CN112980693B - 一种分离纯化微孢子虫极管的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离纯化微孢子虫极管的方法，具体步骤为：a)微孢子虫体外发芽，震荡破碎，使孢壳与极管分离；b)将步骤a)得到的样品按500rpm‑6000rpm进行差速离心，3500rpm‑6000rpm之间收集到的沉淀样品即为纯化的极管。本发明纯化的极管纯度较高，杂质较少，而且操作简单，耗时较短。
Description
技术领域
本发明属于微生物细胞器官分离技术领域，具体涉及一种分离纯化微孢子虫极管的方法。
背景技术
微孢子虫(Microsporidia)是一类营细胞内专性寄生可形成孢子的单细胞真核生物，广泛存在于动物界，宿主包括无脊椎动物、脊椎动物，乃至人类。尽管微孢子虫在宿主范围和专一性方面存在差异，但它们都具有相似的侵染机制。在适宜的外界环境刺激下，微孢子虫能迅速弹出极管(Polar tube)，并通过中空极管将病原性孢原质输送到宿主细胞内，进而进行感染增殖。因此，极管成为了微孢子虫一种独特的侵染器官。极管呈管状结构，具有一定的弹性和韧性，其直径为100～200nm，长度可达50～500μm。由于微孢子虫完成整个发芽、弹出极管、运输孢原质过程极短(小于2秒)，目前对于极管弹出机制的研究变得十分困难。
极管具有特殊的溶解性，不溶于SDS、H2SO4等一般的离子去污剂，而溶于不同浓度的β-巯基乙醇、DTT等还原剂。研究者们通常利用极管的这种特殊溶解性和蛋白质组学的手段，从多种属微孢子虫中鉴定得到了6种极管蛋白(PTP1-PTP6)。其中PTP1、PTP2和PTP3定位于整根极管，并且三者间具有相互作用，推测三者发挥稳固极管结构的作用。PTP4定位于极管最前端，EhPTP4被证实具有明显的细胞结合能力，并鉴定到EhPTP4的宿主细胞受体：转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1，TfR1)。研究表明，敲除了TfR1基因后，微孢子虫的感染率明显降低。2020年，在家蚕微孢子虫中鉴定到能定位于整根极管上的新极管蛋白6，而且发现NbPTP6与EhPTP4类似，具有明显的宿主细胞结合能力，推测该蛋白在微孢子虫侵染宿主过程中发挥重要功能。
极管蛋白功能的研究和极管结构的解析对于探究微孢子虫的侵染机制具有重要意义。但是目前获得微孢子虫新极管蛋白的方法还局限于使用各种溶剂溶解发芽后的孢子，并结合蛋白质质谱来筛选潜在的极管蛋白。具体方法参见Bing Han等人2019发表的《Microsporidia Interact with Host Cell Mitochondria via Voltage-DependentAnion Channels Using Sporoplasm Surface Protein 1》，以及Bing Han 2017年发表的《Microsporidia:Obligate Intracellular Pathogens within the Fungal Kingdom》。由于前期样品不纯，常混有微孢子虫空壳、未发芽的孢子、细胞核、孢原质等杂质，为后续蛋白质质谱数据的有效筛选增添了难度。同时，目前大多采用冷冻电镜技术解析微孢子虫极管的超微结构，观察的样品是微孢子虫体外发芽后连有极管的孢子空壳，由于孢壳体积过大，其直径约为极管直径的数十倍，此样品的冷冻效果会受到极大影响，最终影响对极管超微结构观察，因此亟需一种分离纯化微孢子虫极管的方法。
发明内容
针对以上存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种直接分离纯化微孢子虫极管的方法，为日后鉴定新的极管蛋白和解析极管超微结构提供便利。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种分离纯化微孢子虫极管的方法，具体步骤如下：
a)微孢子虫体外发芽，震荡破碎，使孢壳与极管分离；
b)将步骤a)得到的样品按500-6000rpm进行差速离心，收集3500rpm-6000rpm之间的沉淀样品即为纯化的极管。
作为优选方案之一，步骤a)中，体外促发芽使用的方法为置于0.1M的KOH溶液中，30℃萌发40min。
作为优选方案之一，步骤a)中，微孢子虫孢子的浓度大于108个/mL；更为优选的，微孢子虫孢子的浓度为109个/mL。
作为优选方案之一，步骤a)中，破碎方法为生物样品均质仪震荡破碎；更为优选的，震荡破碎的条件为：振荡速度6m/s，循环次数6，运行时间20s，间隙时间10s。
作为优选方案之一，步骤a)中，震荡破碎时加入等质量的直径为425-600μm的大玻璃珠和直径为150-212μm的小玻璃珠。
作为优选方案之一，步骤b)中，差速离心的转速按500rpm递增。
作为优选方案之一，步骤b)中，差速离心的离心时间为5min。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明不需要复杂的或者大型仪器设备，只需要小型离心机，生物样品均质仪就可以完成，便于在常规的实验室操作。
(2)该发明中分离纯化方法步骤简单，用时很短，能够快速获得纯净的实验材料。
(3)该发明中使用差速离心的方式，能够有效的去除空壳、未发芽的孢子、孢原质等杂质。实验过程中使用的水、PBS都需经过灭菌处理，严格避免样品染菌的可能。并且，针对每一次离心收集到的沉淀都用IFA检测，确保能够获得纯净的极管样品。
(4)该发明适用于大多数微孢子虫，使用该方法都能获得高纯度的微孢子虫极管样品。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为家蚕微孢子虫受到发芽刺激后弹出极管的扫描电镜图(1号白色箭头指的是极管，2号黑色箭头指的是家蚕微孢子虫的孢子空壳，放大倍数为20000×)；
图2为家蚕微孢子虫孢子发芽后弹出极管的免疫荧光检测图；
图3为差速离心分离纯化极管的结果检测图；
图4为膜过滤法分离极管的结果检测图；
图5为密度梯度离心法分离极管的结果检测图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、一种分离纯化微孢子虫极管的方法
一、孢子的纯化：
对五龄起家蚕添食家蚕微孢子虫，待家蚕上簇后收集蚕蛹。研磨蛹体，直至无明显组织块。加入少量灭菌的ddH2O，混匀后先过两层纱布过滤，再过四层纱布过滤，最后使用棉花过滤。3000rpm离心收集液，直至上清清澈干净即可。最后用少量ddH2O将沉淀悬起，使用percoll细胞分离液分离纯化孢子，纯化后的孢子保存于4℃。
二、孢子体外发芽：
准备两个1.5mL的EP管，每管加入109个/mL的孢子。用1×PBS清洗3遍后，各加入1mL 0.1M的KOH溶液，置于30℃金属浴中发芽40min。
利用扫描电镜观察家蚕微孢子虫受到发芽刺激后弹出极管，见图1。图1中1号白色箭头指的是极管，2号黑色箭头指的是家蚕微孢子虫的孢子空壳，放大倍数为20000×。利用免疫荧光显微镜观察家蚕微孢子虫孢子发芽后弹出极管，见图2。图2中DAPI标记的细胞核(蓝色荧光)，Anti-NbPTP1标记的极管(绿色荧光)，DIC白光观察的孢子，标尺为10μm。三、样品震荡破碎：
孢子发芽后，3000rpm离心5min，弃上清，加入600μL 1×PBS溶液重悬沉淀。再加入0.2g的大玻璃珠(425-600μm)和0.2g的小玻璃珠(150-212μm)，置于生物样品均质仪中震荡。设置震荡条件为：速度：6M/s；循环数：6；震荡时间：20s；间隔时间：10s。四、差速离心：
将破碎后的样品置于1.5mL EP中，从500rpm开始，离心5min；取上清进行下一步1000rpm离心，PBS重悬沉淀，保存待检测。1000rpm离心5min后，取出上清进行下一步1500rpm离心，PBS重悬沉淀，保存待检测。依次按照转速递增500rpm的步骤离心5分钟，直至6000rpm离心后，分别收集上清和沉淀，保存待检测。
五、免疫荧光测定(Immunofluorescence analysis，IFA)检测纯化效果
将不同转速离心后收集的沉淀样品以及6000rpm离心后的上清样品分别通过IFA方法进行检测。使用绿色荧光Alexa R488标记的家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)的兔多克隆抗体标记极管，使用DAPI荧光染料标记微孢子虫的细胞核。
检测结果见图3，蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，绿色荧光为Anti-NbPTP1标记的极管，DIC白光下观察到的是家蚕微孢子虫。A图为转速500rpm-1500rpm之间得到的沉淀样品，包括未发芽的孢子、孢子空壳、连有部分极管的孢子空壳和断裂的极管片段；B图为转速2000rpm-3000rpm之间得到的沉淀样品，包括孢子空壳、连有极管的孢子空壳和断裂的极管片段；C图为转速3500rpm-5500rpm之间得到的沉淀样品，此部分样品中含有大量极管片段。6000rpm离心后的上清和沉淀样品中仅含有少量的极管片段。因此，差速离心分离过程中，3500rpm-5500rpm能获得数量较多，且纯度较高的极管片段。
本实施例中为确保分离获得高纯度的极管，本技术中需要注意的关键问题如下：
(1)使用的各种试剂与耗材均需要进行严格灭菌处理，避免杂菌污染，导致分离到的极管样品不纯。
(2)严格控制震荡破碎时间和力度。防止震荡过度造成微孢子虫破裂，导致其内容物流出，从而影响后续极管的纯化。
(3)严格进行差速离心过程，不能因为某一转速下未获得沉淀样品就跳过多个中间转速，直接使用最高转速离心，这样会导致最终分离样品中混有微孢子虫孢子或其他杂质。
对比实施例
此前也尝试过其他分离纯化极管的方法，比如：膜过滤分离法、密度梯度离心分离法等，这些方法都未能分离得到纯度较高的极管。具体实施方法如下：
一、膜过滤法分离纯化极管
家蚕微孢子虫孢子呈卵圆形，大小在3-5μm；极管长度为100-150μm，直径为100nm。利用孢子与极管的大小差异，首先震断极管，使其断裂成短片段，再选择合适的膜孔径过滤，通过膜过滤的方法将断裂极管和孢子分离开。
具体操作如下：
(1)研磨感染微孢子虫的蚕蛹后纯化得到大量孢子，109个/mL孢子中加入0.1M的KOH，置于30℃金属浴中发芽处理40min。将发芽后的孢子离心后，弃上清，沉淀用1×的PBS重悬。
(2)准备破碎管，分别加入0.2g大玻璃珠(425-600μm)和0.2g小玻璃珠(150-212μm)，然后加入发芽后孢子样品，置于生物样品均质仪中进行震荡破碎。
(3)震荡后的样品加入少许PBS稀释，使用0.45μm的生物滤膜过滤。
(4)对分离结果进行检测。
膜过滤分离后检测结果见图4，蓝色荧光为DAPI标记的微孢子虫细胞核，绿色荧光为Anti-NbPTP1标记的极管，标尺为10μm。通过IFA检测结果发现，膜过滤分离后，虽然样品中未检测到较大的孢子空壳和未发芽的孢子，但也未检测到较长的极管片段。样品中仅有极管碎小片段，同时还发现样品中存在杂菌。
该方法存在如下弊端：
(1)从检测结果来看，本方法未能达到分离纯化极管的目的，在膜过滤后的溶液中只存在一些碎小的极管片段。
(2)难以控制膜过滤前样品的稀释比例，样品的稀释倍数过低会增加过滤难度，而稀释倍数过高，滤液中又无极管样品。
(3)滤膜的孔径选择也是本方法中的一个难点，如何使断裂后的极管大片段通过滤膜，而拦截杂菌、未发芽的孢子和空壳等，都需要大量实验尝试与摸索。
二、密度梯度离心法分离纯化极管
参考利用percoll密度梯度离心分离获得微孢子虫孢原质的方法(详见申请号为CN109706080A的发明专利)，分离纯化微孢子虫的极管。具体方法如下：
采用二次密度梯度离心的方法纯化微孢子虫极管。第一次密度梯度离心(配制30％、60％和90％的percoll浓度梯度)，加入孢子发芽后的样品，14000rpm，离心40min。收集60％层样品，加入PBS，吹匀后震荡破碎，使极管从空壳上脱落并断裂成片段。第二次密度梯度离心(配制30％、45％和60％的percoll浓度梯度)，加入2mL震荡样品，14000rpm，离心40min。最后对极管分离的结果进行检测。
密度梯度离心法分离极管的检测结果，见图5。A图为45％层检测结果；B图为60％层检测结果。蓝色荧光为DAPI标记的微孢子虫细胞核；绿色荧光为Anti-NbPTP1标记的极管；标尺为10μm。结果显示：不论45％层还是60％层样品中，虽存在大量极管片段，但同时也存在大量空壳，杂质较多。因此，本方法未能成功将微孢子虫孢子空壳与极管片段分离开。
该方法存在如下弊端：
(1)从检测结果来看，密度梯度离心分离法未能达到分离纯化极管的要求，样品中存在大量的空壳和其他杂质。
(2)该方法步骤繁琐，耗时较长。
(3)该方法中需使用大型离心设备，离心转速高，为保证安全，需要严格实验操作。
(4)该方法中需要大量使用percoll溶液，该生物试剂价格昂贵，大大增加了实验成本。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (4)
1.一种分离纯化家蚕微孢子虫极管的方法，其特征在于，具体步骤如下：
a)家蚕微孢子虫体外发芽，震荡破碎，使孢壳与极管分离；所述破碎为生物样品均质仪震荡破碎，震荡破碎的条件为：震荡速度6m/s，循环次数6，运行时间20s，间隙时间10s；震荡破碎还包括加入等质量直径为425-600μm的大玻璃珠和直径为150-212μm的小玻璃珠；
b)将步骤a)得到的样品按500-6000rpm进行差速离心，收集3500rpm-6000rpm之间的沉淀样品即为纯化的极管；差速离心的转速按500rpm递增，差速离心的离心时间为5min。
2.根据权利要求1所述的分离纯化家蚕微孢子虫极管的方法，其特征在于，步骤a)中，所述体外发芽使用的方法为于0.1M的KOH溶液中，30℃萌发40min。
3.根据权利要求1所述的分离纯化家蚕微孢子虫极管的方法，其特征在于，步骤a)中，所述家蚕微孢子虫体外发芽步骤中加入的孢子的浓度大于108个/mL。
4.根据权利要求1所述的分离纯化家蚕微孢子虫极管的方法，其特征在于，步骤a)中，所述家蚕微孢子虫体外发芽步骤中加入的孢子的浓度大于109个/mL。
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