CN112979760A - 一种肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示。本发明中的特异靶向功能肽具有对靶分子很强的靶向结合力，能够特异靶向高表达Fn14的激活状态下的肝星状细胞。

Description

一种肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽及其应用。
背景技术
众所周知，肝纤维化(HF)是对各种病因所至的慢性肝损伤刺激导致的一种自我修复反应，其实质是肝内细胞外基质(ECM)合成大于降解导致大量ECM过度沉积。这种慢性肝病若持续发展，将转变为肝硬化或肝癌。研究表明，可逆的肝纤维化一旦发展为肝硬化或肝癌，将无法逆转。因此对于肝纤维化的治疗尤为关键。
肝星状细胞已被证明是肝纤维化的主要效应细胞之一。肝星状细胞激活并转化为肝肌成纤维细胞(MFB)，在MFB的自分泌和旁分泌作用下，以胶原为主的细胞外基质过度沉积，促使肝纤维化发生。因此肝星状细胞是一个非常有潜力的治疗靶点。进一步研究发现，在肝纤维化过程中，肝星状细胞会特异的高表达一种受体-成纤维细胞生长诱导因子14(Fn14)。Fn14与其配体肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(TWEAK)被证明和肝脏再生有关，同时也被应用到许多抗肝纤维化的研究中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽。
本发明的另一目的在于提供上述肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽的应用。
本发明的技术方案如下：
一种肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示。
在本发明的一个优选实施方案中，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01。
本发明的其他技术方案如下：
特异靶向功能肽在制备靶向肝星状细胞的药物中的应用，所述特异靶向功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述特异靶向功能肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.01所示。
一种靶向肝星状细胞的药物，其具有如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示的特异靶向功能肽。
在本发明的一个优选实施方案中，其具有如SEQ ID NO.01所示的特异靶向功能肽。
一种靶向肝星状细胞的药物载体，其具有如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示的特异靶向功能肽。
在本发明的一个优选实施方案中，其具有如SEQ ID NO.01所示的特异靶向功能肽。
一种腺相关病毒，其具有如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示的特异靶向功能肽。
在本发明的一个优选实施方案中，其具有如SEQ ID NO.01所示的特异靶向功能肽。
本发明的有益效果是：本发明中的特异靶向功能肽具有对靶分子很强的靶向结合力，能够特异靶向高表达Fn14的激活状态下的肝星状细胞。
附图说明
图1为本发明实施例2的实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
本实施例通过噬菌体展示技术筛选获得本发明的特异靶向功能肽，其具体筛选方法是通过非特异的疏水作用或静电相互作用直接将靶分子包被于塑材表面，洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体覆盖在靶分子包被的平面上，经过三轮淘选而获得。
本实施例中的靶分子为Fn14胞外部分，该Fn14胞外部分由43个氨基酸组成，氨基酸序列为：
EQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAAA(SEQ ID NO.03)。由强耀生物科技有限公司化学合成。采用固相合成法，在树脂上完成氨基酸的脱水缩合反应，然后再去掉保护进行切割，冻干成粉末状。
本实施例中的噬菌体展示技术所用的噬菌体展示文库试剂盒(Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒，购自NEB)中的受体菌E.coli ER2738(12肽库)。
通过三轮淘选，获得两条特异靶向功能肽KHG和KHV，具体序列如下：
KHG：KHLHYHSSVRYG(SEQ ID NO.01)
KHV：KHLHYHSSVRYV(SEQ ID NO.02)
KHG和KHV经噬菌体ELISA检测验证，其OD415的数值均在2.5以上，该ELISA检测以蒸馏水作为空白对照，上述靶分子包被孔为阳性对照，无靶分子包被孔为阴性对照。
实施例2
本实施例对KHG进行细胞靶向性验证结果
一、BRL-3A和HSC-T6细胞复苏
(1)将水浴锅预热至37℃。
(2)用75％酒精擦拭紫外线照射30min生物安全柜台面。在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶。
(3)根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。从液氛罐中取出细胞盒，取出所需的细胞。迅速解冻。
(4)将解冻后的细胞接种于培养瓶中，培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养。
(5)培养皿中的细胞生长率达到80％-90％时进行传代。
(6)把原来的培养基吸掉，加PBS冲洗1到2次，弃掉PBS。
(7)加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-3min。
(8)待细胞都变圆后加如入含血清的培养基终止消化。
(9)用移液枪吹打细胞，把细胞完全都悬浮起来。
(10)根据细胞种类把细胞传到几个培养皿或培养瓶中。
(11)根据需要细胞冻存几管以备用。
二、待检测单克隆噬菌体准备：将从12肽库噬菌体筛选得到含有KHG序列的单克隆噬菌体命名为KHG噬菌体。将扩增后保存的KHG噬菌体重新活化，KHG噬菌体经LB液体培养基稀释108倍后，可以得到分开的噬菌斑。挑取噬菌斑进行扩增用于ELISA检测；KHG噬菌体ELISA检测前进行滴度测定，稀释倍数为1011。
三、ELISA检测所选多肽对细胞的结合
(1)培养皿中的细胞生长率达到80％-90％时进行传代至96孔板中。
(2)待细胞均匀铺满整个微孔时，倒掉培养液，用PBS清洗三次，加入单克隆KHG噬菌体孵育1h。
(3)用多通道移液器将每排稀释好的KHG噬菌体加入包被有靶分子的板中。室温震荡作用1-2h。
(4)用1X TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同。
(5)在封阻液中以1∶5000的比例稀释HRP标记的抗M13抗体每孔加入200倍稀释抗体，室温震荡作用1h。
(6)用1×TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同。
(7)按下述方法准备HRP底物溶液：ABTS贮液可以提前准备：将22mg ABTS溶于100ml 50mM的柠檬酸钠溶液(pH 4.0)中，过滤除菌，4℃贮存。对每个待检测板，于检测步骤前将36uL 30％的H2O2加入21mL ABTS贮液中。
(8)每孔加200uL底物溶液，室温作用10-60min。
(9)用酶标仪记录415nm处的吸光值：HSC-T6为激活状态下的肝星状细胞，特异高表达Fn14。BRL-3A为普通肝细胞。由图1可知，HSC-T6的ELISA检测结果数值明显高于BRL-3A，证明了KHG噬菌体对HSC-T6具有很好的靶向性。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys His Leu His Tyr His Ser Ser Val Arg Tyr Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys His Leu His Tyr His Ser Ser Val Arg Tyr Val
1 5 10
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala
35 40

Claims (10)

1.一种肝星状细胞受体Fn14的特异靶向功能肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO.01或SEQ ID NO.02所示。
2.如权利要求1所述的特异靶向功能肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.01。
3.特异靶向功能肽在制备靶向肝星状细胞的药物中的应用，其特征在于：所述特异靶向功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述特异靶向功能肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.01所示。
5.一种靶向肝星状细胞的药物，其特征在于：其具有如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示的特异靶向功能肽。
6.如权利要求5所述的药物，其特征在于：其具有如SEQ ID NO.01所示的特异靶向功能肽。
7.一种靶向肝星状细胞的药物载体，其特征在于：其具有如SEQ ID NO.01或SEQ IDNO.02所示的特异靶向功能肽。
8.如权利要求7所述的药物载体，其特征在于：其具有如SEQ ID NO.01所示的特异靶向功能肽。
9.一种腺相关病毒，其特征在于：其具有如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所示的特异靶向功能肽。
10.如权利要求9所述的腺相关病毒，其特征在于：其具有如SEQ ID NO.01所示的特异靶向功能肽。
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