CN112920261B

CN112920261B - 一种具有抗菌作用的茶叶多肽制备及其应用

Info

Publication number: CN112920261B
Application number: CN202110141266.8A
Authority: CN
Inventors: 王丽芳; 党向利; 谢忠稳; 叶良
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112920261A

Abstract

本发明涉及一种茶叶抗菌多肽，所述的茶叶抗菌多肽为分子量小于18.4kD的多肽。本发明还涉及了该茶叶抗菌多肽的制备方法和用途。本发明具有材料来源丰富、天然、易于被大众接受等优点；所制备的茶叶抗菌多肽制品具有天然、纯度高、抗菌活性好等特点，可以有效的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，并具有对冷却肉防腐保鲜的效果，可延长冷却肉的货架期。

Description

一种具有抗菌作用的茶叶多肽制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种具有抗菌作用的茶叶多肽制备及其应用。

背景技术

抗生素起初是指微生物的次级代谢产物，现被用来指杀死或抑制微生物的所有化学物质统称。1941年抗生素开始应用于临床，主要用于治疗细菌性、真菌性传染性疾病，曾被称为二十世纪最伟大的医学发现之一。但由于抗生素的广泛使用和过度滥用，至今已造成很多不良后果，例如出现能抵抗多种抗生素的“超级细菌”、抗生素对正常细胞毒副作用的增加、医疗资源严重浪费等等。化学防腐剂、抗生素作为病原抑制剂添加到食品、动物饲料中由来已久。据美国卫生基金会和国家癌症研究所公布的报告指出全世界每年患癌症的人中，30％左右受害于食品中的抗生素或化学防腐剂。在临床治疗中结构新颖的抗生素发现匾乏，抗药菌群迅猛发展，使某些感染性疾病成为临床治疗的难题。从20世纪50年代开始，随着抗生素和化学防腐剂的广泛使用和人们对食品质量和环境质量的要求不断提高，它们的副作用也就日益表现出来，面临着被淘汰的局面。为防止这些不良后果的不断加剧，减少抗生素和化学防腐剂的使用，人们开始研发新型抗菌制剂。抗菌多肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)，就是目前研究较多的新型抗菌制剂之一。

AMPs是生物体受到外界胁迫时，生物体会分泌产生的一种抵御外界侵害的免疫分子，一般是小分子阳离子肽类，是进化上高度保守的先天免疫系统的组成部分。第一个完全被鉴定的具有抗菌活性的AMP为来源于昆虫的Cecropin，是瑞典科学家Boman等人通过诱导惜古比天蚕(Hyalophora Cecropia)蛹，再从诱导蛹的血淋巴中分离出来的。自此，研究人员开启了对AMPs研究的篇章。AMPs在生物界分布十分广泛，几乎每一种生物体内均有AMPs分布。无论是低等的微生物还是高等的哺乳动物，AMPs在这些生物的免疫系统中皆有发现。它们的广泛分布暗示着它们在复杂多细胞生物成功进化的过程中担负着基础性的作用。到目前为止，在所有六个生命界中都发现了AMPs：细菌、古细菌、原生生物、真菌、植物和动物，30％是最近5年才发现鉴定的。虽然抗菌肽具有广泛的抗性(细菌、真菌、病毒、原虫等)，但是对正常的哺乳动物细胞无毒性。抗菌肽并不诱发抗性突变的产生，多数抗菌肽的水溶性较好，对热稳定，对较大离子强度、较低或较高的pH都有较强的耐受性。

在AMPs起初的研究中，AMPs分类是通过来源来划分的，比如微生物抗菌肽，植物抗菌肽，昆虫抗菌肽，鱼抗菌肽等等。但是随着AMPs研究的深入，也出现了一些其它的分类方式，例如有人根据AMPs合成部位类型分为核糖体肽和非核糖体肽，还有人根据AMPs的二级结构以及氨基酸组成将AMPs分为α螺旋型抗菌肽，β折叠抗菌肽以及环型抗菌肽三类。

AMPs之所以能作为新型抗菌制剂中关注度较高的一种，是因为AMPs与传统抗生素相比，有着以下几点特殊的优势：(1)AMPs对病原微生物具有更广谱的活性，除了可以抑制细菌增长，AMPs还可具有抑制真菌的繁殖、抗病毒、抗HIV、杀死原虫等功效。(2)AMPs大多能与没有特异性受体的细胞膜相互作用，因此，很少诱导病原微生物对AMPs产生抗性。(3)AMPs对大多数哺乳动物安全，副作用小，不会致使生物体畸变，也不会蓄积毒性。此外，AMPs还有促进伤口愈合，提高生物体免疫力等功效。因此，AMPs在疾病治疗、食品、农业、畜牧业、水产等领域有着非常广阔的应用前景。

基于抗菌多肽的重要作用，许多学者开展新抗菌多肽的寻找及制备研究。寻找和制备抗菌多肽有三种途径：化学合成，生物工程(重组技术)和从植物、动物、微生物及其它生物中筛选天然的抗菌多肽类。生物工程存在如不正确转录而导致折叠不准确的蛋白质等问题。化学合成存在受到合成起始点的基础结构的限制。从植物、动物和微生物中筛选抗菌多肽具有来源丰富、物质天然等优点，因而倍受抗菌多肽研究工作者的青睐。根据抗菌多肽数据库APD(http://aps.unmc.edu/AP/)，目前已报到的抗菌多肽有3199种，其中来源于细菌的有357种，古细菌5种，原生生物8种，真菌20种，植物352种，动物2375种，也包括一些合成肽。目前已知的大多数AMPs来自动物界，涵盖脊椎动物和无脊椎动物。脊椎动物AMPs主要分布在两栖动物，鱼类，爬行动物，鸟类和哺乳动物，而无脊椎动物AMPs包括昆虫，蜘蛛，软体动物，蠕虫和甲壳类动物。大多数无脊椎动物AMPs则来自于昆虫。

植物既是人类所需的食物的主要来源，还能为人类提供各种纤维素和药品，在人类生活、工业、农业和医药上具有广泛的用途。生存在地球上的植物估计有50万种以上。植物可以在含有较多病原物的多种生境中存活，除了细胞壁的物理性防御、启动过敏防御反应(Hypersensitive response，HR)两种防御机制外，植物还依赖小分子量的植物抗菌多肽。作为植物防御反应的一个部分，植物会产生众多的毒素分子，其中就包括抗菌多肽。茶树(Camellia sinensis)，属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。一般为灌木，在热带地区也有乔木型茶树。茶叶为茶树的芽叶。长期以来人们对茶树的利用大多集中在茶叶中。自从1992年，茶叶对人的健康学研究方兴未艾。流行病学调查和现代药理学研究表明饮茶对人体健康具有积极作用，茶叶中含有的多酚、茶色素、黄酮类等物质具有明显的抗衰老、抗氧化、抗血脂、抑菌杀菌、抗过敏、防止动脉粥样化、抗辐射等方面具有重要的作用。在茶叶众多的医学上治疗活性中，抗菌活性最近十几年尤其受到重视，主要是因为感染性疾病模式的改变及抗药菌株的出现。由于多酚是茶叶中重要的成分，且多酚尤其是黄酮类对茶叶的生物活性发挥具有重要的作用，有关茶叶的抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤研究主要是围绕多酚，尤其是儿茶素开展的。EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)和ECG(表没食子儿茶素)是儿茶素中最具有抗细菌活力的两个成分。目前，国内外学者已经从植物中发现了许多具有新颖结构和抗菌活性的抗菌活性物质，比如皂苷、生物碱类、芳香类、甾体类、酚类和酚酸类等。从植物中分离纯化具有抗菌活力的植物抗菌多肽的研究也较多，但未见有从茶树中制备抗菌多肽、茶叶抗菌多肽对细菌的作用机制及应用的报道。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种茶叶抗菌多肽，克服目前尚未见从茶树中制备抗菌多肽的问题。

本发明的第二目的是提供上述茶叶抗菌多肽的制备方法。

本发明的第三目的是提供上述茶叶抗菌多肽的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种茶叶抗菌多肽，所述的茶叶抗菌多肽为分子量小于18.4kD的多肽。

二、一种根据上述的茶叶抗菌多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)蛋白提取液抽提蛋白；

(2)Tris平衡酚饱和溶液离心分层；

(3)醋酸铵-甲醇溶液沉淀蛋白；

(4)甲醇-丙酮洗涤蛋白沉淀；

(5)热处理；

(6)超滤处理。

进一步的，所述步骤(1)蛋白提取液抽提蛋白方法如下：称取茶叶10g，加入40mL蛋白提取液，其中包含0.7M蔗糖，0.1M NaCl，0.5M pH7.5的Tris-HCL，50mM EDTA-2Na，0.2％DTT，0.1％苯甲基磺酰氟，进行研磨匀浆。

进一步的，所述步骤(2)Tris平衡酚饱和溶液离心分层方法如下：向匀浆中补充蛋白提取液至100mL混匀，然后加入100mL pH8.0的Tris平衡酚饱和溶液，4℃混合30min，并多次混匀，然后4℃，5000g离心30min，收集上层液体。

进一步的，所述步骤(3)醋酸铵-甲醇溶液沉淀蛋白方法如下：在上层液体中加入5倍体积的预冷0.1M醋酸铵-甲醇溶液，-20℃放置过夜，以沉淀茶叶中的蛋白，然后4℃，12000g离心10min，收集沉淀。

进一步的，所述步骤(4)甲醇-丙酮洗涤蛋白沉淀方法如下：向沉淀中加入5倍体积的预冷甲醇以清洗，轻微混合；4℃，12000g离心10min，收集沉淀，重复一次；以丙酮代替甲醇重复上述步骤两遍，充分去除甲醇；4℃，12000g离心10min，收集沉淀。

进一步的，所述步骤(5)热处理方法如下：将沉淀冷冻干燥，干燥后的粉末溶解于100mL无菌双蒸水中，95℃水浴加热5min，然后在室温下12000g离心10min，取上清。

进一步的，所述步骤(6)超滤处理方法如下：将上清转移至10KD超滤离心管，4℃12000g离心15min，收集滤过液；滤过液转移到3KD超滤离心管，4℃12000g离心15min，再收集滤过液，滤过液即为制备的茶叶抗菌多肽。

三、上述的茶叶抗菌多肽在抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中的应用。

进一步的，上述的茶叶抗菌多肽在冷却肉防腐保鲜中的应用。

本发明采用常规的平板抑菌圈法测定了制备的茶叶抗菌多肽对细菌的抗菌活性；采用BCA法(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)检测制备的茶叶抗菌多肽浓度；利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测制备的茶叶抗菌多肽成分；使用紫外分光光度计检测茶叶抗菌多肽对细菌细胞膜通透性的影响；用磷钼酸测定试剂盒检测茶叶抗菌多肽对细菌离子泄漏的影响；利用电泳迁移率变动分析检测茶叶抗菌多肽与细菌基因组DNA结合能力；采用透射电子显微镜检测茶叶抗菌多肽处理细菌后的细胞微观结构变化；通过对微生物生长情况和pH变化两个指标的检测。来评价茶叶抗菌多肽对冷却肉防腐保鲜效果。

本发明制备的茶叶抗菌多肽制品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等细菌具有抗菌活性。茶叶抗菌多肽制品处理细菌后可造成细菌细胞膜通透性增加，引起细菌细胞外离子浓度增加，并且可造成细菌细胞膜不完整、出现破损，出现明显的细胞内物质泄露，导致细菌死亡。茶叶抗菌多肽制品不与细菌基因组DNA结合。茶叶抗菌多肽制品可以抑制冷却肉表面微生物的生长，延缓pH值上升，延长冷却肉的货架期，对冷却肉具有防腐保鲜作用。

采用上述技术方案的积极效果：本发明具有材料来源丰富、天然、易于被大众接受等优点；所制备的茶叶抗菌多肽制品具有天然、纯度高、抗菌活性好等特点；该制品主要包含分子量小于18.4kD的多肽成分，对金黄色葡萄球菌抗菌效果与天然生物活性抗菌肽Nisin相当，对大肠杆菌抗菌活性要优于Nisin；与传统抗生素相比，该制品主要是通过作用于没有特异性受体的细胞膜的作用机制来抑杀细菌，因此不会诱导微生物对其产生抗性；在冷却肉的防腐保鲜效果上，制备的茶叶抗菌多肽制品与Nisin效果也相当，均可延长冷却肉的货架期；本发明制备方法可规模化工厂化生产，生产周期短，成本较低，制品得率较高，且不受外在环境得到影响。

附图说明

图1是茶叶抗菌多肽SDS-PAGE电泳检测，1：10KD超滤离心管截留茶叶蛋白；2：3KD超滤离心管截留茶叶蛋白；3：制备的茶叶抗菌多肽；

图2是标准品曲线；

图3是茶叶抗菌多肽对细菌细胞膜通透性的影响；

图4是茶叶抗菌多肽对细菌磷离子泄露的影响；

图5是琼脂糖凝胶电泳迁移率变动分析，A:CK；1:茶叶抗菌多肽处理；

图6是茶叶抗菌多肽处理对金黄色葡萄球菌形态的影响，A:CK；B:茶叶抗菌多肽处理，标尺(右下角白色线条)：200nm；

图7是茶叶抗菌多肽处理对冷却肉pH的影响；

图8是茶叶抗菌多肽处理对冷却肉微生物生长的影响。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明茶叶抗菌多肽的制备。

按照下述步骤进行茶叶抗菌多肽的制备：

(1)称取茶叶(龙井茶)10g，加入40mL蛋白提取液(0.7M蔗糖，0.1M NaCl，0.5MTris-HCL(pH7.5)，50mM EDTA-2Na，0.2％DTT，0.1％苯甲基磺酰氟)，进行匀浆研磨；

(2)补充蛋白提取液至100mL混匀，加入100mL的Tris平衡酚饱和溶液(pH8.0)，4℃混合30min，并多次混匀；

(3)4℃，5000g离心30min，收集上层液体，加入5倍体积的预冷0.1M醋酸铵-甲醇溶液沉淀茶叶中的蛋白，-20℃过夜沉淀；

(4)4℃，12000g离心10min，收集沉淀，加入5倍体积的预冷甲醇以清洗，轻微混合；4℃，12000g离心10min，收集沉淀，重复一次；以丙酮代替甲醇重复上述步骤两遍，充分去除甲醇；4℃，12000g离心10min，收集沉淀；

(5)沉淀冷冻干燥，将干燥后的粉末溶解于100mL无菌双蒸水中，95℃水浴加热5min，然后在室温下12000g离心10min，取上清；

(6)将上清转移至10KD超滤离心管，4℃12000g离心15min，分别收集滤膜截留蛋白液和滤过液。滤液转移到3KD的超滤离心管中，4℃12000g离心15min，分别收集滤膜截留蛋白液和滤过液，滤过液即为制备的茶叶抗菌多肽，制备的茶叶抗菌多肽制品为浅黄色液体。

实施例2

本实施例说明茶叶抗菌多肽电泳检测。

利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测制备的茶叶抗菌多肽成分。具体如下：按配方分别配好12％分离胶(ddH₂O 2.2mL，40％丙烯酰胺1.5mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.25mL，APS 25μL，TEMED 3μL)与5％浓缩胶(ddH₂O 1.3mL，40％丙烯酰胺0.2mL，0.5MTris-HCl(pH 6.8)0.5mL，APS 20μL，TEMED 2μL)。待胶聚合后，将8μL样本与2μL上样缓冲液混合后95℃水浴加热5min，按顺序点在点样孔中。打开电源，电压调到80v，待跑过浓缩胶后将电压调至120v直至跑至胶底部为止。电泳缓冲液为25mM Tris、192mM甘氨酸和0.1％SDS。电泳结束后将凝胶小心取下，加入0.1％马斯亮蓝R-250染色液，放在摇床上摇2～3个小时。待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液(醋酸100mL，乙醇50mL，去离子水补足至1L)，振荡过夜脱色。提取、纯化的茶叶抗菌多肽电泳结果如图1所示。可以看出制备的茶叶抗菌多肽分子量均小于25kD，主要是分子量小于18.4kD的多肽。

实施例3

本实施例说明茶叶抗菌多肽浓度测定。

用BCA法(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)检测制备的茶叶抗菌多肽浓度。以BSA作为标准品，利用灭菌水配制不同浓度的BSA标准蛋白液(0、0.025、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL)。每个浓度取100μL标准蛋白液，加入2mL BCA工作液(100mL 1％BCA二钠盐，2mL 4％CuSO₄)，37℃下孵育30分钟，利用紫外可见分光光度计(SOPTOP，上海舜宇恒平)检测562nm波长吸收值，每个浓度重复3次。依据测定值制作标准品曲线(如图2)。测定制备的茶叶抗菌多肽在562nm波长吸收值为0.37。依据标准品曲线计算出的制备的茶叶抗菌多肽浓度为0.52mg/mL。

实施例4

本实施例说明茶叶抗菌多肽活性测定。

通过平板抑菌圈法测定茶叶抗菌多肽对细菌的抗菌活性。选取供试细菌分别为，革兰氏阳性细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(CGMCC保藏号：1.8721)，革兰氏阴性细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)(CGMCC保藏号：1.8723)。两种细菌均从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得。使用LB培养基培养以上细菌：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L。细菌的培养条件：37±1℃，220rpm，置于恒温摇床中培养。

将-80℃保藏的细菌在冰浴上解冻，然后选用LB培养基置于37℃，220转/min条件下用恒温摇床培养过夜，待细菌长至对数生长期。用LB培养基稀释细菌稀释至浓度为OD₆₀₀为0.3的菌悬液。取灭菌的LB固体培养基(琼脂粉15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L)20mL，冷却至50℃，加入30μL OD₆₀₀为0.3的菌悬液，迅速摇匀后倒入直径9cm的一次性培养皿中，待培养基完全凝固后在平板上打直径4mm孔，每孔加入待测样品100μL。待样品完全扩散到平板后37℃培养24h。茶叶抗菌多肽浓度为100μg/mL，阳性对照Nisin浓度为100μg/mL，阴性对照组为加入100μL无菌双蒸水。

茶叶抗菌多肽对2种供试细菌的抗菌活性大小见表1。从表中结果中我们可以看出，茶叶抗菌多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在10-15mm之间，对大肠杆菌的抑菌圈直径在5-10mm之间。

表1 茶叶抗菌多肽对细菌的抗菌活性

实施例5

本实施例说明茶叶抗菌多肽对细菌细胞膜通透性的影响。

金黄色葡萄球菌S.aureus是人类的一种重要病原菌，可引起许多严重感染，也是食品中重要的病原微生物。选用金黄色葡萄球菌来检测制备的茶叶抗菌多肽对细菌细胞膜通透性的影响。将活化好的金黄色葡萄球菌置于37℃，220转/min条件下用恒温摇床培养过夜，待细菌生长至对数生长期后1000×g离心10min，弃培养基，用PBS(pH 7.4，NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄ 10mM，KH₂PO₄ 2mM)重新悬浮使菌体至终浓度为1×10⁵CFU/mL。分别用终浓度为100μg/mL的抗菌多肽及Nisin处理重新悬浮的菌液，37℃分别培养至0h、0.5h、1h、2h、4h、8h。阴性对照组(CK)为PBS分别处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h的菌液，阳性对照为终浓度2mg/mL的Triton X-100处理的悬浮菌液。将培养后的细菌菌液使用0.22μm水系针筒过滤器过滤，收集滤液。使用紫外分光光度计测量过滤液在260nm下的吸光度，分光光度计用经水系滤膜过滤后的PBS较零。用下述公式计算抗菌肽对细胞膜渗透率：

细胞膜渗透率(％)＝(OD_肽-OD_CK)/(OD_T-OD_CK)×100％

其中OD_肽为茶叶抗菌多肽处理细菌后过滤滤液的吸光度，OD_CK为PBS处理细菌后过滤滤液的吸光度，OD_T为Triton X-100处理细菌后过滤滤液的吸光度。

图3为茶叶抗菌多肽对细菌细胞膜渗透率的影响。从图可以看出经茶叶抗菌多肽及Nisin处理的金黄色葡萄球菌，均可造成细菌细胞膜通透性增加。用茶叶抗菌多肽处理金黄色葡萄球菌8h后，细胞膜渗透率达到32.73％。Nisin处理金黄色葡萄球菌8h后，细胞膜渗透率达到49.88％。

实施例6

本实施例说明茶叶抗菌多肽对细菌离子泄漏的影响。

选用金黄色葡萄球菌检测制备的茶叶抗菌多肽对细菌磷离子(P)泄漏的影响。将活化好的金黄色葡萄球菌置于37℃，220转/min条件下用恒温摇床培养过夜，待细菌生长至对数生长期后1000×g离心10min，弃培养基，将沉淀的细胞用PBS重新悬浮至浓度为1×10⁵CFU/mL。用终浓度为100μg/mL的茶叶抗菌多肽处理重新悬浮的菌液，37℃分别培养至0h、2h、4h、8h。对照组用等量的无菌双蒸水代替茶叶抗菌多肽，Nisin作为茶叶抗菌多肽对照。将温育后的菌液1000×g离心10min，取上清液，用磷钼酸测定试剂盒(建成生物工程研究所，中国南京)测定上清液中细菌细胞外泄的无机磷酸盐的浓度。处理组每个时间段的细菌细胞外P离子浓度为测定的浓度减去对照组(即无菌双蒸水处理)胞外P离子浓度。

茶叶抗菌多肽和Nisin处理细菌后，均引起细菌细胞外P离子浓度增加(图4)。与对照组相比，用茶叶抗菌多肽处理金黄色葡萄球菌8h后，细菌细胞外的P离子浓度由从0.31mM增加到了13.34mM，而Nisin处理金黄色葡萄球菌8h后，细菌细胞外的无机磷酸盐浓度0.32mM增加到19.07mM。

实施例7

本实施例说明电泳迁移率变动分析。

选用金黄色葡萄球菌检测制备的茶叶抗菌多肽与细菌基因组DNA结合能力。使用细菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio)提取金黄色葡萄球菌的基因组DNA。所提取的DNA通过260nm和280nm处的光密度比(OD₂₆₀/OD₂₈₀)来评估提取的DNA纯度，通过在室温下测量260nm的吸光度来确定基因组DNA的浓度。提取的细菌基因组DNA保存于-20℃冰箱中。

为探讨茶叶抗菌多肽能否与细菌基因组DNA结合，用1000μg/mL茶叶抗菌多肽(5μL)与所提取的金黄色葡萄球菌细菌DNA(2500ng)(5μL)在室温下温育30min。加入2μL上样缓冲液后，通过在0.5×TBE缓冲液中使用0.8％琼脂糖凝胶(加入EB，终浓度5μg/L)在120v电压下进行电泳，电泳后使用凝胶成像系统在UV照射下进行拍照观察DNA的迁移速率，分析DNA在凝胶中阻滞情况。从图5可以看出，在1000μg/mL的浓度下，茶叶抗菌多肽处理的金黄色葡萄球菌基因组DNA并未发生电泳阻滞现象，与CK电泳情况一致，表明茶叶抗菌多肽并未能与金黄色葡萄球菌基因组DNA发生结合。

实施例8

本实施例说明透射电子显微镜的实验结果。

在透射电子显微镜(TEM)下，观察与正常细菌细胞相比，用茶叶抗菌多肽处理细菌后的细胞微观结构变化。将活化好的金黄色葡萄球菌细菌置于37℃，200r/min条件下用恒温摇床培养过夜，待菌长至对数生长期。取1mL菌液加入100μg/mL的茶叶抗菌多肽，37℃下温育2h。低速离心至管底可以看到绿豆大小的细胞团块，弃去培养液，加入电镜固定液4℃固定2-4h。用1％琼脂糖包裹，用PBS漂洗3次，每次15min。1％的锇酸·磷酸缓冲液(pH 7.4)室温固定2h，再用PBS漂洗3次，每次15min。细菌细胞依次进入50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％酒精-100％丙酮-100％丙酮上行脱水，每次15min。使用丙酮，812包埋剂混合液(比例1:1)处理2-4h，再更换丙酮，812包埋剂混合液(比例1:2)渗透过夜，最后用纯812包埋剂处理5-8h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后在烤箱中37℃过夜，再在烤箱中60℃聚合48h。最后用超薄切片机制成60-80nm超薄切片，用2％醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15min(铀铅双染色)，切片室温干燥过夜。最后在透射电子显微镜HT-7700(日本Hitachi)下观察样品，采集图像并进行分析。

通过透射电子显微镜(TME)对茶叶抗菌多肽处理细菌2h后细菌的形态变化情况进行了分析。由图6中可以看出未经茶叶抗菌多肽处理的金黄色葡萄球菌细胞结构完整，细胞膜完整、清晰可见，同时细胞内内容物充实，电子密度均匀。用1×MIC的茶叶抗菌多肽处理细菌2h后，细菌细胞膜某些部分不完整，出现了轻微的破损，发生了明显的细胞内物质泄露的情况。

实施例9

本实施例说明茶叶抗菌多肽对冷却肉防腐保鲜的效果实验。

从沃尔玛超市购买新鲜冷却肉，冰浴上放置，在超净工作台内进行分割，随机分为3组，每个处理重复3次。将分割好的冷却肉分别浸泡在以下处理对应的处理液体中：①CK(无菌双蒸水)；②茶叶抗菌多肽(100μg/mL)；③Nisin(100μg/mL)。处理5min，在无菌环境下将各组肉沥干，然后放于已经灭菌的一次性塑料碗中，置于4℃冷柜中，保存至12d。每3d检测各处理组冷却肉微生物生长情况和pH变化。

(1)pH测定

在超净工作台内进行无菌操作，将10g茶叶抗菌多肽处理和未处理过的冷却肉用灭菌的手术剪刀剪碎放于含有100mL无菌双蒸水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇后用灭菌纱布过滤。用pH计测定溶液pH值。每个处理重复三次。

按照GB 5009.237—2016中pH评价标准，pH值在一定程度上可以反映肉品的鲜度，一般认为，pH值5.8～6.2为一级鲜肉，pH值在6.3～6.6为二级鲜肉，pH值＞6.7为变质肉。由图7可知，在4℃的冷藏条件下，各组处理的冷却肉的pH随着冷却肉的保存时间延长而上升。在0d时，茶叶抗菌多肽、Nisin处理和CK的冷却肉的pH值分别为6.03、6.08和6.13，均低于6.2，属于一级鲜肉的范畴。随着贮存期延长，各处理的pH值均呈增长的趋势。CK在第3d时pH为6.69，介于二级鲜肉和变质肉之间，6d后，pH均大于6.7，肉已变质。Nisin处理组在9d内的pH未超过6.7，在12d时达7.03，已经变质。茶叶抗菌多肽也有类似的保鲜效果，其处理组在第9d的pH为6.61，未超过6.7，在第12d时为7.20，已经变质。这表明茶叶抗菌多肽可以抑制冷却肉表面微生物的生长，减慢蛋白质与氨基酸降解形成氨类等碱性物质的速度，从而延缓pH值上升。从防腐保鲜时间上比较，与无菌双蒸水处理(CK)相比，茶叶抗菌多肽可显著延缓冷却肉变质，防腐保鲜时间多达6天，与Nisin处理处理效果相当。

(2)微生物生长分析

采用如下方法对微生物生长进行测定：无菌操作，将25g冷却肉剪碎放于盛有225mL已灭菌PBS的灭菌玻璃瓶内(瓶内预先放置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇或研磨，灭菌纱布过滤，将滤液制成不同浓度梯度稀释液。将1mL稀释液加入无菌培养皿(90mm×15mm)内，每个稀释度做两个培养皿；将15mL冷却至46℃左右的营养肉汁琼脂培养基注入培养皿，并转动培养皿使混合均匀；同时将同等体积的营养肉汁琼脂培养基倾入加有1mL PBS的培养皿内作空白对照。待琼脂凝固后，倒置培养皿，置37℃±1℃培养箱内培养48h，记录菌落数。菌落总数以常用对数表示lg CFU/g。实验重复3次。

冷却肉的变质与微生物的滋生密切相关，菌落总数是评价冷却肉鲜度和品质的重要指标之一。一般情况下，菌落总数＜4lg CFU/g为一级鲜肉，菌落总数在4lg CFU/g～6lgCFU/g为二级鲜肉，菌落总数＞6lg CFU/g为变质肉。图8是冷却肉经过不同的处理后在整个冷藏期内菌落总数的变化情况。在4℃的冷藏下，随着时间的延长，所有的处理的菌落数都呈现了逐渐上升的形势，但茶叶抗菌多肽处理与无菌双蒸水处理(CK)之间呈现差异性。从图中可以看出，CK即无菌双蒸水处理，在0d时菌落数(lg CFU/g)为3.30，属于一级鲜肉；3d时菌落数为5.05，属于二级鲜肉；而在第6d，菌落数为6.19，表明肉已变质。茶叶抗菌多肽处理组在3d内菌落数为低于4，属于一级鲜肉；在9d内的菌落数均未超过6，仅在12d时达7.37，已经开始变质。Nisin处理也有类似的保鲜效果。这说明茶叶抗菌多肽可明显抑制冷却肉中微生物的生长，从而延缓冷却肉变质，达到防腐保鲜的效果。从防腐保鲜时间上比较，与无菌双蒸水处理(CK)相比，茶叶抗菌多肽可显著延缓冷却肉变质，防腐保鲜时间多达6天，与Nisin处理处理效果相当。

依据以上冷却肉微生物生长情况和pH变化两个指标，综合评价，茶叶抗菌多肽可显著延缓冷却肉变质，达到防腐保鲜的效果，其效果与天然生物活性抗菌肽Nisin相当。

本发明具有材料来源丰富、天然、易于被大众接受等优点；所制备的茶叶抗菌多肽制品具有天然、纯度高、抗菌活性好等特点；该制品主要包含分子量小于18.4kD的多肽成分，对金黄色葡萄球菌抗菌效果与天然生物活性抗菌肽Nisin相当，对大肠杆菌抗菌活性要优于Nisin；与传统抗生素相比，该制品主要是通过作用于没有特异性受体的细胞膜的作用机制来抑杀细菌，因此不会诱导微生物对其产生抗性；在冷却肉的防腐保鲜效果上，制备的茶叶抗菌多肽制品与Nisin效果也相当，均可延长冷却肉的货架期；本发明制备方法可规模化工厂化生产，生产周期短，成本较低，制品得率较高，且不受外在环境得到影响。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims

1.一种茶叶抗菌多肽在抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌或者在冷却肉防腐保鲜中的应用，其特征在于：该茶叶抗菌多肽的制备方法包括以下步骤：

（1）蛋白提取液抽提蛋白；

（2）Tris平衡酚饱和溶液离心分层；

（3）醋酸铵-甲醇溶液沉淀蛋白；

（4）甲醇-丙酮洗涤蛋白沉淀；

（5）热处理；

（6）超滤处理；

所述步骤（1）蛋白提取液抽提蛋白方法如下：称取茶叶10 g，加入40 mL蛋白提取液，其中包含0.7 M蔗糖，0.1 M NaCl，0.5 M pH7.5的Tris-HCL，50 mM EDTA-2Na，0.2% DTT，0.1%苯甲基磺酰氟，进行研磨匀浆；

所述步骤（2）Tris平衡酚饱和溶液离心分层方法如下：向匀浆中补充蛋白提取液至100mL混匀，然后加入100 mL pH8.0的Tris平衡酚饱和溶液，4℃混合30 min，并多次混匀，然后4℃，5000 g离心30 min，收集上层液体；

所述步骤（3）醋酸铵-甲醇溶液沉淀蛋白方法如下：在上层液体中加入5倍体积的预冷0.1 M醋酸铵-甲醇溶液，-20℃放置过夜，以沉淀茶叶中的蛋白，然后4℃，12000 g离心10min，收集沉淀；

所述步骤（4）甲醇-丙酮洗涤蛋白沉淀方法如下：向沉淀中加入5倍体积的预冷甲醇以清洗，轻微混合；4℃，12000 g离心10 min，收集沉淀，重复一次；以丙酮代替甲醇重复上述步骤两遍，充分去除甲醇；4℃，12000 g离心10 min，收集沉淀；

所述步骤（5）热处理方法如下：将沉淀冷冻干燥，干燥后的粉末溶解于100 mL 无菌双蒸水中，95℃水浴加热5 min，然后在室温下12000 g离心10 min，取上清；

所述步骤（6）超滤处理方法如下：将上清转移至10 KD超滤离心管，4℃ 12000 g 离心15 min，收集滤过液；滤过液转移到3 KD超滤离心管，4℃ 12000 g 离心15 min，再收集滤过液，滤过液即为制备的茶叶抗菌多肽。