CN112920974A - 一株地塞米松高效降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株地塞米松高效降解菌及其应用。红球菌(Rhodococcus sp.)D32，保藏编号：GDMCC No.61560。本发明菌株对地塞米松的降解速率快，可用于降解单一的地塞米松，也可用于降解多种合成类类固醇激素混合污染物，为含有地塞米松等合成类类固醇激素的城市污水及养殖废水处理提供了一种新的种质资源。

Description

一株地塞米松高效降解菌及其应用

技术领域：

本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株地塞米松高效降解菌及其应用。

背景技术：

地塞米松(Dexamethasone，DEX)是一种重要的合成类固醇糖皮质激素药物，其生物活性是天然糖皮质激素皮质醇的40倍，具有强大的抗炎和免疫抑制作用，在医疗领域广泛使用。自2019年12月以来，新冠疫情席卷全球，成为人类主要的健康威胁。研究者们通过不断探索和尝试提出了第一种在感染新冠患者中具有挽救生命功效的药物-地塞米松。临床试验表明，DEX可以缩短新冠患者住院时间，降低死亡率。这些研究结果致使地塞米松的市场需求量激增，随着新冠病毒的持续流行，在较长的一段时间内，DEX的全球产量及使用量将持续快速增长。尽管DEX应对新冠疫情的有效成果令人欣喜，但其内分泌干扰物的特性却对生态环境构成威胁。水环境中存在的DEX可对水生生物产生毒性，研究表明长期暴露于DEX会使金头鲷鱼的生长速度降低；还可能对淡水甲壳类动物的生长产生危害；此外，DEX的环境暴露也会给哺乳动物及人类带来不良影响，Xu等研究发现暴露于地塞米松的小鼠胚胎发育迟缓，指出DEX具有胚胎发育毒性；另有研究报道，DEX可能通过卵巢类固醇生成酶的变化以及抑制促性腺激素的分泌作用导致女性不育。除了单独作用产生危害外，DEX还可能与其他合成类固醇激素物质一起产生协同危害作用。近年来，地塞米松等合成类固醇激素药物的广泛使用使其在环境中残留并被频繁检出，Chang等在52个城市河流采样点中检出糖皮质激素，其中48个检出DEX；Sanchez等在法国一家制药厂的下游河水中检测到10μg/L地塞米松；Shi等调查发现在某养猪场的废水中，DEX浓度高达1050.90ng/L，因此，水生环境中残留的DEX及其他类固醇激素物质对生态环境和人类健康构成潜在威胁，研究其消减技术十分必要。

微生物降解是环境中有类固醇激素污染物自然消减的一种重要途径，亦是最为经济绿色的方法之一。一直以来，环境中类固醇激素物质的生物降解研究主要集中在雌激素及几种天然的雄孕激素，对于糖皮质激素尤其是合成糖皮质激素物质的生物降解研究还较少，而在有限的研究中，生物降解的周期往往较长，降解效率较低。城市污水处理厂、养殖场、地下水、地表水等环境水体中频繁检出地塞米松等合成类固醇激素物质，表明现有污水处理工艺对该类化合物的去除能力有限，有必要研发高效的、有针对性的和高适用性的微生物降解去除方法。

发明内容：

为了克服现有去除合成类糖皮质激素地塞米松所存在的技术空白，本发明的目的在于提供一株地塞米松高效降解菌。该菌株可快速降解合成类糖皮质激素地塞米松，并对其他多种合成类类固醇激素物质具有降解能力。

本发明的地塞米松高效降解菌，为红球菌(Rhodococcus sp.)D32，其于2021年3月15 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号：GDMCC No：61560。

本发明的第二个目的是提供上述红球菌D32在降解合成类类固醇激素物质中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种降解合成类类固醇激素物质的方法，其是将红球菌D32 接种到含有合成类类固醇激素物质的水体中，利用红球菌D32降解合成类类固醇激素物质。

所述的类固醇激素为地塞米松、屈螺酮、左炔诺孕酮、醋酸炔诺酮中的一种或多种。

进一步优选为合成类糖皮质激素地塞米松。

优选，是在降解污水中的地塞米松中的应用。

进一步优选，所述的污水为城市污水、养殖废水、工业污水、医疗废水、被污染的地表水及地下水中的一种或多种。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的红球菌D32能够降解合成类糖皮质激素地塞米松及其他多种合成类类固醇激素物质；

(2)红球菌D32在地塞米松浓度为0.5mg/L，28℃～30℃，PH 7～8的条件下能够快速降解地塞米松，降解率达99％以上。在MH肉汤培养基中，降解半衰期为7.38h，完全降解所需时间为14.75h；

(3)红球菌D32可显著促进实际污水中地塞米松的降解，在添加红球菌D32的实际污水中，20μg/L DEX降解90％所需时间小于20h，完全降解所需时间小于40h，而在未添加红球菌D32的实际污水中，20μg/L DEX降解90％所需时间接近50h，完全降解所需时间接近 70小时。

(4)本发明菌株对地塞米松的降解速率快，可用于降解单一的地塞米松，也可用于降解多种合成类类固醇激素混合污染物，为含有地塞米松等合成类类固醇激素的城市污水及养殖废水处理提供了一种新的种质资源。

本发明的Rhodococcus sp.D32，其于2021年3月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号：GDMCC No：61560。

附图说明：

图1是红球菌D32在MH琼脂培养基上生长的菌落图(a)及其在MH肉汤培养基中，以30℃， 180rpm条件培养时的生长曲线(b)。

图2是MH肉汤中红球菌D32对地塞米松的降解效果。

图3是红球菌D32对实际污水中地塞米松的降解促进效果；其中，(a)实际污水中20μg/L DEX 浓度变化，(b)实际污水中20μg/L DEX的降解率。

图4是MH肉汤中红球菌D32对4种合成类类固醇激素物质的降解效果；其中，(a)实验组，(b)对照组。

具体实施方式：

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：地塞米松降解菌的筛选及鉴定

前期以湖南省某规模化养猪场的冲刷水为菌源，经人工富集培养、有目的性地分离纯化得到28种单菌。本发明在此基础上，筛选出一株地塞米松的高效降解菌，具体实施过程如下：

取59个10mL玻璃试管，分别加入5mL灭菌后的MH肉汤，其中56个作为实验组分别加入28种已培养至对数期的单菌，每种单菌各2个平行，另取3个试管不加细菌作为对照组。向实验组和对照组中分别加入目标糖皮质激素地塞米松，使其最终浓度为0.5mg/L。将实验组和对照组的试管用活塞封口并用锡纸包好避光，放入摇床，于30℃，180rpm恒温培养，分别于0h，24h，48h时取样上机检测，根据肉汤中地塞米松的残留量，筛选出具有降解地塞米松能力的单菌。28种课题组现存细菌中共有4种可以降解地塞米松，其中处于对数期的菌株D32在刚添加DEX的T0时刻能少量降解DEX，且在48h时已将DEX降解完全，具有降解速率优势。

将菌株D32送往上海生工生物有限公司，进行16S rDNA鉴定：16S引物序列为：27f：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，以细菌总DNA为模板，PCR反应程序如下：95℃变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃60s，共34个循环；72℃10min，12℃保存。将得到的16S rDNA序列(序列如SEQ ID NO：1 所示)登录GenBank，进行Blast同源比对，经比对发现，菌株D32与Rhodococcus sp.strain 的同源性能够达到99％。

菌株D32在鉴定培养基(MH肉汤培养基)纯培养条件下，菌落呈圆形(图1a)，表面光滑有光泽，中部略凸起，边缘呈微小锯齿状，较湿润，有粘性，菌落颜色浅黄偏红，正反颜色一致。在MH肉汤培养基中，以30℃，180rpm条件培养时的生长曲线如图1b所示。进行系列生理生化试验，结果为：硝酸盐还原反应阳性，过氧化氢酶试验阳性，明胶水解试验阴性；淀粉水解试验阴性，西蒙氏柠檬酸盐实验阴性，V-P试验阴性，葡萄糖试验阴性，甘露醇试验阴性，动力学培养基试验阴性。

将菌株16S rDNA基因序列结合其形态及其他生理生化指标进行分析，初步鉴定菌株D32 为Rhodococcus sp.strain，将其命名为：红球菌(Rhodococcus sp.)D32，其于2021年3月15 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号：GDMCC No：61560。

实施例2：MH肉汤培养基中红球菌D32对地塞米松的降解

将灭菌后的MH肉汤培养基在无菌条件下分装至300mL洁净锥形瓶中，每个锥形瓶加入150ml培养基，加入目标糖皮质激素地塞米松(Dexamethasone，DEX)，使其最终浓度为0.5mg/L。实验包含有菌实验组及灭菌对照组：(1)实验组(未灭菌组，Nonsterile)，将红球菌D32接种到含有目标化合物的灭菌后的MH肉汤中混合均匀；(2)对照组(灭菌组，Sterile)，不接种菌株，且在灭菌后的MH肉汤中添加浓度为质量分数0.02％的叠氮化钠抑菌。所有锥形瓶均用可透空气的封口膜封口，外壁包裹锡纸避光，置于摇床中(30℃，180rpm)培养；实验设置3个平行，连续取样测定培养液中地塞米松的残留浓度，分析红球菌D32对地塞米松的降解能力，结果如图2所示。由图可见，红球菌D32可在15h内完全降解0.5mg/L地塞米松，未添加细菌的对照组中地塞米松浓度基本没有变化。分别采用零级和一级动力学方程拟合红球菌D32在MH肉汤中对DEX的好氧降解，拟合数据均具有很好的显著性(p<0.0001)，其中0级反应拟合优度更佳，结果如表1所示，降解半衰期为7.38h。

表1降解过程中的动力学参数

本实施例充分说明了红球菌D32对MH肉汤中0.5mg/L的地塞米松具有良好的降解效果。

实施例3：红球菌D32促进实际污水中地塞米松的降解

取广州市观澜污水处理厂缺氧工艺段水样20ml于50ml灭菌锥形瓶中，加入目标糖皮质激素地塞米松(Dexamethasone，DEX)，使其最终浓度为20μg/L。实验包含添加红球菌D32 的实验组及不添加红球菌D32的对照组：(1)实验组(加菌组，Sewage added strainD32)，将红球菌D32接种到含有目标化合物地塞米松的污水培养基中，混合均匀；(2)对照组(不加菌组，Sewage alone)，采用与实验组相同的污水，不做任何处理，不添加红球菌D32。所有锥形瓶均用可透空气的封口膜封口后，置于摇床中(30℃，180rpm)培养；实验设置3 个平行，连续取样测定污水培养基中地塞米松的残留浓度，分析红球菌D32在实际污水中对地塞米松的降解能力，结果如图3所示。由图可见，红球菌D32可显著促进实际污水中地塞米松的降解，在添加红球菌D32的实际污水中，20μg/L DEX降解55％、92％、100％所需时间分别为7h、18h及32h，而在未添加红球菌D32的实际污水中，20μg/L DEX降解90％所需时间接近50小时，完全降解所需时间接近70小时。

本实施例充分说明了红球菌D32对实际污水中的接近环境浓度的地塞米松的降解具有显著的促进作用。

实施例4：MH肉汤培养基中菌株D32对几种合成类类固醇激素物质的降解

将灭菌后的MH肉汤培养基在无菌条件下分装至1L洁净锥形瓶中，除加入地塞米松外，再分别加入3种合成类类固醇孕激素，其中包括屈螺酮(Drospirenone，简称DPN)，左炔诺孕酮(levonorgestrel，简称LNGT)和醋酸炔诺酮(Norethisterone acetate，简称NTRA)，各物质终浓度为0.5mg/L。实验包含有菌实验组及灭菌对照组：(1)实验组，将红球菌D32接种到含有目标化合物的MH肉汤中混合均匀；(2)对照组，不接种菌株，且在MH肉汤中添加浓度为质量分数0.02％叠氮化钠抑菌。所有锥形瓶均用可透空气的封口膜封口，外壁包裹锡纸避光，置于摇床中(30℃，180rpm)培养；实验设置3个平行，连续取样，测定培养液中各激素物质的残留浓度，计算出各激素物质在各取样点相应的降解率，结果如图4所示。由图可见，实验组中，在48h内，除地塞米松外，三种合成孕激素接近完全降解，降解率均为95％以上。对照组中目标激素物质的浓度在实验周期内变化不大。

本实施例充分说明了红球菌D32对MH肉汤中环境浓度的几种合成类类固醇孕激素物质具有良好的降解效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一株地塞米松高效降解菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 红球菌D32(Rhodococcus sp.)

<400> 1

ccttcggggg tacacgagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggtgatct gccctgcact 60

ctgggataag cctgggaaac tgggtctaat accggatatg agctcctgtc gcatggcggg 120

ggttggaaag gtttactggt gcaggatggg cccgcggcct atcagcttgt tggtggggta 180

atggcctacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac 240

tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa 300

agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag 360

cagggacgaa gcgagagtga cggtacctgc agaagaagca ccggccaact acgtgccagc 420

agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt gtccggaatt actgggcgta aagagctcgt 480

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cgggcagact tgagtactgc aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca 600

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gcgaaagcgt gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacggtgg 720

gcgctaggtg tgggtttcct tccacgggat ccgtgccgta gctaacgcat taagcgcccc 780

gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 840

ggcggagcat gtggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatata 900

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cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctg 1020

tcggatcggg gtctgcaact cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag 1080

gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacaca tgctacaatg 1140

gccggtacag agggctgcga taccgtgagg tggagcgaat cccttaaagc cggtctcagt 1200

tcggatcggg gtctgcaact cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag 1260

caacgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt 1320

cggtaacacc cgaagccggt ggcctaaccc ttgtggaggg agccgtcgaa g 1371

Claims (9)

1.红球菌(Rhodococcus sp.)D32，保藏编号：GDMCC No：61560。

2.权利要求1所述的红球菌D32在降解类固醇激素物质中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的类固醇激素为地塞米松、屈螺酮、左炔诺孕酮、醋酸炔诺酮中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的类固醇激素为地塞米松。

5.一种降解类固醇激素物质的方法，其特征在于，是将权利要求1所述的红球菌D32接种到含有类固醇激素物质的水体中，利用红球菌D32降解类固醇激素物质。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的类固醇激素为地塞米松、屈螺酮、左炔诺孕酮、醋酸炔诺酮中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的类固醇激素为地塞米松。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，是在降解污水中的地塞米松、屈螺酮、左炔诺孕酮或醋酸炔诺酮中的应用。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的污水为城市污水、养殖废水、工业污水、医疗废水、被污染的地表水及地下水中的一种或多种。

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