细胞存活时间的目的，需要注意的是，该过程中为避免损伤活体细胞，压合力度不宜过大。
根据本发明的再一个具体实施例，当步骤(1-1)为预先利用反应离子刻蚀法在硅基底上形成凹槽，再在凹槽内形成紫外光刻胶层，利用紫外光刻法将紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案时，使在绝缘导热层上培养的细胞与承载二维材料导热层的光学玻璃小心对正并贴合时，硅基底四周未被刻蚀的侧壁对二维材料导热层起支撑作用，细胞与二维材料导热层直接接触，此时无需使用凡士林即可达到密封的效果。
根据本发明的又一个具体实施例，如图7所示，利用微米电极阵列对细胞进行加热时，可以将直流电源、高精度电流表和电压表接到微米电极阵列芯片的引脚上，测量微米电极加热区两端的电压U和流过的电流I，计算电阻R和加热功率P，通过改变电加热功率P以精确控制微米电极的温度。需要说明的是，本发明中通过微米电极阵列芯片对细胞进行加热和利用温度传感器对单细胞温度进行测量为两套相互独立的操作系统。
综上所述，本发明上述实施例的激光拉曼测量单细胞温度分布的方法可以具有以下有益效果：(1)目标细胞的拉曼谱图及特征峰对应的波数—温度变化关系未知，本发明中采用二维材料导热层作温度传感器，其拉曼特征峰对应波数的变化与温度的变化呈线性关系，测量二维材料的拉曼光谱特征峰变化即可得到对应点处细胞的温度；(2)测量前对石墨烯温度传感器进行温度标定，即在不同温度条件下测量石墨烯拉曼特征峰的波数变化，可准确标定石墨烯拉曼特征峰波数偏移量和温度变化量的线性关系；(3)采用该方法可对细胞进行逐点扫描，得到单个目标细胞全场的拉曼光谱信号分布，进而得到细胞全场的温度分布；(4)通过使用二维材料导热层作为温度传感器，能够原位无损的测量活体单细胞的温度分布，具体地，可以将二维材料导热层贴合在单细胞表面，利用二维材料拉曼光谱特征峰频率的温度依赖性实现细胞温度分布的准确测量；(5)可结合扫描振镜和可移动平台实现纳米量级的空间分辨率，测量单细胞温度分布；(6)二维材料拉曼光谱特征峰的高温度灵敏度可以保证细胞温度测量结果的精确性和可信度；(7)该方法为非接触式定量测量方法，选择适当的激光功率及微电极加热功率，可以保证测量过程对生物细胞无损伤，实现活体细胞的温度测量；(8)该方法在单细胞生理活性、病理研究和药物开发等领域有广阔的应用前景。
根据本发明的第二个方面，本发明提出了上述激光拉曼测量单细胞温度分布的方法在活体细胞生物特征测量、药物研发、疾病病理研究中的用途。相对于现有细胞测温方法存在的易受环境影响、无法测量活体细胞、稳定性不强、缺乏普适性、无法进行全场测温等的缺陷，采用本发明上述实施例的激光拉曼测量单细胞温度分布的方法不仅可以实现活体细胞温度分布的原位无损测量，还可以保证细胞温度测量结果的精确性和可信度，解决了测量活体细胞全场温度分布的难题。需要说明的是，针对上述激光拉曼测量单细胞温度分布的方法所描述的特征及效果同样适用于该方法在在活体细胞生物特征测量、药物研发、疾病病理研究中的用途，此处不再一一赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种激光拉曼测量单细胞温度分布的方法，该方法包括：(1)制备用于加热细胞的微米电极阵列芯片，该芯片以Pt作为电极层，以SiO2作为绝缘导热层；(2)制备石墨烯温度传感器，该温度传感器以单层石墨烯(SLG)作为二维材料导热层；(3)利用拉曼光谱仪对单层石墨烯G峰波数变化和温度的关系进行标定，即在不同温度条件下测量石墨烯拉曼特征峰的波数变化，准确标定石墨烯拉曼特征峰波数偏移量和温度变化量的线性关系；(4)以微米电极阵列SiO2/Pt/Si芯片作为生长基底培养合适类型的细胞，随后将其与承载SLG的光学玻璃对正并贴合组成完整的温度测量装置，利用拉曼光谱仪对目标细胞进行全场扫描得到单细胞全场的温度分布。参考图2、图6、图7，详细过程如下：
步骤(1)进一步包括：
(1-1)在长宽为1cm×1cm，厚度为500μm的Si(硅)基底上旋涂一层厚度为10μm的紫外光刻胶，利用紫外光刻技术将紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案(如图2中①所示)：单个电极加热区大小为30μm×30μm，其中线宽为1μm，微米电极阵列排布由单个电极加热区顺次连接形成，接入与接出处电极线宽为20μm；
(1-2)采用电子束物理气相沉积方法在(1-1)得到的芯片上首先沉积8nm厚的Ti电极层，然后在其上沉积100nm厚的Pt薄膜(如图2中②所示)；
(1-3)将芯片浸入45℃的ZDMAC(二甲基乙酰胺)溶液中10min以去除非电极阵列区域的光刻胶及其上沉积的Ti层和Pt层，之后将芯片放入去离子水中漂洗；
(1-4)制备完金属电极后，采用等离子体增强化学气相沉积方法在芯片上沉积300nm厚的SiO2层作为电绝缘层(如图2中③所示)。
步骤(2)进一步包括：
(2-1)采用传统的化学气相沉积方法在铜箔上制备SLG，随后在表面旋涂一层PMMA作为支撑层；
(2-2)使用过硫酸铵溶液(50-80g/L)去除铜箔，并将其转移到250μm厚的光学玻璃上，然后切割成1cm×1cm大小的方片用于后续测量；
(2-3)将SLG样品浸入60℃丙酮溶液中浸泡2小时，以去除上面的PMMA涂层；之后将SLG样品浸入去离子水中漂洗。
步骤(3)进一步包括：
(3-1)将光学玻璃承载的单层石墨烯置于控温平台上，使用温控仪对控温平台的温度进行精确控制，利用控温平台将单层石墨烯温度提高到基准温度300K，保持15分钟以达到均温状态，使用拉曼光谱仪获得该温度下的石墨烯拉曼谱图，记录G峰对应的波数1579.2cm-1；
(3-2)将控温平台的温度调整到Tn，测量单层石墨烯在Tn温度下的拉曼光谱图，记录其在Tn温度下拉曼光谱目标特征峰对应的波数wn，其中，Tn为不同于T1的任意温度；
(3-3)重复步骤(3-2)的操作，得到单层石墨烯拉曼光谱G峰多组温度与波数对应值的实验数据；
(3-4)单层石墨烯拉曼光谱中G峰的波数与温度的关系可以表示为
ωg＝ω0+χTg
其中Tg为任意温度；ωg为在温度Tg下单层石墨烯拉曼光谱G峰对应的波数；ω0为温度Tg外推到0K时的单层石墨烯拉曼光谱G峰波数，χ为一阶温度系数，对步骤(3-3)中数据，即单层石墨烯拉曼光谱G峰在Tn温度下对应的波数wn随温度变化的系数值
进行线性拟合，得到χ的拟合值为﹣(1.62±0.2)×10-2cm-1/K，ω0的拟合值为1584cm-1。
步骤(4)进一步包括：
(4-1)将步骤(1-4)制得的SiO2/Pt/Si芯片彻底消毒，放置在细胞培养箱中用作生长基底。培养SW480细胞直接生长在芯片表面(如图2中④所示)，控制细胞生长的面密度为10～20个细胞/500μm2(如图4和图6所示)。
(4-2)将微米电极阵列SiO2/Pt/Si芯片上培养的细胞与承载SLG的光学玻璃小心对正并贴合(如图2中⑤和图6～7所示)，两者之间保留一定缝隙并在光学玻璃周围涂抹凡士林进行密封。
(4-3)将直流电源、高精度电流表和电压表接到微米电极阵列芯片的引脚上(如图7所示)，测量微米电极加热区两端的电压U和流过的电流I，计算电阻R和加热功率P，加热功率维持在100mW左右，微米电极温升不超过10K。
(4-4)利用拉曼光谱仪逐点测量目标细胞上方SLG的拉曼光谱信号，得到全场的拉曼光谱分布图，利用(3-4)线性拟合得到的表达式，从每一点SLG拉曼光谱G峰的波数偏移量中计算出该点的温度，进而得到目标细胞全场的温度分布。这里使用的激光波长为632nm，激光强度为10mW左右。
实施例2
与实施例1的区别在于：
步骤(1-1)中，在长宽为1cm×1cm，厚度为500μm的Si(硅)基底上利用深反应离子刻蚀(DRIE：Deep Reactive-Ion Etching)方法形成长宽为100μm×100μm，深度为50-100μm的深槽。之后在深硅槽内旋涂一层厚度为10μm的紫外光刻胶层，利用紫外光刻技术将紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案(如附图2中①所示)：单个电极加热区大小为30μm×30μm，其中线宽为1μm，形状如图3中放大图所示，微米电极阵列排布方式如图3所示，接入与接出处电极线宽为20μm。
步骤(4-2)中，将承载SLG的光学玻璃与硅基底小心对正并贴合，四周未被刻蚀的侧壁对SLG起支撑作用，微米电极阵列SiO2/Pt/Si芯片上培养的细胞与SLG直接接触。
需要说明的是，本发明不局限于上述具体实施方式，本发明中提出的一种单细胞温度分布的激光拉曼测量方法可广泛应用于本领域及与之相关的其它领域，可以采用其它多种具体实施方式实施本发明，凡是采用本发明的设计思想，做一些简单的变化或更改的设计，都落入本发明保护的范围。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (13)
1.一种激光拉曼测量单细胞温度分布的方法，其特征在于，包括：
(1)制备用于加热细胞的微米电极阵列芯片，所述芯片中电极层上方形成有适于细胞生长的绝缘导热层；
(2)在光学玻璃上形成二维材料导热层，以便得到温度传感器；
(3)测量所述二维材料导热层在不同温度下的拉曼光谱图，以便获得所述二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系；
(4)使细胞直接生成在所述绝缘导热层上；
(5)使所述二维材料导热层与所述细胞接触，通过所述微米电极阵列对所述细胞进行加热，并逐点测量目标细胞上方二维材料导热层的拉曼光谱信号，获得全场的拉曼光谱分布图；
(6)基于所述二维材料拉曼光谱特征峰对应的波数与温度的线性关系和所述二维材料导热层中每一点的拉曼光谱特征峰的波数偏移量，获得目标细胞全场的温度分布。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微米电极阵列为蛇形结构、螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构；和/或，
所述微米电极阵列为串联和/或并联结构。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微米电极阵列包括多个加热区，相邻两个所述加热区通过电极线相连，多个所述加热区和电极线构成蛇形结构、螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构；和/或，
所述微米电极阵列包括多个加热区，相邻两个所述加热区通过电极线相连，每个所述加热区分别独立地由电极线构成蛇形结构、螺旋圈结构、同心圆圈、回形圈结构或网状结构。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，连接相邻两个所述加热区的电极线宽不大于100μm，每个所述加热区中的电极线宽不大于5μm。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，连接相邻两个所述加热区的电极线宽为20～100μm，每个所述加热区中的电极线宽为1～5μm。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述微米电极阵列芯片采用如下步骤制备得到：
(1-1)在硅基底上形成紫外光刻胶层，利用紫外光刻法将所述紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案；或者，预先利用反应离子刻蚀法在硅基底上形成凹槽，再在所述凹槽内形成紫外光刻胶层，利用紫外光刻法将所述紫外光刻胶层形成为与目标电极阵列结构匹配的图案；
(1-2)在步骤(1-1)得到的硅基底上依次沉积粘附层和电极层；
(1-3)去除所述光刻胶层及其上沉积的粘附层和电极层，以便得到目标结构的电极阵列；
(1-4)在步骤(1-3)得到的硅基底上沉积绝缘导热层，以便覆盖所述电极阵列，得到微米电极阵列芯片。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，至少满足以下条件之一：
(a)所述粘附层的厚度为8～12nm，所述电极层的厚度为100～300nm；
(b)所述绝缘导热层为二氧化硅层；
(c)所述粘附层为钛层且所述电极层为铂层，或者所述粘附层为铬层且所述电极层为金层。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)至少满足以下条件之一：
(i)所述二维材料为二维纳米材料；
(ii)所述二维材料导热层的总厚度不大于1nm；
(iii)所述二维材料导热层为选自石墨烯层、二硫化钼层、二硫化钨层和二硒化钼层中的至少之一；
(iv)所述二维材料导热层为单层石墨烯层；
(v)所述温度传感器采用如下步骤制备得到：(2-1)在铜箔上形成二维材料导热层，并在所述二维材料导热层上形成支撑层；(2-2)去除所述铜箔，并利用所述支撑层将所述二维材料导热层转移至光学玻璃上；(2-3)去除所述支撑层，以便得到所述温度传感器。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括：
(3-1)将承载有所述二维材料导热层的光学玻璃置于控温平台上，利用所述控温平台将所述二维材料导热层加热至T1，并测量所述二维材料在T1温度下的拉曼光谱图，记录拉曼光谱目标特征峰对应的波数w1；
(3-2)将所述控温平台的温度调整到Tn，测量所述二维材料在Tn温度下的拉曼光谱图，记录其在Tn温度下拉曼光谱目标特征峰对应的波数wn，其中，Tn为不同于T1的任意温度；
(3-3)重复步骤(3-2)的操作，以便得到所述二维材料在多个不同温度下其拉曼光谱目标特征峰分别对应的波数；
(3-4)基于所述二维材料在多个不同温度下其拉曼光谱目标特征峰对应的波数与温度的一一对应关系，获得其拉曼光谱目标特征峰对应的波数与温度的线性关系，其中所述线性关系为：
ωg＝ω0+χTg，
Tg为任意温度；
ωg为在温度Tg下所述二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数；
ω0为温度Tg为0K时所述二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数；
χ为所述二维材料拉曼光谱目标特征峰对应的波数随温度变化的一阶线性系数。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，至少满足以下条件之一：
(I)所述二维材料拉曼光谱目标特征峰在Tn温度下对应的波数wn随温度变化的系数值χn为
所述线性系数χ为多个不同温度下获得的系数值经线性拟合得到的；
(II)所述二维材料导热层为单层石墨烯层，其拉曼光谱目标特征峰为G峰(～1580cm-1)。
11.根据权利要求1或10所述的方法，其特征在于，步骤(4)中至少满足以下条件之一：
(A)所述细胞生长的面密度为10～20个/500μm2；
(B)预先对所述芯片进行消毒，再将所述芯片置于细胞培养箱中；
(C)使所述二维材料导热层与所述细胞接触后，在所述光学玻璃周围涂抹凡士林进行密封。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)进一步包括：将直流电源、高精度电流表和电压表接到微米电极阵列芯片的引脚上，测量微米电极加热区两端的电压U和流过的电流I，计算电阻R和加热功率P，通过改变电加热功率P以精确控制微米电极的温度。
13.权利要求1～12中任一项所述的方法在活体细胞生物特征测量、药物研发、疾病病理研究中的用途。
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