CN112972653B - Chbp在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用。使用方法为每20g小鼠每日腹腔注射给药1ugCHBP，术前12至术后7天为一疗程。大量实验数据证明，CHBP在促进超长随意皮瓣成活具有明显效果，并且在治疗过程中，对消除水肿、改善血流量、促进微血管生成、提高VEGF表达量、抑制氧化应激具有明显效果。

Description

CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用。

背景技术

近年来，随意皮瓣是常见的修复性皮瓣，常用于修复因各种原因(如创伤、先天性疾病、癌症切除、糖尿病)而引起的皮肤缺损。但是在随意皮瓣的长宽比超过1.5∶1的时候，其远端血液供应不良使其出现不同程度的坏死，这对随意皮瓣在临床的应用带来很大的限制。

Cyclized helix B peptide(CHBP)是经过修饰后的一种环状多肽，它的前身是Helix B surface peptide(HBSP)。HBSP是来源于促红细胞生成素的一种多肽，在缺血再灌注损伤期间显示强大的组织保护作用，能显著抑制细胞死亡，而没有促红细胞生成的副作用。然而其稳定性差，且体内代谢快。通过对其构型进行重新设计，生成了一种环状的新型多肽--Cyclized helix B peptide(CHBP)。这种环状的结构在保留功能的同时极大提高了其稳定性和体内循环时间。此外，目前还没有关于CHBP能影响随意皮瓣存活的报道。因此，CHBP对于促进超长随意皮瓣成活中的应用中具有何种作用有待研究。为此，本方案对CHBP在促进超长随意皮瓣成活的作用进行研究。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于促进超长随意皮瓣成活。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用。

其中，CHBP的使用方法为每20g小鼠每日给药1μgCHBP，术前12至术后7天为一疗程。

优选的给药方式为腹腔注射。

优选的药物配置为每0.5mgCHBP溶于1ml的生理盐水，配置成0.5mg/ml溶液，然后用生理盐水稀释到10μg/ml。

其中，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对减少水肿的作用。

其中，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对血流改善的作用。

其中，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对新生血管再生的作用。

其中，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对血管内皮生长因子VEGF表达量的作用。

其中，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对调节氧化应激的作用。

更进一步的，调节氧化应激至少包括对eNOS、HO-1、SOD1的抗氧化作用能力的调节。

本发明的有益效果：

1.对随意皮瓣的成活具有明显效果。

2.对随意皮瓣的成活过程中的消除水肿具有较好效果。

3.对随意皮瓣的成活过程中的血流量改善具有明显作用。

4.对随意皮瓣的成活过程中的微血管生成具有明显作用。

5.对随意皮瓣的成活过程中提高VEGF表达量具有明显作用。

6.对随意皮瓣的成活过程中抑制氧化应激具有明显作用。

附图说明

图1术后3天及7天生理盐水组、CHBP治疗组皮瓣存活面积对比图；

图2术后7天生理盐水组、CHBP治疗组皮瓣水肿程度对比图；

图3术后7天生理盐水组、CHBP治疗组皮瓣血流灌注量对比图；

图4生理盐水组、CHBP治疗组皮瓣微血管数量对比图；

图5生理盐水组、CHBP治疗组血管内皮生长因子(VEGF)免疫组化分析观察图；

图6生理盐水组、CHBP治疗组蛋白质印迹检测SOD1、HO-1、eNOS表达对比图。

具体实施方式

下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。

缺血随意皮瓣模型建立

选用健康的雄性C57BL/6小鼠60只，由温州医科大学实验动物中心提供，清洁级，SCXK[ZJ]2005-0019，体重20-30g。将小鼠按照随机数字表发分为2组，生理盐水对照组30只，CHBP治疗组30只。采用改良McFlane的皮瓣制作方法，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，将动物俯卧位固定，脱毛，碘伏消毒，铺巾，以小鼠尾部两髂嵴连线为蒂，在背部正中设计一宽1.5cm，长4.5cm矩形尾侧随意型皮瓣，沿设计线切开皮肤，皮下组织，达深筋膜浅层，保留真皮下毛细血管网，于深筋膜浅层表面分离皮下组织，遇到知名血管即以4-0丝线结扎。皮瓣完全掀起后，彻底止血，立即用4-0医用慕丝缝线间断缝合。在每个皮瓣上划分为三个相等的区域：I区(最接近随意皮瓣的尾端部分)、II区和III区(最远端)。切口周围碘伏消毒。

CHBP治疗组：腹腔注射1μg/20g CHBP；生理盐水组：相同剂量腹腔注射。均每日1次，由术前12天至术后7天，连续注射19天。为减少手术操作带来的误差，所有手术均由1人完成。

实施例1，皮瓣存活面积比的检测

术后第3天和第7天，用高质量摄影技术评价其平整度。使用Imag-Pro Plus成像软件识别存活区和缺血区。存活面积百分比计算为：[(存活面积)/(存活缺血总面积)]x100％。术后3天，各组皮瓣在皮瓣远端(III区)均无明显坏死，但出现水肿、苍白。试验组间无定性差异。术后7天，虽然各组皮瓣近端(I区)明显存活，但III区开始出现暗色、硬化、结痂等坏死征象，一些类似的现象也在中间区域(II区)的皮瓣出现。

CHBP治疗组的生存率明显优于生理盐水组。CHBP治疗组、生理盐水组平均生存面积分别为(67.00±3.28)％和(40.37±2.70)％。比较CHBP治疗组和生理盐水组的皮瓣成活面积比，差异具有统计学意义(p＜0.01)(见图1)

实施例2，水肿程度对比的检测

术后7天，每组6只动物的皮瓣被摘除并称重以获得“湿重”。将皮瓣放置在50摄氏度的高压容器中脱水，稳定2天，再次称重，获得“干重”。以术后7天的含水量百分比计算水肿程度，计算公式如下：([湿重-干重]/湿重)×100％。

生理盐水组和CHBP治疗组均有明显的水肿和皮下静脉淤血，而CHBP治疗组则较轻。CHBP治疗组和生理盐水组随意皮瓣含水量分别为(40.33±2.60)％和(54.67±2.91)％，且差异具有统计学意义(p＜0.05)。(见图2)

实施例3，激光多普勒血流仪测定新生血管

术后7天，为测量血流量，将每组6只小鼠麻醉，激光多普勒仪进行扫描。使用灌注装置对血流进行量化，Moor LDI审查软件进行计算。每只动物扫描和测量3次，平均值用于进一步的统计分析。

CHBP治疗组血流改善，定量血流量测量结果与生理盐水组比较有明显改善。CHBP治疗组和生理盐水组血流灌注量分别为(379.36±12.36)PU和(231.76±18.29)PU。比较CHBP治疗组和生理盐水组，差异具有统计学意义(p＜0.01)。(见图3)

实施例4，苏木精和伊红染色(H&E)观察皮瓣微血管数量

术后7天，动物在安乐死后，每组从皮瓣II区(中间位置)取6个1cm×1cm组织标本。将组织浸泡在在4％多聚甲醛中固定，脱水并石蜡包埋后，将标本横切，制成4μm切片，对安装在聚-L-赖氨酸涂布的切片进行H&E染色。在200倍光学显微镜下，选取每组切片的6个区域，计算单位面积微血管数(/mm2)，以量化血管密度。

在血管生成方面，CHBP治疗组微血管密度明显高于生理盐水组。CHBP治疗组和生理盐水组微血管数量分别为(283.33±13.02)/mm2和(158.33±14.53)/mm2。比较CHBP治疗组和生理盐水组，差异具有统计学意义(p＜0.01)。(见图4)

实施例5，免疫组化观察

血管新生是决定皮瓣存活的关键因素，通过检测血管内皮生长因子(VEGF)在皮瓣内的分布，我们探索CHBP对皮瓣的促存活作用是否与内源性血管新生有关。将上述石蜡切片用二甲苯进行脱蜡，并进行分级乙醇浴。切片洗净后用3％(v/v)H2O2封闭。切片置于柠檬酸钠缓冲液中，在95℃环境下20min进行抗原修复，用10％(w/v)牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液封闭10min。最后，在4℃的温度下用抗体孵育切片。切片用HRP结合的二抗再次孵育，用DAB显色和苏木精染色后，随机选择3组切片的6个染色均匀区域，利用DP2-TWAN图像采集系统对皮瓣组织进行了200倍放大成像，利用Image-Pro Plus评价VEGF表达指标。

在CHBP治疗组中，VEGF在皮瓣II区血管内皮细胞和基质细胞中的表达显著高于生理盐水组。比较2组VEGF表达量，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

(见图5)

实施例6，蛋白质印迹法(Western blotting)

鉴于氧化应激在皮瓣存活中起主要作用，我们还研究了CHBP是否调节氧化应激。术后7天，从II区中部选取6个0.5cm×0.5cm皮肤样品，去除肉膜层，称质量，稀释，冰水浴中制成体积分数10％组织匀浆液，离心后取上清液，BCA试剂盒测量各组样品总蛋白浓度。将蛋白样品与5倍SDS-PAGE蛋白上样缓冲液均匀混合，金属浴加热使蛋白变性。经SDS-PAGE行凝胶电泳，转PVDF膜，加入封闭液，封闭2h。然后予以SOD1，eNOS及HO1一抗4℃缓慢摇动孵育过夜，洗膜后，二抗室温孵育2h，洗膜，置于暗室曝光、显影，使用Image J软件分析显影条带，以目的蛋白与GAPDH条带灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

CHBP组eNOS水平高于生理盐水组(P＜0.01)。与生理盐水组相比，CHBP组HO-1和SOD1蛋白水平也明显升高(P＜0.05)。(见图6)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，使用方法为每20g小鼠每日给药1μgCHBP，术前12至术后7天为一疗程。

3.根据权利要求2所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，药物配置为每0.5mgCHBP溶于1ml的生理盐水，配置成0.5mg/ml溶液，然后用生理盐水稀释到10μg/ml。

4.根据权利要求2或3所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，给药方式为1ml注射器腹腔注射。

5.根据权利要求1或2或3所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对减少水肿的作用。

6.根据权利要求1或2或3所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对血流改善的作用。

7.根据权利要求1或2或3所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对新生血管再生的作用。

8.根据权利要求1或2或3所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对血管内皮生长因子VEGF表达量的作用。

9.根据权利要求1或2或3所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，包括CHBP在促进超长随意皮瓣成活中对调节氧化应激的作用。

10.根据权利要求9所述的CHBP在制备促进超长随意皮瓣成活的药物中的应用，其特征在于，调节氧化应激至少包括对eNOS、HO-1、SOD1的抗氧化作用能力的调节。

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