CN112941145A - 一种包膜病毒及病原细菌的灭活试剂及其应用 - Google Patents

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CN112941145A CN202110145310.2A CN202110145310A CN112941145A CN 112941145 A CN112941145 A CN 112941145A CN 202110145310 A CN202110145310 A CN 202110145310A CN 112941145 A CN112941145 A CN 112941145A
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Abstract

本发明涉及一种包膜病毒及病原细菌的灭活试剂及其应用。本发明提供的灭活试剂所述灭活试剂主要由低碳醇、酯类化合物、表面活性剂及缓冲液组成，所述低碳醇的体积百分含量为1％‑10％，所述酯类化合物的摩尔浓度为0.5mol/L‑1.5mol/L，所述表面活性剂的体积百分含量为0.5％‑5％；优选的，所述灭活试剂还包括核酸酶抑制剂。该试剂通过破坏包膜病毒的脂质层等来达到灭活效果，作用时间短，只需要1h就可达到灭活效果，同时本发明的试剂也可用于病原细菌的灭活(白喉棒杆菌、嗜肺军团菌等)，且不会影响病原体的核酸及抗原检测，能够满足临床的多元化检测，具有良好的应用价值。

Description

一种包膜病毒及病原细菌的灭活试剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种包膜病毒及病原细菌的灭活试剂及其应用。
背景技术
临床常见呼吸道致病菌：革兰阳性菌肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、结核分枝杆菌、诺卡菌、白喉棒杆菌、炭疽杆菌等；革兰阴性菌卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、假单胞菌属细菌、嗜肺军团菌和百日咳博得特菌等。目前已证明95％急性上呼吸道疾病和大部分下呼吸道疾病是由细菌外的病原引起的，其中以呼吸道病毒最常见。
临床中常见的呼吸道病毒有：流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、2、3、呼吸道合胞病毒A型、B型等，腺病毒、冠状病毒等。其中，多种病原体具有极强的传染性，并且近年来新的致病性病毒还在不断地被发现，如SARA病毒、高致病禽流感病毒以及新型冠状病毒等，给临床检测及诊断造成了极大的困难，如何在临床样本的多元化检测过程中降低传染性病原体在实验室传播的可能性，最大程度保护实验室人员，是当下急需解决的问题。
对样本进行灭活处理，能有效减低实验室传播风险，预防控制医疗机构病原体感染，保护实验室检测人员的安全。病毒灭活是使病毒蛋白的高级结构受到破坏，不再有生理活性，失去感染、致病和繁殖能力，常规的灭活不影响病毒蛋白的一级结构，所以保持病毒的基本抗原性。免疫系统对抗原的识别分成两种，一种是构像表位，一种是线性表位。构象表位意思就是蛋白的三维结构，而线性表位就是蛋白的序列一级结构。T细胞只需要识别线性表位就能接受免疫呈递细胞给出的信号，引发免疫反应。
目前市面常见的病原体灭活方式主要由以下几种：
是通过作用于病原体脂质层/包膜、蛋白质、核酸使其达到灭活效果，如热灭活法60℃ 30min(蛋白质变性)、甲醛(交联使蛋白质变性，又可与核苷酸的氨基作用)、β-丙内酯(作用于核酸)、胍盐(蛋白质变形)、S/D法(作用于病毒包膜)等。
紫外线照射法(影响核酸检测)：影响核酸检测，UVC在照射病毒后，能与其遗传物质发生光化学反应，引起磷酸二酯键与氢键的断裂，形成嘧啶二聚体(如形成尿嘧啶环丁烷二聚体、尿嘧啶水合物、胞嘧啶水合物等)，从而导致病毒失去复制能力。紫外线需要采用200-280nm范围内的波长，253.7纳米波长的消毒灭菌效果最佳，但紫外线穿透力较差，需要直接辐照于物体表面，距离照射物不超过1米为宜；照射时间不少于半小时，消毒完毕后需要充分通风透气。
热灭活法60℃30min(蛋白质变性)：影响抗原检测。将病毒蛋白质分子内的二硫键和氢键断裂，以破坏其二级结构和三级结构。这样一来，蛋白质就会由有规则的螺旋、球状等空间结构变为无规则的伸展肽链，从而造成不可逆的失活。
甲醛(交联使蛋白质变性，又可与核苷酸的氨基作用)：甲醛作为烷化剂，与微生物的核酸和蛋白相结合，导致其基本结构的改变和破坏，影响抗原检测和核酸检测。用甲醛灭活时间长，一般需要在37-39℃处理24h以上或更长时间。并且灭活的效果易受温度、pH、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响。
胍盐(蛋白质变形)：用于变性裂解细胞，提取DNA和RNA，无DNA酶和RNA酶活性，使蛋白质变性，影响抗原检测。
β-丙内酯(作用于核酸)：作用于病原体DNA或RNA，改变病毒核酸结构达到灭活目的，而不直接作用于蛋白。β-丙内酯(BPL)直接与病毒核酸作用，而不作用于壳蛋白，不破坏病原体的免疫原性。大剂量β-丙内酯(BPL)是一种致癌物，虽极易水解为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，其水解条件为37℃水浴2h，此条件会破坏抗原，影响抗原检测。
S/D法(作用于病毒包膜)：不影响核酸和抗原检测，但是作用时间长，需要4h以上。
综上，目前市面常见的病原体灭活方式主要是通过作用于病原体脂质层/包膜、蛋白质、核酸使其达到灭活效果，如热灭活法60℃30min(蛋白质变性)、甲醛(交联使蛋白质变性，又可与核苷酸的氨基作用)、β-丙内酯(作用于核酸)、胍盐(蛋白质变形)、S/D法(作用于病毒包膜)等。这造成了新的技术问题：作用于蛋白质或核酸的灭活方式使临床样本无法做到多元化检测。
公开号为CN102151289A专利中提到，采用S/D法(聚山梨酯-80的最终浓度为1％(g/ml)，磷酸三丁酯的最终浓度为0.3％(g/ml)，将蛋白液的温度维持在24℃～26℃，保温6小时，进行病毒灭活。需要时间长，且此专利只是对S/D法的应用，只是对病毒的灭活，未有对病原细菌的灭活作用。公开号为CN105315360A专利中提到，采用S/D法(Tween80浓度为1.0％ (wt％),TNBP(磷酸三丁酯)浓度为0.3％(wt％))，在24-26℃，保温6-8小时，即可灭活病毒。需要时间长，且此专利只是对S/D法的应用，只是对病毒的灭活，未有对病原细菌的灭活作用。公开号为CN102224237A专利中虽然提到可以采用β丙内酯可以进行细菌灭活，但是β丙内酯作用于核酸，影响核酸检测。因此，现有技术要么影响核酸检测，要么影响抗原检验，要么作用时间长(4h以上)，限制了对临床样本的多元化检测。
发明内容
本发明的目的在于提供包膜病毒及病原细菌的灭活试剂。
本发明的第二个目的在于提供上述灭活抗菌试剂的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，所述灭活试剂主要由低碳醇、酯类化合物、表面活性剂及缓冲液组成。
优选的，所述低碳醇的体积百分含量为1％-10％，所述酯类化合物的摩尔浓度为0.5M-1.5M，所述表面活性剂的体积百分含量为0.5％-5％。
优选的，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液或Tricine-KOH缓冲液，其浓度为0.25-0.5mM。
优选的，所述低碳醇包括乙醇、甲醇中的至少一种；进一步优选的所述低碳醇为乙醇。
优选的，所述酯类化合物包括乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯钠盐、乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯钠盐中的至少一种。
优选的，所述表面活性剂包括曲拉通X-100、吐温中的至少一种；进一步优选的，所述吐温包括吐温-20、吐温-80中的至少一种。
优选的，所述灭活试剂还包括核酸酶抑制剂。
优选的，所述核酸酶抑制剂包括EDTA盐、柠檬酸盐中的至少一种；
优选的，所述核酸酶抑制剂的质量百分含量为0.3％-1％。
优选的，所述灭活试剂的pH值为5.5-6.5。
本发明还提供了上述的灭活试剂在包膜病毒快速灭活和/或病原细菌快速灭活方面的应用。
本发明提供了灭活试剂在含有包膜病毒和/或病原细菌的样本的抗原和核酸检测方面的应用。
当所述灭活试剂的pH值为5.5-6.5时，灭活试剂不会对抗原和核酸检测造成影响。
本发明取得的有益效果：
本发明提供了一种包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，该试剂本发明试剂通过破坏包膜病毒的脂质层等来达到灭活效果，作用时间短，只需要1h就可达到灭活效果，同时本发明试剂也可用于病原细菌的灭活(白喉棒杆菌、嗜肺军团菌等)。在产品的功能方面，绝大多数产品灭活原理是作用于病原体的核酸或蛋白，这无法满足临床1份样本多元化检测的需求；而对于作用于病毒包膜的S/D灭活法，其使用范围有限仅针对于包膜病毒，未有报道对其他病原细菌有明显效果，且其作用时间在4h以上。β丙内酯虽有报道可以灭活细菌，但是其作用于核酸，影响核酸检查。本发明提供灭活试剂处理1h即可达到灭活效果，不仅对包膜病毒具有灭活效果，对病原细菌也具有灭活效果，且不会影响病原体的核酸及抗原检测，能够满足临床的多元化检测，具有良好的应用价值。
附图说明
图1为用0.5M酯类化合物乙酸乙酯处理金黄色葡萄球菌(浓度约107)1h后与未处理对比结果图；
图2为1.5M酯类化合物乙酸乙酯处理大肠杆菌(浓度约107)1h后与未处理对比结果图；
图3为体积百分含量为10％乙醇+0.5M乙酸乙酯+体积百分含量为1％曲拉通X-100处理金黄色葡萄球菌(浓度约107)1h后与未处理对比结果图；
图4为体积百分含量为10％乙醇+0.5M乙酸乙酯+体积百分含量为1％曲拉通X-100处理大肠杆菌(浓度约107)1h后与未处理对比结果图；
图5为体积百分含量为10％乙醇+0.5M乙酸乙酯+体积百分含量为1％曲拉通X-100处理白喉棒杆菌(浓度约107)1h后与未处理对比结果图；
图6为体积百分含量为10％乙醇+0.5M乙酸乙酯+体积百分含量为1％曲拉通X-100处理嗜肺军团菌(浓度约107)1h后与未处理对比结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
不同类型的酯可以等摩尔替换。不同类型的表面活性剂可以等体积替换。
实施例中的大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌为革兰氏阳性球菌，白喉棒杆菌为革兰氏阳性杆菌，嗜肺军团菌为革兰氏阴性杆菌，百日咳博德特菌为革兰氏阴性小球杆菌，脑膜炎奈瑟菌为革兰氏阴性双球菌，上述菌为呼吸道常见病原菌。
实施例1灭活试剂1(0.5M乙酸乙酯)
实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂1，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物组成，所述酯类化合物为乙酸乙酯，余量为溶剂，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例2灭活试剂2(1.0M乙酸乙酯)
实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂2，该灭活试剂主要由1.0M酯类化合物组成，所述酯类化合物为乙酸乙酯，余量为溶剂，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例3灭活试剂3(1.5M乙酸乙酯)
实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂3，该灭活试剂主要由体积百分含量为 1.5M酯类化合物组成，所述酯类化合物为乙酸乙酯，余量为溶剂，溶剂为0.25mMTris-Hcl 缓冲液，pH值为6.0。
实施例4灭活试剂4(0.5M乙酸乙酯+1％乙醇)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂4，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物和体积百分含量为1％低碳醇组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例5灭活试剂5(0.5M乙酸乙酯+10％乙醇)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂5，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物和体积百分含量为10％低碳醇组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例6灭活试剂6(0.5M乙酸乙酯+1％乙醇+0.5％曲拉通X-100)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂6，该灭活试剂主要0.5M酯类化合物、体积百分含量为1％低碳醇和体积百分含量为0.5％表面活性剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，溶剂为 0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例7灭活试剂7(0.5M乙酸乙酯+10％乙醇+1％曲拉通X-100)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂7，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇和体积百分含量为1％表面活性剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，溶剂为 0.25mMTricine-KOH缓冲液，pH值为6.0。
实施例8灭活试剂8(1.5M乙酸乙酯+10％乙醇+5％曲拉通X-100)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂8，该灭活试剂主要由1.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇和体积百分含量为5％表面活性剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，溶剂为 0.25mMTris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例9灭活试剂9(0.5M乙酸乙酯+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂9，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例10灭活试剂10(0.5M乙酸乙酯+10％乙醇+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂10，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mMTris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例11灭活试剂11(0.5M乙酸乙酯+10％乙醇+1％曲拉通X-100+0.3％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂11，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.3％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例12灭活试剂12(0.5M乙酸乙酯+10％乙醇+1％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂12，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例13灭活试剂13(0.5M乙酸乙酯+10％乙醇+1％曲拉通X-100+1％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂13，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为1％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mMTris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例14灭活试剂14(10％乙醇+0.5M乙酰乙酸甲酯钠盐+1％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂14，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酰乙酸甲酯钠盐，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例15灭活试剂15(0.5M乙酸乙酯+1％乙醇+0.5％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂15，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为1％低碳醇、体积百分含量为0.5％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mMTris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例16灭活试剂16(1.5M乙酸乙酯+10％乙醇+5％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂16，该灭活试剂主要由1.5M乙酸乙酯、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为5％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液， pH值为6.0。
实施例17灭活试剂17(0.5M乙酸乙酯+10％乙醇+2％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂17，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为2％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为5.5。
实施例18灭活试剂18(0.5M乙酸乙酯+10％乙醇+2％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂18，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为2％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.5。
实施例19灭活试剂19(0.5M乙酰乙酸乙酯+10％乙醇+1％吐温80+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂19，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酰乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为吐温80，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液， pH值为6.0。
实施例20灭活试剂20(0.5M乙酰乙酸乙酯钠盐+10％乙醇+1％吐温20+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂20，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为10％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酰乙酸乙酯钠盐，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为吐温20，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mMTris-Hcl 缓冲液，pH值为6.0。
实施例21灭活试剂21(0.5M乙酰乙酸乙酯钠盐+0.5M乙酰乙酸乙酯+0.5M乙酸乙酯+5％乙醇+1％吐温20+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂21，该灭活试剂主要由1.5M酯类化合物、体积百分含量为5％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂；其中，所述酯类化合物包括乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯钠盐、乙酰乙酸乙酯，灭活试剂中，乙酸乙酯的摩尔浓度为0.5M，乙酰乙酸乙酯钠盐的摩尔浓度为0.5M，乙酰乙酸乙酯的摩尔浓度为0.5M；所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为吐温20，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例22灭活试剂22(0.5M乙酰乙酸甲酯钠盐+0.5M乙酰乙酸乙酯+0.5M乙酸乙酯+5％乙醇+1％吐温80+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂22，该灭活试剂主要由1.5M酯类化合物、体积百分含量为5％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物包括乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯钠盐、乙酰乙酸乙酯，灭活试剂中，乙酸乙酯的摩尔浓度为0.5M，乙酰乙酸乙酯钠盐的摩尔浓度为0.5M，乙酰乙酸乙酯的摩尔浓度为0.5M；所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为吐温80，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例23灭活试剂23(0.5M乙酰乙酸乙酯+0.5M乙酸乙酯+5％乙醇+1％曲拉通 X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂23，该灭活试剂主要由1.0M酯类化合物、体积百分含量为5％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物包括乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯，灭活试剂中，乙酸乙酯的摩尔浓度为0.5M，乙酰乙酸乙酯的摩尔浓度为0.5M；所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mMTris-Hcl 缓冲液，pH值为6.0。
实施例24灭活试剂24(0.5M乙酸乙酯+5％甲醇+1％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂24，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为5％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为甲醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
实施例25灭活试剂25(0.5M乙酸乙酯+5％乙醇+1％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂25，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为5％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为0.5％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂为EDTA-2Na，溶剂为0.25mMTricine-KOH 缓冲液，pH值为6.0。
实施例26灭活试剂26(0.5M乙酸乙酯+5％乙醇+1％曲拉通X-100+0.5％EDTA·2Na+0.5％柠檬酸钠)
该实施例提供了包膜病毒及病原细菌的灭活试剂26，该灭活试剂主要由0.5M酯类化合物、体积百分含量为5％低碳醇、体积百分含量为1％表面活性剂和质量百分含量为1.0％核酸酶抑制剂组成，余量为溶剂，其中，所述酯类化合物为乙酸乙酯，所述低碳醇为乙醇，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述核酸酶抑制剂包括EDTA-2Na和柠檬酸钠，灭活试剂中， EDTA-2Na的质量百分含量为0.5％，柠檬酸钠的质量百分含量为0.5％，溶剂为0.25mM Tris-Hcl缓冲液，pH值为6.0。
试验例1灭活试剂1-26处理病原细菌
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、白喉棒杆菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特菌、脑膜炎奈瑟氏菌(浓度约108)与灭活试剂1-26以1:10的比例混合，于室温放置处理1h后，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、白喉棒杆菌取100μL加入血琼脂平板涂布，脑膜炎奈瑟氏菌取100μL加入巧克力平板涂布，于35-37摄氏度，5％-10％CO2培养24-48h 后观察结果；嗜肺军团菌取50μL加入军团菌平板涂布，于35-37摄氏度，5％-10％CO2培养 72-96h后观察结果；百日咳博德特菌取100μL加入血琼脂平板涂布，于35-37摄氏度， 5％-10％CO2培养72-96h后观察结果；结果见下表：
Figure BDA0002929834230000091
Figure BDA0002929834230000101
Figure BDA0002929834230000111
Figure BDA0002929834230000121
Figure BDA0002929834230000131
Figure BDA0002929834230000141
Figure BDA0002929834230000151
其中，用实施例1提供的灭活试剂1(0.5M酯类化合物乙酸乙酯)处理金黄色葡萄球菌 (浓度约107)1h后与未处理对比结果如图1所示；实施例3提供的灭活试剂3(1.5M酯类化合物乙酸乙酯)处理大肠杆菌(浓度约107)1h后与未处理对比结果如图2所示；以实施例7提供的灭活试剂7(体积百分含量为10％乙醇+0.5M乙酸乙酯+体积百分含量为1％曲拉通X-100)为代表，采用灭活试剂7分别处理金黄色葡萄球菌(浓度约107)、大肠杆菌(浓度约107)、白喉棒杆菌(浓度约107)、嗜肺军团菌(浓度约107)1h后，与未处理对比结果如图3-6所示。
由以上数据可知，酯类可以对不同细菌有杀灭作用，且浓度越高对菌的抑制能力较强。酯类和醇搭配使用效果较好，酯类、醇类和表面活性剂联合使用效果更好。不同酯类可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。不同表面活性剂可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。不同醇类可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。缓冲液主要起缓冲作用，稳定pH值，可以采用本领域常用缓冲液进行替换，例如PBS 缓冲液、Tris-Hcl和Tricine-KOH缓冲液。
试验例2灭活试剂1-26处理病原体后测抗原
将病原体甲型流感病毒、合胞病毒、肺炎链球菌与灭活试剂1-26以1:10的比例混合，于室温放置处理1h后，取100μL处理后的样本加入反应杯中，用安图生物化学发光仪A2000Plus上机检测(方法是双抗体夹心测抗原，反应模式是一步法15分钟，加样模式：20uL磁珠包被抗体+50uL样本+100uL酶标抗体)，检测结果几乎无影响，发光值结果见下表：
Figure BDA0002929834230000161
Figure BDA0002929834230000171
Figure BDA0002929834230000181
Figure BDA0002929834230000191
由以上数据可知，针对抗原检测不同酯类可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。不同表面活性剂可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。不同醇类可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。缓冲液主要起缓冲作用，稳定pH 值，可以采用本领域常用缓冲液进行替换，例如PBS缓冲液、Tris-Hcl和Tricine-KOH缓冲液。
试验例3灭活试剂9-26处理病毒
将灭活病毒乙型流感病毒、合胞病毒、副流感病毒、新型冠状病毒假病毒用灭活试剂9-26 于室温放置处理1h后，取0.6mL样本用磁珠法核酸提取试剂盒提取核酸，用安图生物病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对核酸进行检测，检测结果几乎无影响，CT值结果见下表：
Figure BDA0002929834230000192
Figure BDA0002929834230000201
Figure BDA0002929834230000211
由以上数据可知，针对核酸检测不同酯类可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。不同表面活性剂可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。不同醇类可以等量替换，结果无明显差异，可以达到同样的效果。缓冲液主要起缓冲作用，稳定pH 值，可以采用本领域常用缓冲液进行替换，例如PBS缓冲液、Tris-Hcl和Tricine-KOH缓冲液。
试验例4灭活试剂14处理合胞病毒
将合胞病毒与灭活试剂14以1:10的比例混合，于室温放置处理1h后，将灭活后的病毒、阳性对照、30000r离心30min，弃上清，补充等量的细胞培养基混匀，混匀后以1:5接入Hep-2 细胞培养，设立阴性对照，即未接毒细胞，培养24h后更换细胞培养基，继续培养至一周后用ELISA法检测细胞培养液中抗原含量，再盲传一代，培养至一周后用ELISA法检测细胞培养液中抗原含量，通过细胞培养液中抗原含量来反应灭活效果。
ELISA法检测合胞病毒抗原效价方法步骤如下：
物料准备：取酶免板、酶标抗体、RSV-IgM抗原稀释液、标准抗原、待测抗原等，室温放置30min。
加抗原：分别设阳性孔(标准抗原)、待测样品孔，取待检抗原100ul/孔加至板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟，形成抗体-抗原复合物。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加200ul洗涤液(PBST)，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
加酶标抗体：取酶标记抗体100ul/孔加至板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加200ul洗涤液(PBST)，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
显色：每孔先加入底物液50μl，再加入显色液50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 分钟。
终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
测定：打开PHOMO仪器，以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
检测灭火后一代及盲传一代后细胞培养液中抗原含量，结果如下表：
Figure BDA0002929834230000221
Figure BDA0002929834230000231
由上表可知，实验组检测结果与阴性对照基本一致，均远低于阳性对照组，可认为灭活剂14对RSV病毒有灭活作用。
试验例5灭活试剂7处理合胞病毒
将合胞病毒与灭活试剂7以1:10的比例混合，设立阳性对照(即病毒原液与稀释液以1:10 比例混合)，于室温放置处理1h后，将灭活后的病毒、阳性对照、30000r离心30min，弃上清，补充等量的细胞培养基混匀，混匀后以1:5接入Hep-2细胞培养，设立阴性对照，即未接毒细胞，培养24h后更换细胞培养基，继续培养至一周后用ELISA法检测细胞培养液中抗原含量，再盲传一代，培养至一周后用ELISA法检测细胞培养液中抗原含量，通过细胞培养液中抗原含量来反应灭活效果。
Figure BDA0002929834230000232
由上表可知，实验组检测结果与阴性对照基本一致，均远低于阳性对照组，可认为灭活剂7对RSV病毒有灭活作用。

Claims (12)

1.一种包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述灭活试剂主要由低碳醇、酯类化合物、表面活性剂及缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述低碳醇的体积百分含量为1％-10％，所述酯类化合物的摩尔浓度为0.5M-1.5M，所述表面活性剂的体积百分含量为0.5％-5％。
3.根据权利要求1所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液或Tricine-KOH缓冲液，所述缓冲液浓度为0.25-0.5mM。
4.根据权利要求1所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述低碳醇包括乙醇、甲醇中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述酯类化合物包括乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯钠盐、乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯钠盐中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述表面活性剂包括曲拉通X-100、吐温中的至少一种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述灭活试剂还包括核酸酶抑制剂。
8.根据权利要求7所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述核酸酶抑制剂包括EDTA盐、柠檬酸盐中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述核酸酶抑制剂的质量百分含量为0.3％-1％。
10.根据权利要求1-6任一项、权利要求8或权利要求9所述的包膜病毒及病原细菌的灭活试剂，其特征在于，所述灭活试剂的pH值为5.5-6.5。
11.权利要求10所述的灭活试剂在含有包膜病毒和/或病原细菌的样本的抗原和核酸检测方面的应用。
12.权利要求1-10任一项所述的灭活试剂在包膜病毒快速灭活和/或病原细菌快速灭活方面的应用。
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