CN112979764A

CN112979764A - 特异结合人cd47分子的多肽及其用途

Info

Publication number: CN112979764A
Application number: CN202110325269.7A
Authority: CN
Inventors: 姜志龙
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN112979764B

Abstract

本发明公开了一种能够特异结合人CD47分子的多肽，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1，该多肽分子能够用于制备抗肿瘤药物，具有开发应用前景。

Description

特异结合人CD47分子的多肽及其用途

技术领域

本发明属于免疫学领域和医药领域，涉及一种能特异地结合人CD47分子的多肽、及其在制备抗癌药物中的用途。

背景技术

CD47是一种广泛表达的跨膜糖蛋白，也称为整联蛋白相关蛋白、整合素相关蛋白(IAP)，分子量52kDa。该蛋白具有免疫球蛋白可变的N端结构域、5个跨膜结构域和一个短的C端胞内尾，胞内尾部有四种可变不同剪接异构体，从而形成4个亚型。

CD47是一种免疫球蛋白超家族成员，在人免疫系统中发挥着重要功能。研究表明CD47在肿瘤细胞表面也有高表达，其高表达与肿瘤的生长、转移及复发等密切相关。肿瘤细胞表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRPα相互作用，并发出“别吃我”的免疫抑制性信号，从而保护肿瘤细胞免受巨噬细胞吞噬。CD47分子主要表达在肿瘤细胞(参见图1)、激活的中性粒细胞和巨噬细胞上，具有抑制中性粒细胞和巨噬细胞对肿瘤细胞的识别和吞噬作用，是肿瘤免疫逃避和诱导肿瘤免疫治疗耐受的重要分子。

我们的前期细胞实验证明，用CD47抗体阻断肿瘤细胞的CD47分子信号通路后，增加巨噬细胞对肿瘤细胞的清除，显示通过阻断CD47信号通路，可增强巨噬细胞对癌细胞的吞噬和抑制癌细胞的生长。因此该治疗途径具有广泛的临床应用前景，但目前只有商品化的CD47分子中和抗体，而且该抗体均来自动物或杂交瘤，用于人体将有产生免疫反应等副作用的风险，目前还没有人源化的抗体出现。此外该抗体有半衰期短、生产工艺复杂，周期长、比较昂贵等缺点。

因此，有必要开发一种制备容易、成本降低的能够特异性结合CD47分子的化合物或生物试剂，用于肿瘤靶向免疫治疗。

发明内容

为了克服目前的CD47分子中和抗体的免疫原性、细胞毒性和价格昂贵等缺点，发明人近几年来通过多肽文库筛选的方法，成功筛选和人工合成了一种多肽片段，其可以特异性地靶向肿瘤细胞中高表达的CD47分子，并杀伤肿瘤细胞。进一步地，通过修饰和标记，证明该小分子在体内、外具有高度稳定性，能特异地结合CD47分子，并能靶向高表达CD47的肺癌细胞。由于该产品中添加了破坏细胞线粒体结构的片段，靶向进入癌细胞后，可诱导癌细胞凋亡，提示可用于治疗癌症。

因此，本发明的第一个方面在于提供一种多肽，其选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽：

VQRHTSNLSVMSGGGSKLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO:1)；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)限定的多肽序列有90％以上同源性，优选地95％以上同源性，优选地98％以上同源性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)对(a)或(b)或(c)中所述多肽进行化学修饰的衍生多肽。

本文中将该多肽SEQ ID NO:1及其衍生多肽简称为CD47KLA。

该多肽SEQ ID NO:1及其衍生多肽能够很容易地通过多肽合成法制备，比如采用全自动多肽合成仪通过常规固相合成方法制备；也可以通过构建基因工程菌经发酵来表达。

可选地，上述(d)中的化学修饰是C末端的酰胺修饰，即在羧基基团增加了酰胺基团修饰。

本发明的第二个方面在于提供上述多肽CD47KLA在制备抗癌药物中的用途。具体而言，提供了一种抗癌药物，其包含上述多肽CD47KLA作为活性成分。

例如，上述抗癌药物可以是用于治疗肺癌的药物。

在一种实施方式中，上述的抗癌药物，其除了包含多肽CD47KLA外，还可以包含一种以上辅助治疗剂。该辅助治疗剂不影响上述多肽的活性和稳定性。它们联合使用可产生协同效应，增强上述多肽CD47KLA与CD47分子的结合。

优选地，所述辅助治疗剂可以是anti-CD47中和抗体，优选是目前已经临床应用的商品anti-CD47中和抗体。

在一种实施方式中，上述的抗癌药物是药物组合物，含有多肽CD47KLA、可选地添加的辅助治疗剂比如anti-CD47中和抗体、以及药学上可接受的载体。

所述载体应当能够恰当地保持蛋白质的活性。该载体包括但不限于溶剂(如水、缓冲溶液)、分散介质、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂等。

优选地，当多肽CD47KLA及可选的anti-CD47中和抗体为药物的活性成分时，药物组合物中还含有蛋白质稳定剂。

所述蛋白质稳定剂可以选自蛋白质药物中常用的用于保持蛋白质活性的稳定剂，例如包括但不限于下组中的至少一种、或者两种以上的组合：①缓冲液：如枸橼酸钠-枸橼酸缓冲剂；②表面活性剂：如非离子表面活性剂聚山梨酯类；③糖和多元醇：如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘油、甘露醇、山梨醇、PEG和肌醇等；④盐类：如氯化钠；⑤聚乙二醇类；⑥大分子化合物：如2-羟丙基-β-环糊精、白蛋白、血清蛋白(HAS)等；⑦组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐等。

优选地，上述药物的剂型可以选自冻干剂或者注射剂。

该抗癌药物可以经静脉注射、静脉滴注或肿瘤组织局部施用而给药。

本发明公开了的多肽CD47KLA由两个部分组成，N端含有经研究发现能够特异结合CD47的12个氨基酸，C端含有KLA重复序列。当多肽CD47KLA与肿瘤细胞特异结合后，进入肿瘤细胞，C端的KLA序列与肿瘤细胞的线粒体膜结合，破坏线粒体结构完整性，诱导肿瘤细胞凋亡。在C57/B6成年小鼠肺癌模型的初步研究结果显示，CD47KLA与肿瘤细胞混合并种植到小鼠体内后，可显著抑制小鼠肿瘤的生长；CD47KLA经腹腔注射后，可向肿瘤组织聚集，具有肿瘤靶向性。体外研究显示多肽CD47KLA能够与肺癌细胞特异结合，并诱导细胞凋亡，但其与正常肺上皮细胞、巨噬细胞等结合能力较弱，表明多肽CD47KLA具有特异靶向杀伤肺癌细胞的功能。在动物模型研究期间，未发现用药后的任何副作用，提示在包括肺癌在内的抗癌治疗中，具有重要的临床应用和商业价值。

附图说明

图1是显示CD47在肺癌组织、原代肺癌细胞和细胞株中表达的照片。A是显示肿瘤组织免疫染色(tumor tissue immunostaining)的照片，显示了骨转移的肺癌(lungcancer)组织和周围正常组织(normal tissue)的H&E染色(staining)后癌组织炎症细胞浸润和组织结构的检测情况，用免疫组织化学方法检测CD47、SIRP-a、CD68的表达。B是流式细胞仪的显示屏照片，显示了人肺癌细胞株H1229在未经处理的情况下，用FACS方法检测CD47的表达情况。C是流式细胞仪的显示屏照片，显示了体外培养原代肺癌细胞(primary lungcells)，用FACS分析CD47的表达量，随着培养时间延长，CD47表达量渐高。D是肿瘤球(tumorsphere)生长照片，显示了体外培养原代癌细胞12天后，在光学显微镜下观察到肿瘤生长成巨大球状，免疫组织化学染色显示具有高表达的CD47。

图2是噬菌体展示技术用于筛选特异结合CD47分子的蛋白质/多肽的原理和流程示意图。

图3显示了多肽CD47KLA对于肿瘤的抑制效果。其中A是LLC肺癌细胞、CD47KLA处理的小鼠肺癌细胞及对照肽处理的小鼠肺癌细胞通过腹股沟皮下注射到C57/B6成年小鼠后观察的肿瘤生长曲线图；B是用FACS方法分析肿瘤组织的中性粒细胞(Ly6G+CD11b+cells，NPs)浸润的拟合曲线图。C是用FACS方法分析肿瘤组织的巨噬细胞(Ly6G-CD11b+cells，MPs)浸润的拟合曲线图；D是流式细胞仪分析CD47在肿瘤组织各细胞群体的表达水平的显示屏照片。

图4是腹腔注射CD47KLA和SCKLA后动物模型的肿瘤组织切片。图中，绿色部分是CD47KLA或者对照肽Scramble peptide(SCKLA)；红色部分是Arg-1、Ki67、F4/80，CD3e染色。

图5显示了多肽CD47KLA与人肺癌细胞株H1229特异结合能力的检测结果。其中，A是分别用CD47KLA和对照肽SCKLA分别处理H1229细胞、肺上皮细胞(lung epithelialcells)和巨噬细胞(BMDMs)后荧光显微照片；B是用FACS方法定量分析CD47KLA和SCKLA结合H1229细胞能力的曲线图；C是用FACS方法定量分析CD47KLA浓度与结合H1229细胞能力关系的柱形图。**p<0.01，v.s.10μM CD47KLA，n＝3。

图6显示了CD47KLA对于人肺癌细胞H1229的影响。其中A是流式细胞仪分析人肺癌细胞H1229的显示屏照片；B是用FACS方法定量分析CD47KLA和SCKLA导致H1229细胞凋亡(apoptotic)的柱形图；C是用CCK-8测定的人肺癌细胞H1229存活率(viability)的柱形图。*p<0.05,v.s.Scramble peptide(SCKLA)，n＝3。

图7显示了CD47KLA和anti-CD47中和抗体联合使用的协同作用。其中，A是单独用30μM CD47KLA或联合用1μg/ml anti-CD47抗体处理A549、LLC癌细胞24hrs后的荧光显微照片，绿色(green)是CD47KLA；B是用FACS方法定量检测PI+的凋亡人肺癌细胞株H1229细胞的曲线图；C是用FACS方法定量检测PI+凋亡细胞的柱形图；D是用CCK-8测定的H1229细胞存活率(viability)的柱形图。*p<0.05，v.s.CD47KLA，n＝3。

具体实施方式

为了开发用于肿瘤靶向免疫治疗的药物，本发明将能够特异地结合CD47分子的蛋白质/多肽作为开发目标，以便替代目前的anti-CD47中和抗体，因为蛋白质/多肽能够通过常规的多肽合成技术或者微生物工程菌比如大肠杆菌基因工程菌的发酵表达来制备，生产成本要比CD47分子中和抗体低很多，而且制备容易，生产周期短。

发明人基于噬菌体展示技术(phage display technology)对于大量有潜力靶向CD47分子的蛋白质和多肽进行筛选。

噬菌体展示技术是一种基于定向进化的高通量筛选技术，大大拓展了定向进化技术在抗体多肽改造筛选方面的应用。具体地，噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。

当噬菌体展示技术用于筛选特异结合CD47分子的蛋白质/多肽时，其原理和步骤如图2所示。具体地讲，使人重组rCD47蛋白与含有多肽文库的噬菌体接触，含有特异多肽片段的噬菌体与rCD47结合，没有结合的噬菌体被洗脱后，再用第一次与rCD47结合的噬菌体进行第二次结合、洗脱、浓缩和扩增过程，反复3-5次筛选后，挑选单个克隆，进行DNA测序，分析和比较20个克隆的DNA序列，挑选克隆中出现率最高的DNA序列，并换算出氨基酸序列，得到目的多肽。

经过噬菌体展示技术，从大量的备选蛋白质/多肽中筛选一种理想的多肽SEQ IDNO:1，即CD47KLA。

由于化学方法合成的多肽通常带有游离氨基(N端)和游离羧基(C端)，为了增加多肽CD47KLA在病人体内的半衰期，可在KLA末端增加酰胺修饰，将C端的游离羧基替换为酰胺基团。C端酰胺化(amidation modification)降低了肽的总电荷，因此其总溶解度可能降低。然而，由于C末端酰胺化生成了更接近天然蛋白质的模拟物，增强了其进入细胞的能力；肽的稳定性也可以提高，增强了其对蛋白酶、端解酶及合成酶等外肽酶的抵抗力，能延长其保存期限。所以该修饰可以提高肽的生物活性。

由于本发明的多肽的C端含有KLA重复序列KLAKLAKKLAKLAK，为描述方便起见，本文中可将多肽SEQ ID NO:1、氨基酸序列突变的衍生多肽、及它们经化学修饰比如酰胺修饰的衍生物统称为CD47KLA。

本发明的多肽CD47KLA比如SEQ ID NO:1的氨基酸数量只有30个，能够很容易地通过多肽合成法制备，比如采用全自动多肽合成仪通过常规固相合成方法制备；也可以通过构建基因工程菌经发酵来表达。

以多肽CD47KLA、可选地添加的anti-CD47中和抗体为有效活性成分可以做成多种剂型的药物，比如冻干剂或者注射剂。这些剂型配制时可选用制药领域常用的辅助剂，并且其制备工艺也是本领域技术人员所熟知的。

当药物做成冻干剂时，可即用即配，溶解于预定的溶剂比如水中，然后进行输注。

相比抗体药物，本发明的小分子多肽具有生产工艺简单、生产周期短、价格便宜的明显优势。而且，由于不是大分子蛋白质，用于人体后，不会产生强烈的免疫反应副作用。同时，还具有有体内半衰期长、肿瘤靶向效果好、对细胞功能的影响均比商品化抗体好等优点。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明的实施例中，如果对于实验操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(10-30℃)。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

统计分析：本研究中数值变量均以均数±标准误表示，两组间比较采用双尾Student t检验，三组间比较采用ANOVA检验。当P<0.05时，认为具有统计学差异。

实施例1验证CD47在肺癌组织、原代肺癌细胞和细胞株的表达

实验材料

骨转移的肺癌组织和周围正常组织分别取自复旦大学附属中山医院骨外科手术切除病例样本；人肺癌细胞株H1229购自美国菌种保藏中心ATCC；原代肺癌细胞来自骨转移肺癌标本，经消化和处理后，在复旦大学附属中山医院中心实验培养；C57/B6小鼠由复旦大学医学院实验动物科学部提供。

1.1取骨转移的肺癌组织和周围正常组织、经固定后用H&E染色，检测癌组织炎症细胞浸润和组织结构；用免疫组织化学方法检测CD47、SIRP-a、CD68的表达情况。结果见图1中A。

1.2人肺癌细胞株H1229在未经处理的情况下，用FACS方法检测CD47的表达。结果见图1中B。

1.3体外培养原代肺癌细胞，用FACS分析CD47的表达量，随着培养时间延长，CD47表达量渐高。如图1中C所示。

1.4体外培养原代癌细胞12天后，在光学显微镜下观察到肿瘤生长成巨大球状，免疫组织化学染色显示具有高表达的CD47。结果见图1中D。

实验表明CD47在肺癌组织、原代肺癌细胞和细胞株的表达水平高于正常组织，证实了CD47在肺癌组织中高表达。这一结果与最近复旦大学肿瘤医院在J Cancer Res ClinOncol上发表的结果相似，CD47表达水平与肿瘤大小正相关(Fu F,et al.J Cancer ResClin Oncol.2021,147:739)。

实施例2噬菌体多肽文库筛选

1.1构建噬菌体多肽文库

将人重组rCD47蛋白包被到MaxiSorp 96孔板，再用含有多肽文库的噬菌体(Ph.D.Phage display libraries,New England BioLabs,Inc,Ipswich,MA,USA)加入包被的小孔，使含有特异多肽片段的噬菌体与rCD47结合，没有结合的噬菌体被洗脱后，再用第一次与rCD47结合的噬菌体进行第二次结合、洗脱、浓缩和扩增过程，反复3-5次筛选后，挑选20个单个克隆，进行DNA测序，DNA测序委托铂尚生物科技(上海)有限公司进行。分析和比较这20个克隆的DNA序列，挑选20个克隆里出现率最高的DNA序列为CD47靶向特异序列。本发明中最高出现率的克隆为表1中的序号1-8和13号，占全部克隆的9/20，是结合CD47的主要特异的多肽序列，其他序列繁杂多样，不够特异，被淘汰。所以将该序列定为CD47靶向特异序列，并换算出氨基酸序列，用于合成CD47KLA多肽片段，CD47KLA多肽的合成委托吉尔生化(上海)有限公司合成。

最终，筛选出20条有潜力靶向CD47分子的多肽，构建一个PD.h12噬菌体多肽文库，它们的氨基酸序列列于下述表1。

表1、备选的靶向CD47分子的多肽

1.2筛选特异结合CD47分子的多肽

据报道，KLA多肽重复序列可与细胞的线粒体膜结合，诱导细胞凋亡(Alves ID,etal,Biochim Biophys Acta,2014,1838:2087；Charbgoo F,et al.2018,Nanomedicine,14:685)。因此，在本发明的多肽序列设计中，为了强化多肽诱导细胞凋亡的能力，将筛选出的CD47序列VQRHTSNLSVMSGG(表1中序号1-8和13号)的C端加上KLA多肽重复序列。通过生物信息学分析和反复优化，选定该KLA多肽重复序列为GSKLAKLAKKLAKLAK。最终，确定了本发明靶向CD47分子的多肽的完整序列为SEQ ID NO:1：VQRHTSNLSVMSGGGSKLAKLAKKLAKLAK(SEQID NO:1)。

由于该靶向CD47分子的多肽中存在KLA重复序列，本文中将其命名为CD47KLA。该多肽具有靶向和诱导癌细胞凋亡的双重作用。

1.3合成CD47KLA多肽及其对照多肽序列

为了研究多肽CD47KLA的生物活性，吉尔生化(上海)有限公司进行多肽合成，并对其进行C端酰胺化处理。

作为实验对照肽，设计Scramble peptide，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2：

NHRQVTSMSLSVGGGSKLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO:2)，命名为SCKLA。

委托吉尔生化(上海)有限公司合成SCKLA，并对其进行C端酰胺化处理。

实施例3考察多肽CD47KLA对小鼠肺癌模型中肺癌细胞的生长

为了考察CD47KLA抑制小鼠肺癌模型中肺癌细胞的生长情况，用30μM CD47KLA处理小鼠肺癌细胞后，以1×10⁶个细胞剂量，通过腹股沟皮下注射到C57/B6成年小鼠，观察肿瘤生长情况。在不同时间点观察肿瘤大小，并绘制生长曲线图。作为对照，用同样剂量(1×10⁶个细胞)的LLC肺癌细胞通过腹股沟皮下注射到C57/B6成年小鼠，观察肿瘤生长情况；用30μM对照肽Scramble peptide(SCKLA)处理小鼠肺癌细胞后，以1×10⁶个细胞剂量，通过腹股沟皮下注射到C57/B6成年小鼠，观察肿瘤生长情况。肿瘤生长曲线图见图3中A。结果显示CD47KLA显著抑制LLC肺癌细胞在小鼠体内生长(LLC/CD47KLA组)，观察期间没有发现一个小鼠有肿瘤出现，实验结束时无一小鼠死亡。但Scramble peptide对照组(LLC/SCKLA)和没有经过处理的对照组(LLC/0)的小鼠均有肿瘤生长，实验结束时小鼠死亡各2只，n＝5-7。

参见图3中B和C显示了用FACS方法分析肿瘤组织的中性粒细胞(Ly6G+CD11b+cells，NPs)和巨噬细胞(Ly6G-CD11b+cells，MPs)浸润情况。结果显示随着肿瘤越大，NPs和MPs细胞浸润越多，与肿瘤大小呈正相关。

图3中D显示了FACS方法进一步分析CD47在肿瘤组织各细胞群体的表达水平，CD47在NPs和MPs表达较少，而在LLC表达较多。肿瘤越大，LLC表达的CD47越高，显示CD47可能参与抑制巨噬细胞吞噬肿瘤，可作为肿瘤生长的潜在生物标志。

上述实验结果表明CD47KLA抑制小鼠肺癌模型中肺癌细胞的生长。

实施例4腹腔注射CD47KLA的抑制肿瘤效果考察

在C57BL/6成年小鼠中腹腔注射(i.p.)和肿瘤组织内(intratumor)注射50μgCD47KLA或SCKLA后，第二天取肿瘤组织。H&E染色显示，肿瘤组织有炎症细胞浸润(见图4中A)和CD47KLA+细胞(见图4中B和C)，但注射SCKLA的对照组没有发现绿色荧光标记的细胞，表明CD47KLA可通过腹腔靶向迁移到肿瘤组织，并诱导CD47KLA+细胞低表达Arg-1和Ki67，因此CD47KLA可能通过抑制M2亚型巨噬细胞(TAM)的极化，抑制肿瘤细胞的增殖。

该实验表明，腹腔注射的CD47KLA靶向聚集在动物模型的癌组织，并诱导炎症细胞浸润。

实施例5考察CD47KLA与人肺癌细胞株H1229特异结合能力

分别用10μM、30μM的CD47KLA和对照肽SCKLA分别处理H1229细胞、肺上皮细胞(lung epithelial cells)和巨噬细胞(BMDMs)后，用荧光显微镜观察多肽与细胞的结合情况，并用FACS定量分析结合能力。参见图5中A，荧光显微镜下显示CD47KLA结合H1229细胞，浓度越高结合能力越强。CD47KLA与小鼠正常肺上皮细胞和骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)结合能力较弱。FACS定量分析发现CD47KLA结合H1229细胞的能力与CD47KLA的浓度正相关，如图5中B和C所示。

该实验表明，CD47KLA浓度依赖性地特异结合人肺癌H1229细胞，且CD47KLA与人肺癌细胞株H1229特异结合的能力明显高于正常细胞。

实施例6考察CD47KLA对于人肺癌细胞H1229的影响

分别用5μM、10μM、30μM的CD47KLA和对照肽SCKLA分别处理人肺癌细胞H1229，加入细胞24小时后，用FACS检测方法检测细胞的凋亡，并用CCK-8测定细胞存活和增殖情况。结果如图6所示，CD47KLA浓度依赖性地诱导细胞凋亡(7-AAD+AnnexinV+cells)。CD47KLA诱导细胞H1229凋亡的能力明显大于对照肽SCKLA，细胞H1229对于CD47KLA的耐受性小于对照肽SCKLA。

该实验表明，多肽CD47KLA与人肺癌H1229细胞结合后，诱导细胞凋亡，减低其生存能力(图6)。

实施例7考察CD47KLA和anti-CD47中和抗体联合使用的效果

单独用30μM CD47KLA处理A549、LLC癌细胞24hrs；单独用30μM对照肽SCKLA处理A549、LLC癌细胞24hrs；并且联合使用30μM CD47KLA和1μg/ml anti-CD47抗体处理A549、LLC癌细胞24hrs，用荧光显微镜观察多肽CD47KLA与细胞的结合情况，用FACS检测方法检测PI+的凋亡细胞，并用CCK-8测定细胞存活和增殖情况。结果如图7所示。参见图7中A，CD47KLA和anti-CD47中和抗体联合使用协同增加了CD47KLA与肺癌细胞的结合能力，诱导细胞凋亡，说明CD47KLA和anti-CD47中和抗体结合CD47分子不同的表位位点。CD47KLA与anti-CD47中和抗体联合使用诱导细胞凋亡的能力明显大于单独使用CD47KLA，细胞对于CD47KLA与anti-CD47中和抗体联合使用的耐受性小于单独使用CD47KLA。

上述实验表明，多肽CD47KLA能够与肺癌细胞特异结合，并诱导细胞凋亡，但其与正常肺上皮细胞、巨噬细胞等结合能力较弱，表明CD47KLA具有特异靶向杀伤肺癌细胞的功能。而且CD47KLA能够与anti-CD47中和抗体联合使用，产生协同效应，具有应用于抗癌的前景。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> 特异结合人CD47分子的多肽及其用途

<130> SHPI2110054

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Val Gln Arg His Thr Ser Asn Leu Ser Val Met Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Asn His Arg Gln Val Thr Ser Met Ser Leu Ser Val Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys

20 25 30

Claims

1.一种多肽，其选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽：

VQRHTSNLSVMSGGGSKLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO:1)；

(c)与(a)限定的多肽序列有90％以上同源性、且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)对(a)或(b)或(c)中所述多肽进行化学修饰的衍生多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述化学修饰是C末端的酰胺修饰。

3.一种抗癌药物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的多肽作为活性成分。

4.如权利要求3所述的抗癌药物，其特征在于，还包含一种以上辅助治疗剂。

5.如权利要求4所述的抗癌药物，其特征在于，所述辅助治疗剂是anti-CD47中和抗体。

6.如权利要求3所述的抗癌药物，其特征在于，所述抗癌药物用于治疗肺癌。

7.如权利要求3至6中任一项所述的抗癌药物，其特征在于，所述抗癌药物为药物组合物，含有如权利要求1或2所述的多肽、以及药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的抗癌药物，其特征在于，药物组合物中还含有蛋白质稳定剂。

9.如权利要求3至6中任一项所述的抗癌药物，其特征在于，药物的剂型是冻干剂或者注射剂。

10.如权利要求9所述的抗癌药物，其特征在于，经静脉注射、静脉滴注或肿瘤组织局部施用而给药。