KR102534966B1 - 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기 및 이의 용도 - Google Patents

줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 시스테아민(Cysteamine); 및 외피 단백질(coat protein)에 세포 전달 펩티드를 디스플레이(display)한 재조합 파지(Recombinant Phage);가 코팅된, 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기 및 이의 제작 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기는, 파지의 나노섬유성 구조체의 형성에 의해 생성되는 물리적 및 기계적 니쉬 환경을 제공하여 타겟 세포의 생리학적 활성 증가를 촉진시키므로, 궁극적으로 조직 재생을 도와 탁월한 해당 질환 치료제로 응용할 수 있다.

Description

줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기 및 이의 용도{Recombinant Phage-Based Culture Container For Stem Cell Culture and Uses Thereof}
본 발명은 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기 및 이의 용도에 관한 것이다.
심장 전구 세포는 심장내에 존재하는 줄기세포로 혈관형성 심근재생 등 조직재생에 관여하는 줄기세포이다. 심혈관질환은 세계적으로 가장 사망률이 높은 질환 중 하나이며 이러한 심장질환은 스트레스, 잘못된 식습관, 흡연, 운동 부족, 당뇨 등 여러 가지 원인에 의해 발병률이 증가하고 있는 상황이다.
이에 대한 치료법으로는 약물요법, 심장이식, 스텐트 수술 등 다양한 수술요법이 개발되어 왔으나, 현재까지 확립된 치료법으로 완치되지 못하는 경우가 많으며 합병증을 동반함으로서 치료효율이 극히 낮은 실정이다.
때문에 이러한 저조한 효율의 치료법의 대안으로 허혈 부위에 세포를 이용하여 치료하는 세포치료법이 제안되고 있다.
이러한 줄기세포를 이용한 세포치료법의 경우 체외배양시 발생하게 되는 낮은 증식능과 세포 기능의 저하로 인하여 치료제로서의 활용이 제한적이다. 이에 따라 줄기세포의 수를 확보하고 기능을 증진시키는 새로운 배양법이 요구된다.
종래의 심혈관재생을 위한 치료법으로는 줄기세포 단독 또는 성장인자의 투여와 같은 방법들이 존재하나, 실질적으로 혈관세포를 증식 및 분화시키기에는 기능적 한계가 있었다. 줄기세포를 단독으로 사용하는 경우, 투여한 줄기세포의 생착률 및 생존률이 낮고, 줄기세포가 생존해 있더라도 증식 및 분화를 조절할 수 있는 것에 한계가 있으며, 성장인자의 단독투여는 단회성 효과만을 제공하므로 지속적인 효과를 내는데 한계가 있다.
한편, 줄기세포의 기능을 증진시키기 위해서는 성장인자, 합성화합물, 천연물 유래 화합물 등을 처리하여 줄기세포의 기능을 증진시키는 방법들이 존재하나, 약물을 처리하여 체외배양시 세포가 플레이트에 부착할 수 있는 부착능을 증진시키고 세포의 증식능과 기능을 조절시키기에는 한계가 있다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 체외배양시 줄기세포의 부착능과 기능을 증진시킬 수 있는 세포미세환경을 구현하고 이러한 세포미세환경을 모사한 플레이트를 개발하는 것이 중요하게 생각되고 있다.
세포 배양기에 세포미세환경을 구현하는 기술로는 여러 가지 방법들이 존재하는데, 그 중 M13 파지 디스플레이는 박테리아에 특이적으로 감염하는 M13 박테리오파지(M13 bacteriophage)를 기반으로 유전자에 다양한 펩타이드(peptide)를 발현하는 재조합 박테리오파지를 이용해 기판위에 배열시키는 기술이다. 이러한 파지 디스플레이 기술의 경우 인체에 무해하며 줄기세포의 기능 증진을 위한 펩타이드 전달 기술을 바탕으로 이미 검증되어 있다.
최근 조직재생 및 조직공학분야에서 나오는 연구결과에 따르면, 세포의 증식 및 분화를 조절할 수 있도록 하는 외부적 환경에 해당하는 세포미세환경, 즉, "니쉬(niche)"의 중요성이 대두되고 있는데 이 외부적 니쉬를 모사할 수 있는 생화학적 및 구조적 특징을 가지는 모사환경을 구성하는 것이 중요하게 생각되고 있다.
이러한 세포내 환경을 효과적으로 구현하고, 심장 전구 세포의 증식 및 기능을 증진시키는 데파지 디스플레이(Phage display)를 이용할 수 있다.
단백질과 단백질간의 상호작용(protein-protein interaction)을 탐색하는 기술에는 여러 가지가 있는데, 그 중 파지 디스플레이(phage display)는 박테리아(bacteria)에 특이적으로 감염하는 기생체인 박테리오파지(bacteriophage)의 유전자에 인위적으로 다양한 아미노산 서열을 생산하는 유전자를 도입하여 생산한 재조합 박테리오파지를 이용해 특정 단백질과 결합능력이 있는 미지의 아미노산 서열을 선발하는 기술로써, 항원 결정기의 동정(epitope mapping), 백신 개발, 작용기-수용체 결합능력 확인(ligand-receptor affinity research), 생리활성 펩티드 선발 등 다양한 분야에서 그 활용성이 검증되어 있다. 대표적으로 쓰이는 M13 파지 디스플레이 시스템의 경우에는 M13 박테리오파지의 게놈 중에서 외피 단백질(coat protein)의 일종인 pIII 또는 pVIII를 생산하는 유전자 말단에 7 ~ 15개의 무작위 아미노산 서열의 펩티드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩티드를 발현한 재조합 박테리오파지를 이용해 바이오패닝(biopanning)이라는 일련의 과정을 거쳐 특정 단백질과 강한 결합능력을 보이는 파지를 선발하도록 고안되어 있다. 이렇게 선발된 박테리오파지로부터 게놈 DNA를 추출해 인위적으로 삽입했던 특정 펩티드를 발현하는 DNA 염기서열을 분석하면 목적하는 작용기 펩티드를 얻을 수 있게 된다.
즉, 파지 디스플레이는 파지의 유전자 정보를 이용하여 파지 표면에 특정 외피 단백질이 발현되도록 하고, 상기 파지 표면의 외피 단백질을 이용하여 세포와 인식하게 하는 표면 단백질을 통해 세포의 혈관으로의 증식 및 분화를 유도 및 조절할 수 있게 할 수 있을 뿐만 아니라, 파지의 나노섬유성 구조체의 형성에 의해 생성되는 물리적 및 기계적 니쉬환경을 제공할 수 있게 한다.
따라서, 파지-기반 플레이트에 의해 배양되어 줄기세포의 생리학적 활성이 향강된 심장 전구 세포를, 허혈성 질환 등에서 비가역적 조직괴사가 일어난 곳에 공급함으로써 심혈관 재생을 유도한다면 현재 심혈관계 치료제의 한계를 극복할 수 있을 것이다.
본 발명자는 심혈관계 질환 치료제 및 치료 방법을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 항산화제인 시스테아민 코팅, 인체조직에 무독한 M13 파지의 구조적 특징을 이용하여 재조합 유전자 공학 기법으로 표면에 세포 전달 시그널 펩티드를 발현하는 M13 파지를 배양 플레이트에 코팅하여 줄기세포를 배양하였을 때,상기 파지-기반 플레이트에 의해 배양된 줄기세포는 줄기세포 본래의 고유한 성질은 유지하면서 부착능, 증식능,이동능 및 혈관생성능이 탁월하게 증진됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 시스테아민(Cysteamine); 및 외피 단백질(coat protein)에 세포 전달 펩티드를 디스플레이(display)한 재조합 파지(Recombinant Phage);가 코팅된 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기의 제작 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 부착능, 증식능, 이동능 및 혈관생성능을 향상시키는 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 심혈관 재생용 줄기세포 생산 방법을 제공하는 데 있다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 시스테아민(Cysteamine); 및 외피 단백질(coat protein)에 세포 전달 펩티드를 디스플레이(display)한 재조합 파지(Recombinant Phage);가 코팅된, 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기를 제공한다.
본 발명의 파지-기반 줄기세포 배양용 플레이트에 이용되는 시스테아민은 항산화제로서, CAS 번호 156-57-0로 확인되는 화합물이다.
본 발명에서 상기 시스테아민(Cysteamine) 농도는, 본 발명에서 목적 효과를 달성하는 한, 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 mM 내지 1 M이고, 보다 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM이며, 가장 바람직하게는 50 mM이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기"는 시스테아민(Cysteamine)을 코팅한 후, 외피 단백질(coat protein)에 세포 전달 펩티드를 디스플레이(display)한 재조합 파지(Recombinant Phage)를 코팅시킨 세포 배양 용기를 의미하며, 본 명세서에서 "파지-기반 배양(용) 플레이트"와 혼용하여 사용된다.
상기 용기는 세포 배양 플레이트, 페트리 디쉬, 배양 플라스크, 챔버 슬라이드, 챔버 또는 튜브 형태일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 일 실시예에서는 플레이트를 이용하였다.
또한, 상기 세포 배양 용기는 유리, 폴리스티렌, 폴리카프로락톤 및 폴리프로필렌으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 소재일 수 있으나, 타겟 세포가 부착되기에 적합한 소재라면 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "세포 전달 펩티드"는 "시그널 펩티드" 및 "시그널 서열"과 상호교환적으로 사용되며, 세포부착 모티프에 해당되는 것이다. 따라서, 세포부착 아미노산 서열을 필수 서열로 포함하는 보다 긴 아미노산 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 전달 펩티드는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val), RGES(Arg-Gly-Glu-Ser), RGDSPASSKP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Pro), GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser), GRADSP(Gly-Arg-Ala-Asp-Ser-Pro), KGDS(Lys-Gly-Asp-Ser), GRGDSP(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro), GRGDTP(Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro), GRGES(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser), GRGDSPC(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys), GRGESP(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro), SDGR(Ser-Asp-Gly-Arg), YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser), GQQHHLGGAKQAGDV (Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), GPR(Gly-Pro-Arg), GHK(Gly-His-Lys), YIGSR(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), CDPGYIGSR(Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), LCFR(Leu-Cys-Phe-Arg), EIL(Glu-Ile-Leu), EILDV(Glu-Ile-Leu-Asp-Val), EILDVPST(Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr), EILEVPST(Glu-Ile-Leu-Glu-Val-Pro-Ser-Thr), LDV(Leu-Asp-Val) 및 LDVPS(Leu-Asp-Val-Pro-Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 RGD(Arg-Gly-Asp), RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser), RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys), RGDV(Arg-Gly-Asp-Val)및 RGES(Arg-Gly-Glu-Ser)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 RGD(Arg-Gly-Asp)이다.
상기 "Arg-Gly-Asp 펩티드" 또는 "RGD 펩티드"는 "수용체의 Arg-Gly-Asp 군", 예를 들면, 인테그린의 수용체에 대한 결합 부위로서 기능할 수 있는 서열을 함유하는 하나 이상의 Arg-Gly-Asp를 갖는 펩티드를 지칭하는 것으로 된다. 또한, RGD 펩티드는 동일한 RGD 수용체와 상호 작용하는 경우 RGD 펩티드의 기능성 동등물인 아미노산을 갖는 펩티드를 포함한다.
본 발명의 RGD 서열을 함유하는 펩티드는 당해 분야에서 익히 공지된 수단에 의해 아미노산으로부터 합성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "파지(phage)" 또는 "박테리오파지(bacteriophage)"는 세균을 감염시키는 바이러스의 일종으로 파지로 부르기도 한다. 파지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 되어있다. 이 핵산을 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조로 20면체 머리에 꼬리가 있는 형태, 20면체 머리에 꼬리가 없는 형태, 및 필라멘트형의 3가지 기본형 구조로 나뉜다. 가장 흔한 형태인 20면체 머리에 꼬리가 있는 형태의 박테리오파지는 꼬리 특성에 따라 수축성 꼬리를 가지는 미오오비리데(Myoviridae), 길고 수축성이 없는 꼬리를 갖는 시포비리데(Siphoviridae), 및 짧은 꼬리를 갖는 포도비리데(Podoviridae)로 세분화될 수 있다. 20면체 머리에 꼬리가 없는 박테리오파지는 머리의 형태, 머리의 구성성분 및 외피의 유무에 따라 세분화된다. 마지막으로, 필라멘트 형태의 박테리오파지는 크기, 모양, 외피 및 필라멘트 구성성분에 따라 세분화된다.
상기 파지는 그 종류를 제한하지 않으며, T1,T2, T4, T6 또는 λ(람다), μ(뮤), M13 등일 수 있고, 본 발명에서는 M13을 이용한다.
본 발명에서 이용하는 재조합 파지는 M13 파지의 게놈 중에서 외피 단백질을 생산하는 유전자에 목적하는 3 내지 15개의 아미노산 서열의 펩티드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입하여 목적의 펩티드를 발현한다.
상기 파지는 다양한 외피 단백질(coat protein)로 구성되어 있으며, 예를 들면 P3(PIII), P6(PVI), P7(VII), P8(VIII), P9(IX) 등으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 외피 단백질은 P3, P6, P7, P8 및 P9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이다.
본 발명에서, 상기 재조합 파지는 P3, P8 및 P9로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 단백질에 펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명에서 이용되는 재조합 파지는 주외피 단백질(major coat protein)인 P8에 RGD를 포함하는 5 내지 10 개의 아미노산 서열로 이루어진 세포 전달 펩티드를 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 RGD를 포함한다.
즉, 상기 재조합 파지는 주외피 단백질(major coat protein) P8에 세포친화성을 가지는 RGD를 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 디스플레이한다.
본 발명에서 상기 재조합 파지(Recombinant Phage)의 농도는, 본 발명에서 목적 효과를 달성하는 한, 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.01 mg/ml 내지 10 mg/ml이고, 보다 바람직하게는 0.1 mg/ml 내지 1 mg/ml이며, 본 발명에서는 0.25 mg/ml 농도로 이용하였다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포 배양용 플레이트에 코팅된 재조합 파지에 의해 배양되는 줄기세포는 본래의 고유한 성질은 유지하면서 부착능, 증식능, 이동능 및 혈관생성능(혈관형성능)이 탁월하게 향상된다.
바람직하게는, 상기 줄기세포는 심장 전구 세포(cardiac progenitor cell, CPC), EPCs(Endothelial Progenitor Cells), ECFCs(Endothelial Colony Forming Cells), VPCs(Vasculogenic Progenitor Cells), 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cells) 및 근모세포(Myoblasts)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 CPC (cardiac progenitor cell), EPCs(Endothelial Progenitor Cells), ECFCs(Endothelial Colony Forming Cells) 및 VPCs(Vasculogenic Progenitor Cells)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 심장 전구 세포(cardiac progenitor cell, CPC)이다.
상기 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기는 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명의 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기는, 피더세포(feeder cell) 없이, 항산화제인 시스테아민을 코팅하고, 파지 표면에 특정 외피 단백질이 발현되도록 재조합한 파지를 이용함으로써, 상기 파지 표면의 외피 단백질을 이용하여 타겟 세포인 줄기세포(바람직하게는, CPC)와 인식하게 하는 표면 단백질을 통해 세포의 기능을 향상시킬 수 있도록 할 뿐만 아니라, 파지의 나노섬유성 구조체의 형성에 의해 생성되는 물리적 및 기계적 니쉬 환경을 제공하여 심장 전구 세포의 줄기세포 본래의 고유한 성질은 유지하면서 부착능, 증식능,이동능 및 혈관생성능을 촉진시킬 수 있도록 한다.
따라서, 본 발명은 체외에서 경제적인 비용으로 상술한 목적 줄기세포의 생리학적 활성은 증가시키면서 대량의 줄기세포를 배양할 수 있는 줄기세포 배양용 플레이트라는 이점을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시스테아민(Cysteamine); 및 외피 단백질(coat protein)에 세포 전달 펩티드를 디스플레이(display)한 재조합 파지(Recombinant Phage);를, 세포 배양 용기에 코팅시키는 단계를 포함하는 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기의 제작 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상술한 시스테아민 및 재조합 파지를 이용하여 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기를 제작하는 것이므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 상술한 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기를 이용하여 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 부착능, 증식능, 이동능 및 혈관생성능을 향상시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 심혈관 재생용 줄기세포 생산 방법을 제공하며, 상기 줄기세포는 부착능, 증식능, 이동능 및 혈관생성능이 향상된 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
상기 배양된 줄기세포, 바람직하게는 심장 전구 세포는, 심장 전구 세포 본래의 고유한 성질은 유지하면서 부착능, 증식능,이동능 및 혈관생성능이 향상되므로, 이를 허혈성 질환의 치료 용도로 적용할 수 있다.
상기 허혈성 질환은 허혈성 심장질환,허혈성 뇌질환,허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 허혈성 심장질환은 심근경색, 심부전증 또는 협심증일 수 있다.
본 발명의 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기는 파지의 나노섬유성 구조체의 형성에 의해 생성되는 물리적 및 기계적 니쉬 환경을 제공하여 타겟 세포의 생리학적 활성을 증진시키므로, 궁극적으로 특정 조직 재생을 도와 탁월한 대상 질환의 치료제를 제조하는 데 응용할 수 있고, 이를 통해 기능이 향상된 줄기세포 치료제를 효과적으로 생산할 수 있다.
도 1은 재조합된 M13 박테리오 파지의 유전자 모식도이다. 파지의 외피부분인 P8 부위에 RGD 서열이 포함된 파지의 시퀀싱(sequencing) 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 파지-기반 배양용 플레이트의 제작 과정을 개략적으로 보여준다.
도 3a은 본 발명의 파지-기반 배양용 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포의 부착능력을 확인한 CCK assay 결과를 보여준다. 도 3b는 본 발명의 파지-기반 배양용 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포의 증식능력을 확인한 결과이다(1일차, 3일차). 도 3c는 본 발명의 파지-기반 배양용 플레이트에서 배양한 세포들의 형태를 보여준다.
도 4는 본 발명의 파지-기반 배양용 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포의 마커들의 발현을 확인한 FACS 결과를 보여준다.
도 5a는 본 발명의 파지-기반 배양용 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포의 세포 이동능력을 확인한 scratch wound healing assay 결과를 보여준다. 도 5b는 상기 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 파지-기반 배양용 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포의 혈관형성능을 확인한 tube-formation assay 결과를 보여준다. 도 6b는 상기 결과를 정량화한 그래프이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 파지-기반 배양 플레이트의 제작 및 배양
본 발명자들은 허혈성 심혈관 질환에 적용하는데 필요한, 생리학적 활성이 향상된 줄기세포를 획득하기 위해, 기능적인 M13 파지(phage)-기반줄기세포 배양용 플레이트를 하기와 같이 제작하였다.
간략하게는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 플레이트를 시스테아민(Cysteamine, 50 mM)으로 4 시간 코팅한 후, 세척 과정을 거치고 M13 박테리오파지를 PBS에 현탁하여 농도별로 코팅하여 실험을 진행하였다.
이때, M13 파지(New England Biolabs)는 유전자 재조합 기법을 바탕으로 주외피 단백질인 p8 부위에 세포친화성을 가지는 RGD를 발현시킨 M13-RGD 파지(서열번호 1; MLSFFAGGRGDSDDYDPAK) 및 야생형 파지(서열번호 2; MLSFAAEGDDPAKAAFN)를 이용하였다(도 1).
실시예 2. 본 발명의 재조합 파지-기반플레이트에 의한 줄기세포 활성 증진 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 구축된 재조합 파지-기반 플레이트 배양 시스템에 의해 획득된 줄기세포의 생리학적 기능 활성 수준을 in vitro에서 확인하였다.
2-1. 본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트에 의한 줄기세포의 부착능 및 증식능 증가
본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트 배양 시스템에 의해 향상된 줄기세포의 기능 평가를 위해, CCK assay 를 실시하여, 재조합 파지-기반 플레이트 배양 시스템에 의해 배양된, 심장줄기세포인 심장 전구 세포(cardiac progenitor cell, CPC)의 부착능 및 증식률을 확인하였다.
간략하게는, 세포증식은 CCK8-assay kit(CCK-3000, Donginbio tech)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. 10000개의 세포를 96well plate에 하루 동안 배양하고 다음날 CCK8-kit를 사용하여 세포증식능을 검증하였다.
이때, 파지 농도는 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/ml로 이용하였고, 대조군으로는 야생형 파지(Wild type phage, WT)를 코팅한 플레이트에 배양하여 획득한 심장 전구 세포를 이용하여 비교하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 대조군인 야생형 파지(Wild type phage)그룹과 비교하였을 때, RGD 파지가 코팅된 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포가 RGD 파지-농도의존적으로 부착능이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이,대조군인 야생형 파지(Wild type phage) 그룹과 비교하였을 때, RGD 파지가 코팅된 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포의증식능이 유의하게 증진되는 것을 확인하였다.
도 3c는 본 발명의 파지-기반 배양플레이트에서의 세포들의 형태를 보여준다.
2-2. 본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트에 의한 줄기세포의 고유 성질 유지
본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트 배양 시스템에 의해 줄기세포의 고유한 성질이 유지되는 지를 평가하기 위하여, 재조합 파지-기반 플레이트 배양 시스템에 의해 배양된 심장 전구 세포(cardiac progenitor cell, CPC)에서 발현되는 마커들을 FACS로 확인하였다.
이 때, FACS는 60mm²플레이트에 200,000개의 세포를 각 그룹별로 분주한 후 세포를 플레이트에서 떼어 형광이 컨쥬게이션된 Flow cytometry용 항체를 FACS 버퍼에 1:100의 농도로 처리한 후 4℃에 30분간 빛을 차단하여 반응시킨다. 이어서, FACS 버퍼에 세척한 후 Flow cytometry 기계로 측정하였다.
이때, 파지농도는 0.25 mg/ml로 이용하였고, 대조군으로는 야생형 파지(Wild type phage, WT)를 코팅한 플레이트에 배양하여 획득한 심장 전구 세포를 이용하여 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이,대조군인 야생형 파지(Wild type phage)그룹과 비교하였을 때, CPC의 마커로 알려진 CD44, CD105 및 CD29에 대해 양성; CD34 및 CD45에 대해 음성으로 나타났으며, 이는 본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트 배양 시스템에 의해 배양된 줄기세포는 그 고유능이 유지된다는 것을 의미한다.
2-3. 본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트에 의한 줄기세포의 이동능 증가
본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트 배양 시스템에 의해 향상된 줄기세포의 기능 평가를 위해, scratch wound healing assay를 실시하여, 재조합 파지-기반 플레이트 배양시 스템에 의해 배양된 심장 전구 세포(cardiac progenitor cell, CPC)의 이동능을 확인하였다.
간략하게는, 세포이동능을 비교 검증하기 위해 12-웰 플레이트에 200,000개의 세포를 분주하고 웰에 세포가 찰 때까지 배양하고 옐로우 팁을 사용하여 각 웰에 스크레치를 낸 후 PBS로 세척하였다. 3시간 배양 후 현미경 상에서 세포의 wound distance를 이미지화하였다.
이때, 파지농도는 0.25 mg/ml로 이용하였고, 대조군으로는 야생형 파지(Wild type phage, WT)를 코팅한 플레이트에 배양하여 획득한 심장 전구 세포를 이용하여 비교하였다.
그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 대조군인 야생형 파지(Wild type phage)그룹과 비교하였을 때, RGD 파지가 코팅된 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포의 이동능이 유의하게 증진되는 것을 확인하였다.
2-4. 본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트에 의한 줄기세포의 혈관형성능 증가
본 발명의 재조합 파지-기반 플레이트 배양 시스템에 의해 향상된 줄기세포의 기능 평가를 위해 tube-formation assay를 실시하여, 재조합 파지-기반 플레이트배양 시스템에 의해 배양된 심장 전구 세포(cardiac progenitor cell, CPC)의 이동능을 확인하였다.
간략하게는, 96-웰 플레이트을 55㎕ growth factor-reduced matrigel(BD bioscience)로 코팅한 후 8000개의 세포를 분주하여, 5% CO2, 37℃ 환경에서 6시간 배양하였다. 상기 결과 형성된 tube를 현미경상에서 관찰하고 이미지화하였다. Image J를 이용하여 전체 형성된 tube의 개수와 길이를 정량화하였다.
이때, 파지농도는 0.25 mg/ml로 이용하였고, 대조군으로는 야생형 파지(Wild type phage, WT)를 코팅한 플레이트에 배양하여 획득한 심장 전구 세포를 이용하여 비교하였다.
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이,대조군인 야생형 파지(Wild type phage)그룹과 비교하였을 때, RGD 파지가 코팅된 플레이트에서 배양한 심장 전구 세포의 혈관형성능이 유의하게 증진되는 것을 확인하였다.
결론적으로, 본 발명의 시스테아민 및 RGD 파지를 코팅한 파지-기반 배양용 플레이트를 이용한 줄기세포의 배양 방법은, 야생형 파지를 이용한 경우와 비교하여, 줄기세포의 효능을 증가시키는 데 최적화된 배양 방법을 제공한다.
이러한 파지-기반 배양 플레이트를 이용한 줄기세포의 배양은 경제적으로 매우 유용할 뿐만 아니라 대규모 배양에도 매우 적합하다는 것을 알 수 있다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Recombinant Phage-Based Culture Container For Stem Cell Culture and Uses Thereof <130> PNU1-408p <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-RGD phage <400> 1 Met Leu Ser Phe Phe Ala Gly Gly Arg Gly Asp Ser Asp Asp Tyr Asp 1 5 10 15 Pro Ala Lys <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage <400> 2 Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe 1 5 10 15 Asn

Claims (11)

  1. 시스테아민(Cysteamine); 및 재조합 파지(Recombinant Phage);가 코팅된, 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기로서,
    상기 재조합 파지는, 주외피 단백질(major coat protein) P8에, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 디스플레이하며;
    상기 재조합 파지-기반 용기에 의해 줄기세포의 부착능, 증식능, 이동능 및 혈관생성능이 향상되는 것을 특징으로 하는,
    줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기는 배양 플레이트, 페트리 디쉬, 배양 플라스크, 챔버 슬라이드, 챔버 및 튜브 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 심장 전구 세포(cardiac progenitor cell, CPC), EPCs(Endothelial Progenitor Cells), ECFCs(Endothelial Colony Forming Cells), VPCs(Vasculogenic Progenitor Cells), 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cells) 및 근모세포(Myoblasts)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
    줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기는 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는,
    줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기.
  8. 상기 제1항에 있어서,
    상기 시스테아민(Cysteamine) 농도는 1 mM 내지 1 M이고; 상기 재조합 파지(Recombinant Phage)의 농도는 0.01 mg/ml 내지 10 mg/ml인 것을 특징으로 하는,
    줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기.
  9. 시스테아민(Cysteamine); 및 재조합 파지(Recombinant Phage);를, 세포 배양 용기에 코팅시키는 단계를 포함하는 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기의 제작 방법으로서,
    상기 재조합 파지는, 주외피 단백질(major coat protein) P8에, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 디스플레이하며;
    상기 재조합 파지-기반 용기에 의해 줄기세포의 부착능, 증식능, 이동능 및 혈관생성능이 향상되는 것을 특징으로 하는,
    줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기의 제작 방법.
  10. 제1항, 제2항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 부착능, 증식능, 이동능 및 혈관생성능을 향상시키는 방법.
  11. 제1항, 제2항, 제6항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 줄기세포 배양용 재조합 파지-기반 용기에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 심혈관 재생용 줄기세포 생산 방법으로서,
    상기 줄기세포는 부착능, 증식능, 이동능 및 혈관생성능이 향상된 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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