CN112940959A - 一株可降解柠檬烯的克雷伯杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可降解柠檬烯的克雷伯杆菌（Klebsiellasp.）及其应用，所述菌株的保藏号为CCTCC NO:M2020509，该菌株可以将柠檬烯转化生成天然香料反式二氢香芹酮，同时经发酵条件优化，并在培养基中添加Fe²⁺、乙醇可显著提高二氢香芹酮的产量，高达1057.7 mg/L。本发明首次报道了克雷伯杆菌对柠檬烯的降解作用，能够提高底物原材料的利用率，创造更高的经济价值和社会效益。

Description

一株可降解柠檬烯的克雷伯杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株可降解柠檬烯的克雷伯杆菌(Klebsiella sp.)，本发明还涉及该菌株在微生物转化生产天然香料反式二氢香芹酮中的应用。

背景技术

柠檬烯是一种重要的功能性单萜，广泛存在于柑橘类水果表皮当中，因此柠檬烯产量高、价格较低。但柠檬烯的香气较弱，且对人体皮肤具有一定的刺激性，导致其在香精香料中的使用受到一定影响，不能满足市场需求。柠檬烯的氧化产物二氢香芹酮，由于其独特的芳香气味和生理功能，是更为理想的香精香料来源。

二氢香芹酮，分子式C₁₀H₁₆O，是莳萝油、香菜籽、薄荷精油的主要成分。它是两种异构体(1R,4R)-(+)-和(1S,4R)-(+)-二氢香芹酮的混合物，可以通过香芹酮加氢或柠檬烯氧化得到。二氢香芹酮可以作为合成砌块合成复杂的天然产物，比如keto decalin衍生物、tetraoxane衍生物、萜类化合物罗汉柏烯等。此外，二氢香芹酮对细菌和真菌都有一定的抑制作用，并且还有良好的驱虫性能，具备被开发为植物源卫生害虫防控剂的潜力。最后，二氢香芹酮还可以用于制备透皮促进剂。

天然的香精香料因受地理环境、物种、气候资源等因素的限制，发展有一定的局限性。而人工合成的香精香料或多或少受到一些潜在的化学因素的制约，影响到消费者的心理。因此微生物转化生成香精香料已经成为研究的热点。

目前，市面上的有关微生物转化的高产菌株的种类很少，因此高产菌种的筛选、驯化及其发酵工艺流程的探究，对于风味萜烯的大批量工业化生产具有重大的意义。

发明内容

为了突破现有技术以化学合成法生产反式二氢香芹酮的技术瓶颈，本发明提供一株可降解柠檬烯的克雷伯杆菌及其应用，以柠檬烯为底物转化生成反式二氢香芹酮，同时还优化了生产条件，可有效提高底物原材料的利用率，创造更高的经济价值和社会效益。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

以新鲜和腐烂的赣南脐橙、安岳柠檬、琯溪蜜柚、宫川蜜桔的表皮以及采自柑橘加工厂垃圾堆附近的土壤、果园土壤和油田土壤为原料进行可降解柠檬烯菌株的分离和筛选，得到一株能够以柠檬烯作为唯一碳源生长的菌株，通过16S rDNA鉴定，确认该菌株为克雷伯杆菌(Klebsiella sp.)，将其分类命名为Klebsiella sp.O852，并于2020年9月17日保藏于位于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:M 2020509。

克雷伯杆菌(Klebsiella sp.)O852以柠檬烯为底物，将柠檬烯转化为反式二氢香芹酮，因此该菌株可用于微生物法生产天然香料反式二氢香芹酮。

进一步地，在培养基中添加Fe²⁺能够明显增加反式二氢香芹酮的产量，Fe²⁺的优选浓度为0.4g/L。

进一步地，在培养基中添加乙醇对柠檬烯的生物转化有明显的促进作用，乙醇的优选浓度为0.8％(v/v)。

进一步地，克雷伯杆菌(Klebsiella sp.)O852在转化生产反式二氢香芹酮中的的优选条件是添加0.4g/L Fe²⁺以及0.8％(v/v)乙醇，柠檬烯的浓度为1680mg/L，36℃，转速为150r/min，此时反式二氢香芹酮含量达到最大值，为1057.7mg/L。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明首次报道了Klebsiella sp.O852对柠檬烯的降解作用，可以将柠檬烯转化生成天然香料反式二氢香芹酮。该产物不仅具有留兰香的香气，用于食品和化妆品领域，还具有抗菌、抗炎等生物学活性，用于农业、医药、化工等领域。

(2)本发明采用微生物法生产反式二氢香芹酮，具有高度专一性、反应条件温和、反应速率快、收率高、成本低及反应步骤少等特点。

(3)本发明的方法包括微生物转化菌株的筛选和鉴定，研究培养基成分、培养时间、转化时间、底物浓度、共溶剂的种类和浓度、培养条件对反式二氢香芹酮产量的影响，优化了最佳转化工艺参数。

(4)本发明是以柠檬烯为底物进行微生物转化，柠檬烯是一种重要的功能性单萜，广泛存在于柑橘类水果表皮中，每年柑橘加工业会产生约50000吨副产物柠檬烯。因此，本发明为避免大量柑橘类水果囤积导致果实腐烂浪费引起经济损失提供一种简单可行的思路，提高原料的利用率，创造更高的经济价值和社会效益。

附图说明

图1为添加1％柠檬烯对M9培养基中菌株生长的影响

图2 O852菌株和其他菌株之间关系的系统进化树

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但不以任何形式限制本发明。

实施例1菌株的筛选与鉴定

(1)以新鲜和腐烂的赣南脐橙、安岳柠檬、琯溪蜜柚、宫川蜜桔的表皮以及采自柑橘加工厂垃圾堆附近的土壤、果园土壤和油田土壤为原料进行菌株的分离和筛选。取样品10g置入90g生理盐水中，放入30℃、150r/min条件下的恒温培养摇床中振荡15-20min。

(2)抗0.1％柠檬烯菌株的筛选：取0.5mL(1)中的液体置入装有50mL YM培养基的锥形瓶中，同时加入50μL柠檬烯(0.1％v/v，柠檬烯用已灭菌处理的0.22μm滤膜过滤除菌)。30℃，150r/min，培养2～7d之后，取出进行浓度梯度稀释至10^-7浓度，涂布于YM固体培养基上，30℃培养直至菌落完全生长。共得到菌种921株。

(3)抗2％柠檬烯菌株的筛选：将(2)中得到的菌株进行活化培养。然后取50μL活化好的菌液接种于装有5mL YM培养基的锥形瓶中，再加入100μL柠檬烯(2％v/v)，30℃，150r/min，培养2～7d之后，取出进行浓度梯度稀释至10^-7浓度，涂布于YM固体培养基上，30℃培养直至菌落完全生长。共得到菌种494株。

(4)利用柠檬烯作为唯一碳源生长的菌株的筛选：将(3)中得到的菌株进行活化培养。取1mL活化好的菌液接种于装有100mL YM培养基的锥形瓶中，30℃，150r/min，过夜培养。5500r/min离心20min收集菌体，并用0.85％生理盐水洗涤三次以充分去除培养基。最后将菌体重悬于50mL M9培养基中，并且加入500μL柠檬烯(1％v/v)，控制初始OD₆₀₀＝0.2，培养条件为30℃，150r/min。每隔12h测定OD₆₀₀以确定微生物是否生长，共得到菌种2株，分别为O852和O97。

(5)菌株鉴定：将(4)中得到的菌株O852和O97进行活化培养，并提取DNA，进行16SrDNA和ITS测序，结果显示，菌株O852经过16S r DNA引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：TACGG(C/T)ACCTTGTTACGACTT)扩增之后，得到约1400bp左右的PCR片段，而经过ITS引物(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增之后，没有得到扩增片段。菌株O97经过ITS引物扩增之后，得到约600bp左右的PCR片段，而经过16S r DNA引物扩增之后，没有得到扩增片段。将测序结果在NCBI网站上进行比对分析，结果显示O852为克雷白杆菌Klebsiella sp.，O97为德巴利酵母Debaryomyces sp.。

(6)柠檬烯微生物转化实验：将菌株O852和O97过夜活化，1％(v/v)接种在培养基中培养，培养条件为30℃，150r/min。其中对于菌株O852，使用LB培养基培养至4h左右，添加0.1％(v/v)柠檬烯进行生物转化；对于菌株O97，使用YM培养基培养至36h左右，添加0.1％(v/v)柠檬烯进行生物转化。使用SPME-GC-MS测定转化时间为24h、48h、72h的转化产物。同时设置空培养基作为对照。实验结果显示(表1)：菌株O852的柠檬烯微生物转化产物为反式二氢香芹酮、柠檬烯-1,2-环氧化合物、香芹酮、γ-萜品烯和p-menth-1-en-9-al。其中反式二氢香芹酮是主要的转化产物，在转化时间为24h时含量达到62.86mg/L。Debaryomycessp.O97生物转化柠檬烯的产物有γ-萜品烯、trans-香芹醇、香芹酮、紫苏醇和柠檬烯-1,2-环氧化合物。

(7)SPME-GC-MS测定转化产物：取5mL反应后的菌液移入30mL萃取瓶中，同时添加1.8g NaCl和100μL环己酮(环己酮被无水乙醇稀释1000倍，浓度为0.946mg/mL)，于磁力搅拌器上40℃加热平衡15min后，插入己活化好的50/30pm DVB/CAR/PDMS的SPME萃取头(250℃活化15min)，推出纤维头，顶空吸附40min，插入GC-MS进样口解析5min。Agilent 6890N型气相色谱仪，气相色谱条件：毛细管柱为HP-5(30m×320μm×0.25μm)，程序升温，起始温度40℃，保持3min，以3℃/min升至160℃，保持2min，再以8℃/min升至220℃，保持3min。进样口温度250℃，检测器温度：FID250℃。Agilent 5975B质谱仪，质谱条件：离子源温度230℃，四极杆温度150℃，离子化方式EI，电子能量70eV，质量范围为45-550AMU/sec。定性分析：采用GC-MS连用仪进行分析鉴定，分析结果运用计算机谱(NIST05/WILE7.0)和标准物质进行初步检索和分析。定量分析：环己酮作为内标进行定量分析，计算公式为：

表1 Klebsiella sp.O852和Debaryomyces sp.O97在不同转化时间的转化产物分析

n.d.表示没检出；a表示与标准物质的保留指数进行比较分析；b表示运用质谱图以及计算机谱(NIST05/WILE7.0)进行初步检索；RI,保留指数，使用正构烷烃(C7-C30)作为标准物质来计算保留指数；数据表示为平均值±标准差。

实施例2克雷伯杆菌(Klebsiella sp.)O852转化生产反式二氢香芹酮的方法及条件优化

1.不同重金属离子对反式二氢香芹酮产量的影响

采用添加不同种类金属离子(Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺和Mg²⁺，0.4g/L)的LB培养基，按1％(v/v)的接种量培养Klebsiella sp.O852至4h，然后加入840mg/L柠檬烯转化24h，转速150r/min，温度30℃，得到反式二氢香芹酮的混合溶液。实验结果显示添加Fe²⁺能够明显的增加反式二氢香芹酮的产量，达到229.66mg/L。

2.培养时间及底物浓度对反式二氢香芹酮产量的影响

采用LB-M培养基(在LB培养基中添加0.4g/L Fe²⁺)，按1％(v/v)的接种量培养Klebsiella sp.O852至不同时间(4h、8h、12h、16h、20h和24h)，然后加入不同浓度的柠檬烯(168mg/L、420mg/L、840mg/L、1680mg/L和2520mg/L)转化不同时间(12h、24h、36h和48h)，转速150r/min，温度30℃，得到反式二氢香芹酮的混合溶液。实验结果显示培养时间为4h，底物浓度为1680mg/L，转化时间为36h时，反式二氢香芹酮的产量最大，达到758.5mg/L。

3.共溶剂对反式二氢香芹酮产量的影响

采用LB-M培养基，按1％(v/v)的接种量培养Klebsiella sp.O852至4h，然后添加柠檬烯-共溶剂混合溶液进行生物转化，柠檬烯终浓度为1680mg/L，共溶剂的终浓度为0.8％(v/v)，共溶剂的种类分别为甲醇、乙醇、乙二醇、丙酮、甘油、乙酸乙酯和二甲基亚砜，转化时间为36h，转速150r/min，温度30℃，得到反式二氢香芹酮的混合溶液。实验结果显示乙醇对柠檬烯的生物转化有明显的促进作用。采用LB-M培养基，按1％(v/v)的接种量培养Klebsiella sp.O852至4h，然后分别添加柠檬烯-乙醇混合溶液(柠檬烯终浓度为1680mg/L)进行生物转化，乙醇的终浓度分别为0.2％、0.6％、0.8％、1.2％、1.6％、2.0％(v/v)，转化时间为36h，转速150r/min，温度30℃，得到反式二氢香芹酮的混合溶液。实验结果显示乙醇的终浓度为0.8％(v/v)时，反式二氢香芹酮含量达到最大值，为919.04mg/L。

4.其它条件对反式二氢香芹酮产量的影响

采用LB-M培养基，在不同温度(24℃、28℃、30℃、36℃和40℃)和不同转速(100r/min、150r/min、200r/min、250r/min和300r/min)的条件下进行实验，按1％(v/v)的接种量培养Klebsiella sp.O852至4h，然后添加柠檬烯-乙醇混合溶液进行生物转化，柠檬烯终浓度为1680mg/L，乙醇的终浓度为0.8％(v/v)，转化时间为36h，得到反式二氢香芹酮的混合溶液。实验结果显示当转化的温度为36℃、转速为150r/min时，反式二氢香芹酮含量达到最大值，为1057.7mg/L。

Claims (6)

1.一株可降解柠檬烯的克雷伯杆菌（Klebsiellasp.）O852，其特征在于，保藏号为CCTCC NO: M 2020509。

2.权利要求1所述的克雷伯杆菌（Klebsiellasp.）O852在转化生产天然香料反式二氢香芹酮中的应用，其特征在于，以柠檬烯为底物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在培养基中添加Fe²⁺。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，在培养基中添加乙醇。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，Fe²⁺的浓度为0.4 g/L。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，乙醇的体积百分比为0.8%。

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