CN112940091B

CN112940091B - 一种重组烟曲霉抗原蛋白及其应用

Info

Publication number: CN112940091B
Application number: CN202110158187.8A
Authority: CN
Inventors: 刘春龙; 翟栓柱; 付成华; 阮旭琴; 周泽奇; 粟艳
Original assignee: Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Current assignee: Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112940091A

Abstract

本发明提供了一种重组烟曲霉抗原蛋白及其应用，所述重组烟曲霉抗原蛋白包括烟曲霉抗原Asp f1肽段、Asp f2肽段、Asp f3肽段、Asp f4肽段或Asp f6肽段的部分和/或全部氨基酸中的任意一种或至少两种的组合。本发明还提供了一种抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒及其制备方法。本发明所述重组烟曲霉抗原蛋白具有烟曲霉多个蛋白的特异性抗体结合位点，灵敏度高，特异性好；制备得到的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒可以用于相关的检测中，耗时短，准确率高，平行性好，并且可以实现批量样本的自动化检测，排除了样本及人为操作对检测结果的影响，具有广阔的应用前景。

Description

一种重组烟曲霉抗原蛋白及其应用

技术领域

本发明属于抗体检测技术领域，尤其涉及一种重组烟曲霉抗原蛋白及其应用。

背景技术

变应性支气管肺曲霉病(Allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)是烟曲霉致敏引起的一种变应性肺部疾病，临床表现为慢性支气管哮喘和反复出现的肺部阴影。研究显示ABPA在哮喘中所占比例为1.0％～3.5％，ABPA患者在连续就诊的哮喘患者中约占2.5％。除哮喘外，ABPA还可见于其他疾病，以肺囊性纤维化并发ABPA相对多见，病例汇总后患病率约为8.9％。

ABPA是一种对曲霉菌的超敏反应，在具有正常免疫能力个体的支气管被烟曲霉菌定植时发生，真菌孢子成分会导致IgE和IgG抗体形成。患者通常表现为支气管阻塞、气道炎症和黏液嵌塞，并可导致支气管扩张、纤维化和其他呼吸系统损害等病症，通常被诊断为过敏症、哮喘或囊性纤维化。对ABPA进行快速准确的诊断有利于疾病的控制与治疗。CN110616258A公开了一种用于检测rs4077515多态性位点的物质在评价或辅助评价ABPA中的应用，通过对ABPA患者的CARD9^S12N位点进行检测，分析其等位基因位点上A所占的百分比，进而评价或辅助评价待测个体患ABPA的可能性。然而这种方法仅适合应用于ABPA发病机理的相关研究中，可用于潜在患者的筛查与疾病预防中，并不适合应用于实际的临床检测中。

ABPA的误诊率较高，不及时治疗容易导致肺纤维化。因此，如何提供一种ABPA准确、快速的检测方法，为相关的诊断与治疗提供依据，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种重组烟曲霉抗原蛋白及其应用，所述重组烟曲霉抗原蛋白可以与相应的抗体特异性结合，提高了相关检测的敏感性和特异性；所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒准确性高，平行性好，具有广阔的应用前景。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种重组烟曲霉抗原蛋白，所述重组烟曲霉抗原蛋白包括烟曲霉抗原Asp f1肽段、Asp f2肽段、Asp f3肽段、Asp f4肽段或Asp f6肽段的部分和/或全部氨基酸中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，所述Asp f1、Asp f2、Asp f3、Asp f4和Asp f6为烟曲霉的特异性蛋白，每个肽段均具有5～9个抗体的特异性结合位点，还通过形成二硫键以及形成线性和构象结合位点等结构，进一步提高了与IgE结合的灵敏性与特异性，提高了相关检测的准确性。

优选地，所述Asp f1肽段包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

优选地，所述Asp f2肽段包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

优选地，所述Asp f3肽段包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

优选地，所述Asp f4肽段包括SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

优选地，所述Asp f6肽段包括SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.1：

MVAIKNLFLLAATAVSVLAAPSPLDARATWTCINQQLNPKTNKWEDKRLLYNQAKAESNSHHAPLSDGKTGSSYPHWFTNGYDGNGKLIKGRTPIKFGKADCDRPPKHSQNGMGKDDHYLLEFPTFPDGHDYKFDSKKPKEDPGPARVIYTYPNKVFCGIVAHQQGNQGDLRLCSH。

SEQ ID No.2：

MAALLRLAVLLPLAAPLVATLPTSPVPIAARATPHEPVFFSWDAGAVTSFPIHSSCNATQRRQIEAGLNEAVELARHAKAHILRWGNESEIYRKYFGNRPTMEAVGAYDVIVNGDKANVLFRCDNPDGNCALEGWGGHWRGANATSETVICDRSYTTRRWLVSMCSQGYTVAGSETNTFWASDLMHRLYHVPAVGQGWVDHFADGYDEVIALAKSNGTESTHDSEALQYFALEAYAFDIAAPGVGCAGESHGPDQGHDTGSASAPASTSTSSSSSGSGSGATTTPTDSPSATIDVPPVRTVRIS。

SEQ ID No.3：

MSGLKAGDSFPSDVVFSYIPWSEDKGEITACGIPINYNASKEWADKKVILFALPGAFTPVCSARHVPEYIEKLPEIRAKGVDVVAVLAYNDAYVMSAWGKANQVTGDDILFLSDPDARFSKSIGWADEEGRTKRYALVIDHGKITYAALEPAKNHLEFSSAETVLKHL。

SEQ ID No.4：

MQLKNSMLLLTALAAGSSVARLHGHERRHLHHAGEKREVGDTVYATINGVLVSWINEWSGEAKTSDAPVSQATPVSNAVAAAAAASTPEPSSSHSDSSSSSGVSADWTNTPAEGEYCTDGFGGRTEPSGSGIFYKGNVGKPWGSNIIEVSPENAKKYKHVAQFVGSDTDPWTVVFWNKIGPDGGLTGWYGNSALTLHLEAGETKYVAFDENSQGAWGAAKGDELPKDQFGGYSCTWGEFDFDSKINQGWSGWDVSAIQAENAHHEVQGMKICNHAGELCSIISHGLSKVIDAYTADLAGVDGIGGKVVPGPTRLVVNLDYKE。

SEQ ID No.5：

GTSPIQTPINTMSQQYTLPPLPYPYDALQPYISQQIMELHHKKHHQTYVNGLNAALEAQKKAAEATDVPKLVSVQQAIKFNGGGHINHSLFWKNLAPEKSGGGKIDQAPVLKAAIEQRWGSFDKFKDAFNTTLLGIQGSGWGWLVTDGPKGKLDITTTHDQDPVTGAAPVFGVDMWEHAYYLQYLNDKASYAKGIWNVINWAEAENRYIAGDKGGHPFMKL。

优选地，所述重组烟曲霉抗原蛋白包括烟曲霉抗原的Asp f1肽段、Asp f2肽段、Asp f3肽段、Asp f4肽段和Asp f6肽段的部分和/或全部氨基酸。

优选地，所述重组烟曲霉抗原蛋白包括SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。

SEQ ID No.6：

MVAIKNLFLLAATAVSVLAAPSPLDARATWTCINQQLNPKTNKWEDKRLLYNQAKAMAALLRLAVLLPLAAPLVATLPTSPVPIAARATPHEPVFFSWDAGAVTSFPIHSSCNAVELARHAKAHILRWGNESEIYRKYFGNRPTMEAVGAYDVIVNGDKANVLFRCDNPDGNCALEGWGGHWRGANATSETVICDRSMSGLKAGDSFPSDVVFSYIPWSEDKGEITACGIPINYNASKEWVIDHGKITYAALEPAKNHLEFSSAETVLKHLMQLKNSMLLLTALAAGSSVARLHGHERRHLHHAGEKREVGDTVYATINGVLVSWINEWSGEAKTSDAPVSQATPVSNAVAAAAAASTPEPSSSHSDSSSSSGQAENAHHEVQGMKICNHAGELCSIISHGLSKVIDAYTADLAGVDGIGGKVVPGPTRLVVNLDYKELQYLNDKASYAKGIWNVINWAEAENRYIAGDKGGHPFMKL。

本发明中，通过将Asp f1、Asp f2、Asp f3、Asp f4和Asp f6中与IgE结合的优势表位进行重组，得到了SEQ ID No.6所示的重组烟曲霉抗原蛋白，其与IgE抗体的结合能力显著增加，显著提高了检测的灵敏性与特异性；此外，由于其具有多个烟曲霉蛋白的抗体结合位点，在相关的检测实验中可以选择使用一种抗原来替代使用多种抗原的组合物，克服了抗原种类较多对检测结果的不利影响，实现了检测的标准化与流程化，为大批量样本的检测创造了条件，具有广阔的应用前景。

第二方面，本发明提供了一种抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒包括第一方面所述的重组烟曲霉抗原蛋白。

本发明中，所述重组烟曲霉抗原蛋白可以与抗烟曲霉的IgE抗体特异性结合，可以用于IgE抗体的相关检测中，二者的结合特异性好，灵敏度高，准确度高，所需的时间也较短，为相关的诊断与治疗提供了依据，具有广泛的应用价值。

优选地，所述重组烟曲霉抗原蛋白包括生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白。

优选地，所述生物素包括N-羟基磺酸基琥珀生物素。

优选地，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒还包括磁微粒和/或抗IgE抗体。

优选地，所述磁微粒包括链霉亲和素标记磁微粒。

本发明中，通过向待测样本中加入亲和素标记磁微粒，可以吸附样本中的生物素，并通过磁分离去除磁微粒，进而消除了样本中的生物素对化学发光试剂的干扰，提高了检测的准确度。

优选地，所述抗IgE抗体包括吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体。

本发明中，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的工作原理如下：将待测样本与链霉亲和素标记磁微粒孵育，磁分离去除样本中的生物素；再向样本中加入生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白和吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体，共同孵育，样本中的IgE抗体同时与生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白和吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体结合，形成抗原抗体夹心复合物；再加入链霉亲和素标记磁微粒，孵育，复合物通过重组烟曲霉抗原蛋白上的生物素与链霉亲和素标记磁微粒结合，去除未与磁微粒结合的物质；再通过激发吖啶磺酰胺发光，根据是否发光以及发光的强度进行判断，检测准确性高，检测限度低，耗时也较短。

优选地，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒还包括校准品。

优选地，所述校准品包括低值校准品和/或高值校准品。

优选地，所述低值校准品包括人源抗烟曲霉的IgE抗体，浓度为0.2～0.8IU/mL，例如可以是0.2IU/mL、0.3IU/mL、0.4IU/mL、0.5IU/mL、0.6IU/mL、0.7IU/mL或0.8IU/mL。

优选地，所述高值校准品包括人源抗烟曲霉的IgE抗体，浓度为25～35IU/mL，例如可以是25IU/mL、26IU/mL、27IU/mL、28IU/mL、29IU/mL、30IU/mL、31IU/mL、32IU/mL、33IU/mL、34IU/mL或35IU/mL。

优选地，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒还包括清洗液、激发液、样本稀释液或质控品中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是清洗液或激发液与质控品的组合。

第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白和吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体的步骤。

本发明中，通过使用生物素对重组烟曲霉抗原蛋白进行标记，可以与链霉亲和素标记磁微粒结合进而分离出抗原抗体夹心复合物；通过使用吖啶磺酰胺对抗IgE抗体进行标记，可以与激发液反应发光，作为检测信号。通过上述组分的相互配合，共同应用于抗烟曲霉的IgE抗体的检测中。

优选地，所述生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白包括生物素标记和透析的步骤。

优选地，所述标记前还包括将所述生物素和重组烟曲霉抗原蛋白配制成生物素溶液和重组烟曲霉抗原蛋白溶液的过程。

优选地，所述生物素溶液的浓度为0.2～1μg/mL，例如可以是0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1μg/mL，优选为0.5μg/mL。

优选地，所述重组烟曲霉抗原蛋白溶液的浓度为0.8～1.2μg/mL，例如可以是0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.1μg/mL或1.2μg/mL，优选为1μg/mL。

优选地，所述生物素溶液与重组烟曲霉抗原蛋白溶液的体积比为1:(45～55)，例如可以是1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54或1:55，优选为1:50。

优选地，所述重组烟曲霉抗原蛋白溶液的溶剂包括PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为0.01～0.03M，例如可以是0.01M、0.02M或0.03M，优选为0.02M。

优选地，所述标记在避光条件下进行。

优选地，所述标记的时间为1.5～2.5h，例如可以是1.5h、2h或2.5h，优选为2h。

优选地，所述透析使用的液体包括PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为0.01～0.03M，例如可以是0.01M、0.02M或0.03M，优选为0.02M。

优选地，所述透析的过程中对透析使用的液体进行搅拌，所述搅拌包括磁力搅拌器搅拌。

优选地，所述透析在2～8℃下进行，温度例如可以是2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃、5.5℃、6℃、6.5℃、7℃、7.5℃或8℃。

优选地，所述透析的时间为8～12h，例如可以是8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h或12h。

优选地，所述透析的过程中换液5～8次，换液的次数例如可以是5次、6次、7次或8次，所述换液的间隔时间为2～3h，例如可以是2h、2.5h或3h。

优选地，所述换液的体积为0.8～1.2L，例如可以是0.8L、0.9L、1L、1.1L或1.2L，优选为1L。

优选地，所述透析后还包括对透析产物进行保存的步骤。

优选地，所述透析产物保存在甘油溶液中，所述甘油溶液的浓度为18％～25％，例如可以是18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％，优选为20％。

优选地，所述保存在密封避光条件下进行，所述保存的温度不高于-20℃，例如可以是-20℃、-21℃、-22℃、-23℃、-24℃或-25℃。

优选地，所述保存前还包括对透析产物进行定量的步骤。

优选地，所述生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白包括以下步骤：

(1)使用浓度为0.01～0.03M的PBS溶液配制重组烟曲霉抗原蛋白溶液，将浓度为0.2～1μg/mL的生物素溶液与浓度为0.8～1.2μg/mL的重组烟曲霉抗原蛋白溶液按体积比为1:(45～55)混合，在避光条件下标记1.5～2.5h，得到标记产物；

(2)将所得标记产物装入透析袋中，使用浓度为0.01～0.03M的PBS缓冲液在2～8℃下透析8～12h，透析的过程中使用磁力搅拌器对PBS溶液进行搅拌，每隔2～3h换液一次，每次换液0.8～1.2L，共换液5～8次，得到透析产物；

(3)对所得透析产物进行定量，加入18％～25％的甘油溶液中，在不高于-20℃下密封避光保存。

优选地，所述吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体包括吖啶磺酰胺标记和透析。

优选地，所述标记前还包括将所述吖啶磺酰胺和抗IgE抗体配制成吖啶磺酰胺溶液和抗IgE抗体溶液的过程。

优选地，所述吖啶磺酰胺溶液的浓度为1.5～3mg/mL，例如可以是1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2mg/mL、2.1mg/mL、2.2mg/mL、2.3mg/mL、2.4mg/mL、2.5mg/mL、2.6mg/mL、2.7mg/mL、2.8mg/mL、2.9mg/mL或3mg/mL，优选为2mg/mL。

优选地，所述抗IgE抗体溶液的浓度为0.8～1.2mg/mL，例如可以是0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、1.1mg/mL或1.2mg/mL，优选为1mg/mL。

优选地，所述吖啶磺酰胺溶液与抗IgE抗体溶液的体积比为1:(15～20)，例如可以是1:15、1:16、1:17、1:18、1:19或1:20，优选为3:50。

优选地，所述抗IgE抗体溶液的溶剂包括CBS缓冲液，所述CBS缓冲液的浓度为0.1～0.3M，例如可以是0.1M、0.2M或0.3M，优选为0.2M。

优选地，所述标记在避光条件下进行。

优选地，所述标记的时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h，优选为1h。

优选地，所述标记后还包括加入终止液并孵育的步骤。

优选地，所述终止液包括赖氨酸溶液，所述赖氨酸溶液的浓度为18～22mg/mL，例如可以是18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL或22mg/mL，优选为20mg/mL。

优选地，所述孵育在避光条件下进行。

优选地，所述孵育的时间为20～40min，例如可以是20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min或40min。

优选地，所述透析后还包括对透析产物进行保存的步骤。

优选地，所述保存在密封避光条件下进行，所述保存的温度为不高于-20℃，例如可以是-20℃、-21℃、-22℃、-23℃、-24℃或-25℃。

优选地，所述保存前还包括对透析产物进行定量的步骤。

优选地，所述吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体包括以下步骤：

(1’)使用浓度为0.1～0.3M的CBS溶液配制抗IgE抗体溶液，将浓度为1.5～3mg/mL的吖啶磺酰胺溶液与浓度为0.8～1.2mg/mL的抗IgE抗体溶液按体积比为1:(15～20)混合，在避光条件下标记0.5～2h，再加入浓度为18～22mg/mL的赖氨酸溶液，在避光条件下孵育20～40min，得到标记产物；

(2’)将所得标记产物装入透析袋中，使用浓度为0.01～0.03M的PBS缓冲液在2～8℃下透析8～12h，透析的过程中使用磁力搅拌器对PBS溶液进行搅拌，每隔2～3h换液一次，每次换液0.8～1.2L，共换液5～8次，得到透析产物；

(3’)对所得透析产物进行定量，加入18％～25％的甘油溶液中，在不高于-20℃下密封避光保存。

优选地，所述吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体后还包括将试剂组合在试剂盒内的步骤。

作为优选技术方案，本发明所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白：

使用浓度为0.01～0.03M的PBS溶液配制重组烟曲霉抗原蛋白溶液，将浓度为0.2～1μg/mL的生物素溶液与浓度为0.8～1.2μg/mL的重组烟曲霉抗原蛋白溶液按体积比为1:(45～55)混合，在避光条件下标记1.5～2.5h，得到标记产物；

将所得标记产物装入透析袋中，使用浓度为0.01～0.03M的PBS缓冲液在2～8℃下透析8～12h，透析的过程中使用磁力搅拌器对PBS溶液进行搅拌，每隔2～3h换液一次，每次换液0.8～1.2L，共换液5～8次，得到透析产物；

对所得透析产物进行定量，加入18％～25％的甘油溶液中，在不高于-20℃下密封避光保存；

(2)吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体：

使用浓度为0.1～0.3M的CBS溶液配制抗IgE抗体溶液，将浓度为1.5～3mg/mL的吖啶磺酰胺溶液与浓度为0.8～1.2mg/mL的抗IgE抗体溶液按体积比为1:(15～20)混合，在避光条件下标记0.5～2h，再加入浓度为18～22mg/mL的赖氨酸溶液，在避光条件下孵育20～40min，得到标记产物；

(3)将所得生物素标记的重组烟曲霉抗原蛋白、吖啶磺酰胺标记的抗IgE抗体、链霉亲和素标记的磁微粒、低值校准品、高值校准品、清洗液、激发液、样本稀释液和质控品组装在试剂盒内，得到所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒。

第四方面，本发明提供了第一方面所述的重组烟曲霉抗原蛋白和/或第二方面所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒在制备抗烟曲霉的IgE抗体检测装置和/或筛选变应性支气管肺曲霉病治疗药物中的应用。

本发明中，所述重组烟曲霉抗原蛋白可以与抗烟曲霉的IgE抗体特异性结合，使用生物素对其进行标记后，再配合链霉亲和素标记磁微粒和吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体，可以通过化学发光夹心法进行有效检测，检测反应特异性好，灵敏度高，快速准确，可用于制备抗烟曲霉的IgE抗体检测装置以及筛选变应性支气管肺曲霉病治疗药物中，应用价值极高。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述重组烟曲霉抗原多肽可以与相应IgE抗体结合，具有良好的敏感度和特异度，敏感度在71.4％以上，特异度在87.5％以上；构建的重组烟曲霉抗原蛋白具有烟曲霉多个蛋白的特异性抗体结合位点，灵敏度更高可达95.2％，特异度更好可达98.7％；使用生物素对重组烟曲霉抗原蛋白标记后，与亲和素标记磁微粒和吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体等共同制成抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒，所述试剂盒的阳性临界值为0.35IU/mL，检出限、线性、重复性、特异性、回收率和精密度均符合相关的标准，检测反应耗时较短，准确率高，平行性好，克服了使用多种抗原以及样本中的生物素对检测结果的不利影响，实现了相关检测的标准化与流程化，配合相应的检测仪器，可实现大规模样本的全自动流水检测；

(2)所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法科学高效，成功率高，容易操作，具有极高的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例5中批次1试剂盒的线性检测的回归方程图片。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料：

血清样本来自临床样本；

人源抗烟曲霉的IgE抗体来自WHO国际标准品，编号为NIBSC 11/234；

链霉亲和素标记磁微粒来自Thermo Fisher；

清洗液来自丹娜(天津)生物科技股份有限公司，备案号：津械备20190368；

激发液来自丹娜(天津)生物科技股份有限公司，备案号：津械备20190369；

样本稀释液来自丹娜(天津)生物科技股份有限公司，备案号：津械备20190354；

质控品来自丹娜(天津)生物科技股份有限公司，货号：TYZ070002；

生物素购自Thermo Fisher；

吖啶磺酰胺购自赫利森(厦门)生物科技有限公司；

赖氨酸购自国药集团；

烟曲霉m3过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒购自法迪亚公司。

实施例1

本实施例提供6种多肽，所述6种多肽包括SEQ ID No.1所示的Asp f1、SEQ IDNo.2所示的Asp f2、SEQ ID No.3所示的Asp f3、SEQ ID No.4所示的Asp f4、SEQ ID No.5所示的Asp f6和SEQ ID No.6所示的重组烟曲霉抗原蛋白。

SEQ ID No.1：

SEQ ID No.2：

SEQ ID No.3：

SEQ ID No.4：

SEQ ID No.5：

SEQ ID No.6：

本实施例所述多肽均可以与抗烟曲霉的IgE特异性结合，灵敏度高，特异性好，可以用于后续的实验与检测中。

实施例2

本实施例对实施例1制备的6种多肽进行灵敏度与特异度的检测，具体检测步骤如下：

选取75个确诊病例和112个排除病例的血清样本，使用实施例1中的6种多肽分别进行检测。统计检测结果，并与实际结果进行比较，其中，确诊病例血清样本的检测结果为阳性的数量记为A，检测结果为阴性的数量记为C；排除病例血清样本的检测结果为阳性的数量记为B，检测结果为阴性的数量记为D。根据统计结果计算灵敏度与特异度。

灵敏度＝A/(A+C)×100％；

特异度＝D/(B+D)×100％。

所述6中多肽的灵敏度和特异度的计算结果如表1所示。

表1

多肽名称	敏感度(％)	特异度(％)
			Asp f1	78.4	87.5
Asp f2	84.1	91.2
			Asp f3	75.6	92.5
Asp f4	83.3	89.3
			Asp f6	71.4	93.5
重组烟曲霉抗原蛋白	95.2	98.7

由表1可以看出，所述多肽的敏感度均在71.4％以上，特异度均在87.5％以上，重组烟曲霉抗原蛋白的灵敏度和特异度均明显高于其余5种蛋白，敏感度可达95.2％，特异度可达98.7％，说明其与抗烟曲霉IgE抗体的亲和力更强，特异性更好，因此选取重组烟曲霉抗原蛋白用于构建抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒。

实施例3

本实施例使用实施例1中的重组烟曲霉抗原蛋白，构建一种抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒包括链霉亲和素标记磁微粒6mL、生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白5mL、吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体5mL、低值校准品(人源抗烟曲霉的IgE抗体，终浓度为0.5IU/mL)0.6mL、高值校准品(人源抗烟曲霉的IgE抗体，终浓度为30IU/mL)0.6mL、清洗液50mL、激发液10mL、样本稀释液100mL和质控品(QC1：0.2IU/mL，QC2：30IU/mL，QC3：5IU/mL)0.6mL。所述试剂盒可用于100次检测反应。

所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒通过以下方法进行制备：

(1)生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白：

使用浓度为0.02M的PBS溶液配制重组烟曲霉抗原蛋白溶液，取20μL浓度为0.5μg/mL的生物素溶液与1mL浓度为1μg/mL的重组烟曲霉抗原蛋白溶液混合，在避光条件下标记2h，得到标记产物；

将所得标记产物装入透析袋中，使用浓度为0.02M的PBS缓冲液在4℃下透析10h，透析的过程中使用磁力搅拌器对PBS溶液进行搅拌，每隔2h换液一次，每次换液1L，共换液5次，得到透析产物；

对所得透析产物进行定量，加入20％的甘油溶液中，在-20℃下密封避光保存；

(2)吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体：

使用浓度为0.2M的CBS溶液配制抗IgE抗体溶液，将60μL浓度为2mg/mL的吖啶磺酰胺溶液与1mL浓度为1mg/mL的抗IgE抗体溶液混合，在避光条件下标记1h，再加入20μL浓度为20mg/mL的赖氨酸溶液，在避光条件下孵育30min，得到标记产物；

本实施例所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒通过化学发光夹心法，对待测血清中的抗烟曲霉的IgE抗体进行检测，使用方便，准确性高，可用于大规模样本的检测中，应用价值极高。

实施例4

本实施例测定实施例3制备的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的阳性临界值，具体步骤如下：

选取300份健康人的血清样本，使用实施例3制备的试剂盒测定其中的抗烟曲霉IgE抗体的含量，结果如表2所示。

表2

使用Minitab软件对数据进行统计，制成数据分布的直方图，结果显示数据呈偏态分布，采用直接计算法计算95％分位数，作为阳性临界值。

设(n+1)X％＝j+g，j为整数部分，g为小数部分，则：

当g＝0时：P_X＝X_(j)；

当g≠0时：P_X＝(1-g)X_(j)+gX_(j+1)；

根据上述公式计算：(300+1)×95％＝285.95；

当g≠0时：

P_X＝(1-g)X_(j)+gX_(j+1)＝(1-0.95)×X(285)+0.95×X(285+1)＝0.05×0.35+0.95×0.35＝0.35。

综上可知，非过敏人群的正常值范围的上限为0.35IU/mL，因此以0.35IU/mL作为阳性临界值，若待测样本中抗烟曲霉IgE大于等于0.35IU/mL，则判断为阳性；若抗烟曲霉IgE小于0.35IU/mL，则判断为阴性。

实施例5

本实施例对实施例3制备的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的检出限、线性、重复性、特异性、回收率和精密度进行检测，具体检测步骤如下：

检出限检测

对5份浓度近似检出限的低值样本(样本浓度均为0.1IU/mL)(N2-N6)进行检测，每份样本检测5次，对检测结果进行统计。

线性检测

对浓度分别为0.1IU/mL、0.5IU/mL、1IU/mL、10IU/mL和100IU/mL的线性参考品各检测3次，计算其平均值，将测定浓度的平均值与理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，得到线性回归方程，并计算线性相关系数r，对结果进行统计。

其中，批次1试剂盒的线性回归方程如图1所示，由图可知，样本浓度与发光值之间的拟合度很好，表明二者在0.1～100IU/mL之间具有良好的线性关系，保证了检测结果的准确性。

重复性检测

使用浓度为0.5IU/mL和10IU/mL的重复性参考品(S1和S2)重复测定10次，计算10次测定结果的平均值(M)和标准差(SD)，根据公式计算变异系数，并对结果进行统计。

式中：

CV：变异系数；SD：10次测量结果的标准差；M：10次测量结果的平均值。

特异性检测

对浓度不低于60IU/mL且不含抗烟曲霉特异性IgE抗体的总IgE样本、浓度不低于700μg/mL的IgA样本、500μg/mL的IgM样本和7000μg/mL的IgG样本(N7～N10)进行检测，并对结果进行统计。

共对3个批次生产的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒进行了检出限、线性、重复性和特异性的相关检测，结果如表3所示。

表3

由表3可以看出，3个批次的试剂盒的检出限均高于空白限(0.05IU/mL)的检测结果，且小于阳性参考临界值(0.35IU/mL)，符合试剂盒的相关标准；相关系数r均不低于0.996，满足r值不低于0.990的标准，证明线性浓度区间内相应的检测结果的线性关系较好；3个批次的试剂盒的批间变异系数均在3.8％以下，满足了不大于10％的标准，表明产品的重复性较好；不同批次的试剂盒对非抗烟曲霉IgE的抗体样本的检测结果均低于0.09IU/mL，低于阳性参考临界值(0.35IU/mL)，证明产品具有良好的特异性，仅与抗烟曲霉的IgE抗体特异性结合。

回收率检测

将高值准确度参考品A1(80IU/mL)与低值准确度参考品A2(0.2IU/mL)分别按1:4、1:9和1:19的比例配制成混合样本，对准确度参考品A1、A2和混合样本进行检测，每个浓度重复检测3次，取平均值根据公式计算回收率。

式中：

R：回收率；V：高浓度参考品(P1)体积；V0：低浓度参考品(N1)体积；C：参考品P1加入N1后的检测浓度；C0：参考品N1的浓度；Cs：参考品P1的浓度。

使用重庆科斯迈生物科技有限公司的全自动化学发光测定仪(型号SMART6500，机型1)和重庆科斯迈生物科技有限公司的全自动化学发光免疫分析仪(型号SMART 500S，机型2)对样本分别进行检测，并计算回收率，结果如表4所示。

表4

由表4可知，2台仪器检测结果的回收率在96％～107％之间，满足回收率在85％～115％之间的标准，说明试剂盒可用于后续的相关检测中。

精密度检测

使用机型1和机型2对浓度分别为0.2IU/mL、30IU/mL、0.1IU/mL和0.35IU/mL的参考品进行检测，每台仪器分别使用3个批次的试剂盒进行检测，连续检测20天，每天对每个样本重复检测3次，分别计算每批试剂盒的变异系数和不同批次试剂盒之间的变异系数，作为批内精密度和批间精密度，对结果进行统计，如表5所示。

表5

由表5可知，试剂盒的批内变异系数均在6.45％以内，批间变异系数均在7.34％以内，满足变异系数不大于20％的标准，证明不同批次及同一批次内部之间的试剂盒的差异较小，检测结果较为稳定，具有应用价值。

综合上述结果，本发明制备的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的检出限、线性、重复性、特异性、回收率和精密度的检测结果均符合相关标准，产品稳定，检测结果的差异性小，平行性好，特异性高，可应用于相关的实际检测中。

实施例6

本实施例使用实施例3制备的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒，对30份ABPA患者的血清样本(编号为1～30)和30份非过敏患者的血清样本(编号为31～60)进行检测，同时使用法迪亚公司生产的烟曲霉m3过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒作为对照，同时进行检测。其中，法迪亚公司生产的烟曲霉m3过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的阳性临界值为0.35KU/L。阳性样本的检测结果如表6所示，阴性样本的检测结果如表7所示。

表6

表7

由表6和表7可知，使用本发明制备的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的检测结果与法迪亚公司的试剂盒以及样本的来源完全一致，证明本发明制备的试剂盒具有极好的准确性与特异性，且具有耗时短、检测成本低以及操作简便的优点，可应用于相关的检测中。

综上所述，本发明所述重组烟曲霉抗原蛋白可以与抗烟曲霉IgE抗体特异性结合，灵敏度和特异度均很高；制备得到的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒可以对血清中的抗烟曲霉的IgE抗体进行特异性检测，试剂盒的检出限、线性、重复性、特异性、回收率和精密度的检测结果均符合相关标准，检测结果准确性高，重复性好，且可以配合相关的仪器进行自动化检测，可以实现大规模样本的批量检测，操作简便，检测耗时较短，具有广泛的应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 丹娜（天津）生物科技股份有限公司

<120> 一种重组烟曲霉抗原蛋白及其应用

<130> 2021

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 176

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 1

Met Val Ala Ile Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ala Ala Thr Ala Val Ser

1 5 10 15

Val Leu Ala Ala Pro Ser Pro Leu Asp Ala Arg Ala Thr Trp Thr Cys

20 25 30

Ile Asn Gln Gln Leu Asn Pro Lys Thr Asn Lys Trp Glu Asp Lys Arg

35 40 45

Leu Leu Tyr Asn Gln Ala Lys Ala Glu Ser Asn Ser His His Ala Pro

50 55 60

Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr Pro His Trp Phe Thr Asn

65 70 75 80

Gly Tyr Asp Gly Asn Gly Lys Leu Ile Lys Gly Arg Thr Pro Ile Lys

85 90 95

Phe Gly Lys Ala Asp Cys Asp Arg Pro Pro Lys His Ser Gln Asn Gly

100 105 110

Met Gly Lys Asp Asp His Tyr Leu Leu Glu Phe Pro Thr Phe Pro Asp

115 120 125

Gly His Asp Tyr Lys Phe Asp Ser Lys Lys Pro Lys Glu Asp Pro Gly

130 135 140

Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn Lys Val Phe Cys Gly Ile

145 150 155 160

Val Ala His Gln Gln Gly Asn Gln Gly Asp Leu Arg Leu Cys Ser His

165 170 175

<210> 2

<211> 304

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 2

Met Ala Ala Leu Leu Arg Leu Ala Val Leu Leu Pro Leu Ala Ala Pro

1 5 10 15

Leu Val Ala Thr Leu Pro Thr Ser Pro Val Pro Ile Ala Ala Arg Ala

20 25 30

Thr Pro His Glu Pro Val Phe Phe Ser Trp Asp Ala Gly Ala Val Thr

35 40 45

Ser Phe Pro Ile His Ser Ser Cys Asn Ala Thr Gln Arg Arg Gln Ile

50 55 60

Glu Ala Gly Leu Asn Glu Ala Val Glu Leu Ala Arg His Ala Lys Ala

65 70 75 80

His Ile Leu Arg Trp Gly Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Arg Lys Tyr Phe

85 90 95

Gly Asn Arg Pro Thr Met Glu Ala Val Gly Ala Tyr Asp Val Ile Val

100 105 110

Asn Gly Asp Lys Ala Asn Val Leu Phe Arg Cys Asp Asn Pro Asp Gly

115 120 125

Asn Cys Ala Leu Glu Gly Trp Gly Gly His Trp Arg Gly Ala Asn Ala

130 135 140

Thr Ser Glu Thr Val Ile Cys Asp Arg Ser Tyr Thr Thr Arg Arg Trp

145 150 155 160

Leu Val Ser Met Cys Ser Gln Gly Tyr Thr Val Ala Gly Ser Glu Thr

165 170 175

Asn Thr Phe Trp Ala Ser Asp Leu Met His Arg Leu Tyr His Val Pro

180 185 190

Ala Val Gly Gln Gly Trp Val Asp His Phe Ala Asp Gly Tyr Asp Glu

195 200 205

Val Ile Ala Leu Ala Lys Ser Asn Gly Thr Glu Ser Thr His Asp Ser

210 215 220

Glu Ala Leu Gln Tyr Phe Ala Leu Glu Ala Tyr Ala Phe Asp Ile Ala

225 230 235 240

Ala Pro Gly Val Gly Cys Ala Gly Glu Ser His Gly Pro Asp Gln Gly

245 250 255

His Asp Thr Gly Ser Ala Ser Ala Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser Ser

260 265 270

Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Thr Thr Thr Pro Thr Asp Ser

275 280 285

Pro Ser Ala Thr Ile Asp Val Pro Pro Val Arg Thr Val Arg Ile Ser

290 295 300

<210> 3

<211> 168

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 3

Met Ser Gly Leu Lys Ala Gly Asp Ser Phe Pro Ser Asp Val Val Phe

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Pro Trp Ser Glu Asp Lys Gly Glu Ile Thr Ala Cys Gly

20 25 30

Ile Pro Ile Asn Tyr Asn Ala Ser Lys Glu Trp Ala Asp Lys Lys Val

35 40 45

Ile Leu Phe Ala Leu Pro Gly Ala Phe Thr Pro Val Cys Ser Ala Arg

50 55 60

His Val Pro Glu Tyr Ile Glu Lys Leu Pro Glu Ile Arg Ala Lys Gly

65 70 75 80

Val Asp Val Val Ala Val Leu Ala Tyr Asn Asp Ala Tyr Val Met Ser

85 90 95

Ala Trp Gly Lys Ala Asn Gln Val Thr Gly Asp Asp Ile Leu Phe Leu

100 105 110

Ser Asp Pro Asp Ala Arg Phe Ser Lys Ser Ile Gly Trp Ala Asp Glu

115 120 125

Glu Gly Arg Thr Lys Arg Tyr Ala Leu Val Ile Asp His Gly Lys Ile

130 135 140

Thr Tyr Ala Ala Leu Glu Pro Ala Lys Asn His Leu Glu Phe Ser Ser

145 150 155 160

Ala Glu Thr Val Leu Lys His Leu

165

<210> 4

<211> 322

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 4

Met Gln Leu Lys Asn Ser Met Leu Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ser Ser Val Ala Arg Leu His Gly His Glu Arg Arg His Leu His His

20 25 30

Ala Gly Glu Lys Arg Glu Val Gly Asp Thr Val Tyr Ala Thr Ile Asn

35 40 45

Gly Val Leu Val Ser Trp Ile Asn Glu Trp Ser Gly Glu Ala Lys Thr

50 55 60

Ser Asp Ala Pro Val Ser Gln Ala Thr Pro Val Ser Asn Ala Val Ala

65 70 75 80

Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Pro Glu Pro Ser Ser Ser His Ser Asp

85 90 95

Ser Ser Ser Ser Ser Gly Val Ser Ala Asp Trp Thr Asn Thr Pro Ala

100 105 110

Glu Gly Glu Tyr Cys Thr Asp Gly Phe Gly Gly Arg Thr Glu Pro Ser

115 120 125

Gly Ser Gly Ile Phe Tyr Lys Gly Asn Val Gly Lys Pro Trp Gly Ser

130 135 140

Asn Ile Ile Glu Val Ser Pro Glu Asn Ala Lys Lys Tyr Lys His Val

145 150 155 160

Ala Gln Phe Val Gly Ser Asp Thr Asp Pro Trp Thr Val Val Phe Trp

165 170 175

Asn Lys Ile Gly Pro Asp Gly Gly Leu Thr Gly Trp Tyr Gly Asn Ser

180 185 190

Ala Leu Thr Leu His Leu Glu Ala Gly Glu Thr Lys Tyr Val Ala Phe

195 200 205

Asp Glu Asn Ser Gln Gly Ala Trp Gly Ala Ala Lys Gly Asp Glu Leu

210 215 220

Pro Lys Asp Gln Phe Gly Gly Tyr Ser Cys Thr Trp Gly Glu Phe Asp

225 230 235 240

Phe Asp Ser Lys Ile Asn Gln Gly Trp Ser Gly Trp Asp Val Ser Ala

245 250 255

Ile Gln Ala Glu Asn Ala His His Glu Val Gln Gly Met Lys Ile Cys

260 265 270

Asn His Ala Gly Glu Leu Cys Ser Ile Ile Ser His Gly Leu Ser Lys

275 280 285

Val Ile Asp Ala Tyr Thr Ala Asp Leu Ala Gly Val Asp Gly Ile Gly

290 295 300

Gly Lys Val Val Pro Gly Pro Thr Arg Leu Val Val Asn Leu Asp Tyr

305 310 315 320

Lys Glu

<210> 5

<211> 221

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 5

Gly Thr Ser Pro Ile Gln Thr Pro Ile Asn Thr Met Ser Gln Gln Tyr

1 5 10 15

Thr Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Ala Leu Gln Pro Tyr Ile

20 25 30

Ser Gln Gln Ile Met Glu Leu His His Lys Lys His His Gln Thr Tyr

35 40 45

Val Asn Gly Leu Asn Ala Ala Leu Glu Ala Gln Lys Lys Ala Ala Glu

50 55 60

Ala Thr Asp Val Pro Lys Leu Val Ser Val Gln Gln Ala Ile Lys Phe

65 70 75 80

Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala

85 90 95

Pro Glu Lys Ser Gly Gly Gly Lys Ile Asp Gln Ala Pro Val Leu Lys

100 105 110

Ala Ala Ile Glu Gln Arg Trp Gly Ser Phe Asp Lys Phe Lys Asp Ala

115 120 125

Phe Asn Thr Thr Leu Leu Gly Ile Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu

130 135 140

Val Thr Asp Gly Pro Lys Gly Lys Leu Asp Ile Thr Thr Thr His Asp

145 150 155 160

Gln Asp Pro Val Thr Gly Ala Ala Pro Val Phe Gly Val Asp Met Trp

165 170 175

Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gln Tyr Leu Asn Asp Lys Ala Ser Tyr Ala

180 185 190

Lys Gly Ile Trp Asn Val Ile Asn Trp Ala Glu Ala Glu Asn Arg Tyr

195 200 205

Ile Ala Gly Asp Lys Gly Gly His Pro Phe Met Lys Leu

210 215 220

<210> 6

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Met Val Ala Ile Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ala Ala Thr Ala Val Ser

1 5 10 15

Val Leu Ala Ala Pro Ser Pro Leu Asp Ala Arg Ala Thr Trp Thr Cys

20 25 30

Ile Asn Gln Gln Leu Asn Pro Lys Thr Asn Lys Trp Glu Asp Lys Arg

35 40 45

Leu Leu Tyr Asn Gln Ala Lys Ala Met Ala Ala Leu Leu Arg Leu Ala

50 55 60

Val Leu Leu Pro Leu Ala Ala Pro Leu Val Ala Thr Leu Pro Thr Ser

65 70 75 80

Pro Val Pro Ile Ala Ala Arg Ala Thr Pro His Glu Pro Val Phe Phe

85 90 95

Ser Trp Asp Ala Gly Ala Val Thr Ser Phe Pro Ile His Ser Ser Cys

100 105 110

Asn Ala Val Glu Leu Ala Arg His Ala Lys Ala His Ile Leu Arg Trp

115 120 125

Gly Asn Glu Ser Glu Ile Tyr Arg Lys Tyr Phe Gly Asn Arg Pro Thr

130 135 140

Met Glu Ala Val Gly Ala Tyr Asp Val Ile Val Asn Gly Asp Lys Ala

145 150 155 160

Asn Val Leu Phe Arg Cys Asp Asn Pro Asp Gly Asn Cys Ala Leu Glu

165 170 175

Gly Trp Gly Gly His Trp Arg Gly Ala Asn Ala Thr Ser Glu Thr Val

180 185 190

Ile Cys Asp Arg Ser Met Ser Gly Leu Lys Ala Gly Asp Ser Phe Pro

195 200 205

Ser Asp Val Val Phe Ser Tyr Ile Pro Trp Ser Glu Asp Lys Gly Glu

210 215 220

Ile Thr Ala Cys Gly Ile Pro Ile Asn Tyr Asn Ala Ser Lys Glu Trp

225 230 235 240

Val Ile Asp His Gly Lys Ile Thr Tyr Ala Ala Leu Glu Pro Ala Lys

245 250 255

Asn His Leu Glu Phe Ser Ser Ala Glu Thr Val Leu Lys His Leu Met

260 265 270

Gln Leu Lys Asn Ser Met Leu Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Gly Ser

275 280 285

Ser Val Ala Arg Leu His Gly His Glu Arg Arg His Leu His His Ala

290 295 300

Gly Glu Lys Arg Glu Val Gly Asp Thr Val Tyr Ala Thr Ile Asn Gly

305 310 315 320

Val Leu Val Ser Trp Ile Asn Glu Trp Ser Gly Glu Ala Lys Thr Ser

325 330 335

Asp Ala Pro Val Ser Gln Ala Thr Pro Val Ser Asn Ala Val Ala Ala

340 345 350

Ala Ala Ala Ala Ser Thr Pro Glu Pro Ser Ser Ser His Ser Asp Ser

355 360 365

Ser Ser Ser Ser Gly Gln Ala Glu Asn Ala His His Glu Val Gln Gly

370 375 380

Met Lys Ile Cys Asn His Ala Gly Glu Leu Cys Ser Ile Ile Ser His

385 390 395 400

Gly Leu Ser Lys Val Ile Asp Ala Tyr Thr Ala Asp Leu Ala Gly Val

405 410 415

Asp Gly Ile Gly Gly Lys Val Val Pro Gly Pro Thr Arg Leu Val Val

420 425 430

Asn Leu Asp Tyr Lys Glu Leu Gln Tyr Leu Asn Asp Lys Ala Ser Tyr

435 440 445

Ala Lys Gly Ile Trp Asn Val Ile Asn Trp Ala Glu Ala Glu Asn Arg

450 455 460

Tyr Ile Ala Gly Asp Lys Gly Gly His Pro Phe Met Lys Leu

465 470 475

Claims

1.一种重组烟曲霉抗原蛋白，其特征在于，所述重组烟曲霉抗原蛋白包括烟曲霉抗原的Asp f1肽段、Asp f2肽段、Asp f3肽段、Asp f4肽段和Asp f6肽段；所述重组烟曲霉抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.一种抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒包括权利要求1所述的重组烟曲霉抗原蛋白。

3.根据权利要求2所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒，其特征在于，所述重组烟曲霉抗原蛋白包括生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白；

所述生物素包括N-羟基磺酸基琥珀生物素。

4.根据权利要求3所示的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒还包括磁微粒和/或抗IgE抗体；

所述磁微粒包括链霉亲和素标记磁微粒；

所述抗IgE抗体包括吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体。

5.根据权利要求4所示的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒还包括校准品；

所述校准品包括低值校准品和/或高值校准品；

所述低值校准品包括人源抗烟曲霉的IgE抗体，浓度为0.2～0.8IU/mL；

所述高值校准品包括人源抗烟曲霉的IgE抗体，浓度为25～35IU/mL；

所述抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒还包括清洗液、激发液、样本稀释液或质控品中的任意一种或至少两种的组合。

6.一种权利要求2-5任一项所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白和吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体的步骤。

7.根据权利要求6所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白包括生物素标记和透析的步骤；

所述标记前还包括将所述生物素和重组烟曲霉抗原蛋白配制成生物素溶液和重组烟曲霉抗原蛋白溶液的过程；

所述生物素溶液的浓度为0.2～1μg/mL；

所述重组烟曲霉抗原蛋白溶液的浓度为0.8～1.2μg/mL；

所述生物素溶液与重组烟曲霉抗原蛋白溶液的体积比为1:(45～55)。

8.根据权利要求7所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述重组烟曲霉抗原蛋白溶液的溶剂包括PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为0.01～0.03M；

所述标记在避光条件下进行；

所述标记的时间为1.5～2.5h；

所述透析使用的液体包括PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的浓度为0.01～0.03M；

所述透析的过程中对透析使用的液体进行搅拌，所述搅拌包括磁力搅拌器搅拌；

所述透析在2～8℃下进行；

所述透析的时间为8～12h；

所述透析的过程中换液5～8次，所述换液的间隔时间为2～3h；

所述换液的体积为0.8～1.2L；

所述透析后还包括对透析产物进行保存的步骤；

所述透析产物保存在甘油溶液中，所述甘油溶液的浓度为18％～25％；

所述保存在密封避光条件下进行，所述保存的温度不高于-20℃。

9.根据权利要求8所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述生物素溶液的浓度为0.5μg/mL；

所述重组烟曲霉抗原蛋白溶液的浓度为1μg/mL；

所述生物素溶液与重组烟曲霉抗原蛋白溶液的体积比为1:50；

所述标记的时间为2h；

所述换液的体积为1L；

所述甘油溶液的浓度为20％。

10.根据权利要求8所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述保存前还包括对透析产物进行定量的步骤；

所述生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白包括以下步骤：

11.根据权利要求6所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体包括吖啶磺酰胺标记和透析；

所述标记前还包括将所述吖啶磺酰胺和抗IgE抗体配制成吖啶磺酰胺溶液和抗IgE抗体溶液的过程；

所述吖啶磺酰胺溶液的浓度为1.5～3mg/mL；

所述抗IgE抗体溶液的浓度为0.8～1.2mg/mL；

所述吖啶磺酰胺溶液与抗IgE抗体溶液的体积比为1:(15～20)；

所述抗IgE抗体溶液的溶剂包括CBS缓冲液，所述CBS缓冲液的浓度为0.1～0.3M；

所述标记在避光条件下进行；

所述标记的时间为0.5～2h。

12.根据权利要求11所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述吖啶磺酰胺溶液的浓度为2mg/mL；

所述抗IgE抗体溶液的浓度为1mg/mL；

所述吖啶磺酰胺溶液与抗IgE抗体溶液的体积比为3:50；

所述CBS缓冲液的浓度为0.2M；

所述标记的时间为1h。

13.根据权利要求11所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述标记后还包括加入终止液并孵育的步骤；

所述终止液包括赖氨酸溶液，所述赖氨酸溶液的浓度为18～22mg/mL；

所述孵育在避光条件下进行；

所述孵育的时间为20～40min；

所述透析在2～8℃下进行；

所述透析的时间为8～12h；

所述换液的体积为0.8～1.2L；

所述透析后还包括对透析产物进行保存的步骤；

所述保存在密封避光条件下进行，所述保存的温度为不高于-20℃。

14.根据权利要求13所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述赖氨酸溶液的浓度为20mg/mL；

所述PBS缓冲液的浓度为0.02M；

所述换液的体积为1L；

所述甘油溶液的浓度为20％。

15.根据权利要求13所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述保存前还包括对透析产物进行定量的步骤；

所述吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体包括以下步骤：

(3’)对所得透析产物进行定量，加入18％～25％的甘油溶液中，在不高于-20℃下密封避光保存；

所述吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体后还包括将试剂组合在试剂盒内的步骤。

16.根据权利要求6～15任一项所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)生物素标记重组烟曲霉抗原蛋白：

(2)吖啶磺酰胺标记抗IgE抗体：

使用浓度为0.1～0.3M的CBS溶液配制抗IgE抗体溶液，将浓度为1.5～3mg/mL的吖啶磺酰胺溶液与浓度为0.8～1.2mg/mL的抗IgE抗体溶液按体积比为1:(15～20)混合，在避光条件下标记0.5～2h，再加入浓度为18～22mg/mL赖氨酸溶液，在避光条件下孵育20～40min，得到标记产物；

17.权利要求1所述的重组烟曲霉抗原蛋白和/或权利要求2-5任一项所述的抗烟曲霉的IgE抗体检测试剂盒在制备抗烟曲霉的IgE抗体检测装置和/或筛选变应性支气管肺曲霉病治疗药物中的应用。