CN112912491A - 用于基于细胞的疗法或治疗的测定 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供用于确定基于细胞的疗法或治疗的效能的体外方法。在替代实施方案中，提供用于确定基于细胞的疗法或治疗(包括用于治疗视网膜变性的那些疗法或治疗)的效能的组合物，包括制品及试剂盒；以及方法，包括(或包括使用)定量体外测定。

Description

用于基于细胞的疗法或治疗的测定
技术领域
相关申请
本申请案主张2018年9月27日申请的美国临时申请案第62/737,359号的优先权及权益，其内容以全文引用的方式并入本文中。
本发明大体上关于基于细胞的测定及疗法。在替代实施方案中，提供用于确定基于细胞的疗法或治疗(包括用于治疗视网膜变性的那些疗法或治疗)的效能的组合物，包括制品及试剂盒；以及方法，包括(或包括使用)定量体外测定。
背景技术
视网膜变性指由视网膜中感光细胞的进展性及不可逆衰退及死亡所引起的退化或变性。感光细胞的死亡可引起失明。已考虑将干细胞及其他多能细胞用于治疗患有视网膜变性的患者且干细胞及其他多能细胞可自多种来源分离，包括胚胎组织、成人大脑、基因操控真皮纤维母细胞及甚至视网膜。然而，测试这些基于细胞的疗法及治疗，更一般地关于广泛多种疾病(包括癌症及自体免疫病状)的基于细胞的疗法及治疗仍然困难的，因为在人体或模型生物体中活体内测定成本高、耗时且通常缺少定量结果。因此，本领域中需要稳固、低本高效、节约时间且定量的体外测定，用于确定基于细胞的疗法或治疗的效能，包括用于视网膜变性的那些疗法或治疗。
发明内容
本公开内容提供一种用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能的方法，所述方法包括以下步骤：用毒性化合物及条件培养基(conditioned media)培育第一多个细胞，其中所述条件培养基包括用于培养基于细胞的疗法或治疗的培养基；用毒性化合物及对照培养基培育至少第二多个细胞；确定第一多个细胞及至少第二多个细胞的生活力；及比较第一多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力，从而确定基于细胞的疗法或治疗的效能。效能可为第一多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力的比率。
本公开内容提供一种用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能的方法，所述方法包括以下步骤：用毒性化合物及条件培养基培育第一多个细胞，其中所述条件培养基包括用于培养基于细胞的疗法或治疗的培养基；用毒性化合物及对照培养基培育至少第二多个细胞；确定第一多个细胞及至少第二多个细胞的生活力；确定第一多个细胞及至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性；确定第一多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为第一多个细胞的生活力与第一多个细胞中的细胞凋亡活性的比率；确定至少第二多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为至少第二多个细胞的生活力与至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性的比率；及确定基于细胞的疗法或治疗的效能，其中效能为第一多个细胞的倍数变化保护值与至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率。
前述方法可进一步包括比较基于细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值(predetermined cutoff value)，其中如果效能大于预定截止值，则基于细胞的疗法或治疗被鉴定为具有足够的效能以施用至个体。
前述方法可进一步包括：比较基于细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值；及当效能大于预定截止值时向有需要的个体施用至少一种治疗上有效剂量的细胞疗法或治疗。
预定截止值可为约2。
基于细胞的疗法或治疗可包括视网膜祖细胞(retinal progenitor cell，RPC)、视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)、ARPE-19细胞、神经干/祖细胞、间充质干细胞、CD34+细胞、干/祖细胞、白细胞、纤维母细胞或其任何组合。基于细胞的疗法或治疗包括RPC。
第一多个细胞及至少第二多个细胞可包括视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、ARPE-19细胞、穆勒(Müller)细胞源性细胞、MIO-M1细胞、神经元细胞、胶细胞(glial cell)、纤维母细胞、非眼细胞或其任何组合。第一多个细胞及至少第二多个细胞可包括RB细胞。在至少约10μl至至少约40μl的培养基中第一多个细胞及至少第二多个细胞可包括至少约1,000个RB细胞至至少约250,000个RB细胞。在至少约25μl培养基中第一多个细胞及至少第二多个细胞可包括至少约25,000个RB细胞。
第一多个细胞及至少第二多个细胞可分别用至少约50μl至至少约100μl的条件培养基及对照培养基培育。第一多个细胞及至少第二多个细胞可分别用至少约75μl的条件培养基及对照培养基培育。
毒性化合物可诱发细胞凋亡。毒性化合物可为丁酸钠。丁酸钠可以约2mM至约32mM的浓度存在。丁酸钠可以约16mM的浓度存在。
第一多个细胞及至少第二多个细胞可培育至少约1小时至至少约72小时的时间段。第一多个细胞及至少第二多个细胞可培育至少约46小时的时间段。
确定第一多个细胞及至少第二多个细胞的生活力可包括测量第一多个细胞及至少第二多个细胞的代谢能力。代谢能力可使用基于荧光的测定测量。
基于荧光的测定可包括：用刃天青(7-羟基-3H-酚噁嗪-3-酮10-氧化物钠盐)培育第一多个细胞及至少第二多个细胞至少约1小时的时段；及测量第一多个细胞及至少第二多个细胞的荧光。基于荧光的测定可为
Figure BDA0003019650680000031
Figure BDA0003019650680000032
细胞生活力测定。可将至少约20μl的1:4稀释的
Figure BDA0003019650680000033
试剂添加至第一多个细胞及添加至至少第二多个细胞。
第一多个细胞及至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性可使用基于发光的测定测量。基于发光的测定可包括：用致发光(luminogenic)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7底物培育第一多个细胞及至少第二多个细胞至少约1小时；及测量第一多个细胞及至少第二多个细胞的发光。致发光半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7可包括通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7裂解的四肽序列DEVD，从而产生荧光素酶底物荧光素酶底物。基于发光的测定可为
Figure BDA0003019650680000034
3/7测定系统。可将至少约120μl的
Figure BDA0003019650680000041
3/7测定试剂添加至第一多个细胞及添加至至少第二多个细胞。
前述方法可进一步包括：用毒性化合物及无活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述无活性条件培养基包括用于培养基于无活性细胞的疗法或治疗的培养基；确定至少第三多个细胞的生活力；确定至少第三多个细胞中的细胞凋亡活性；及确定至少第三多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为生活力与细胞凋亡活性的比率；及确定基于无活性细胞的疗法或治疗的效能，其中效能为至少第三多个细胞的倍数变化保护值与至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率；及比较基于无活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果基于无活性细胞的疗法的效能低于或等于预定截止值，则所述方法鉴定为有效的。
前述方法可进一步包括：用毒性化合物及无活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述无活性条件培养基包括用于培养基于无活性细胞的疗法或治疗的培养基；确定至少第三多个细胞的生活力；比较第三多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力，从而确定基于无活性细胞的疗法或治疗的效能；及比较基于无活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果基于无活性细胞的疗法的效能低于或等于预定截止值，则所述方法鉴定为有效的。
基于无活性细胞的疗法或治疗可包括皮肤T淋巴细胞、HuT 78细胞或其任何组合。
前述方法可进一步包括：用毒性化合物及活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述活性条件培养基包括用于培养基于活性细胞的疗法或治疗的培养基；确定至少第三多个细胞的生活力；确定至少第三多个细胞中的细胞凋亡活性；确定至少第三多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为生活力与细胞凋亡活性的比率；确定基于活性细胞的疗法或治疗的效能，其中效能为至少第三多个细胞的倍数变化保护值与至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率；及比较基于活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果基于活性细胞的疗法的效能大于预定截止值，则所述方法鉴定为有效的。
前述方法可进一步包括：用毒性化合物及活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述活性条件培养基包括用于培养基于活性细胞的疗法或治疗的培养基；确定至少第三多个细胞的生活力；比较第三多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力，从而确定基于活性细胞的疗法或治疗的效能；及比较基于活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果基于活性细胞的疗法的效能大于预定截止值，则所述方法鉴定为有效的。
基于活性细胞的疗法可包括视网膜色素上皮细胞(RPE)、ARPE-19细胞、纤维母细胞、CCD-1112Sk细胞或其任何组合。
对照培养基可包括标准培养基。基于细胞的疗法或治疗用于治疗视网膜疾病或病况。
提供用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能或功效的方法，所述方法包括以下步骤：1)用候选化合物及基于细胞的疗法或治疗培育第一多个细胞；2)用候选化合物培育第二多个细胞；3)确定第一多个细胞的生活力及/或代谢活性；4)确定第二多个细胞的生活力及/或代谢活性；及5)比较第一多个细胞的生活力及/或代谢活性与第二多个细胞的生活力及/或代谢活性，从而确定治疗的效能。在一些方面中，第一多个细胞与第二多个细胞基本上相同。
第一多个细胞及第二多个细胞可包括相同细胞类型。作为非限制性实例，细胞类型可为人类视网膜母细胞瘤细胞。
第一多个细胞及第二多个细胞可各自包括约1,000个至约250,000个的细胞(例如，约1,000；25,000；50,000；75,000；100,000；125,000；150,000；175,000；200,000；225,000；或250,000)。在一些非限制性实例中，第一多个细胞及第二多个细胞可各自包括约25,000个细胞。
基于细胞的疗法或治疗可包括条件培养基。条件培养基可通过收集用于培养第三多个细胞的培养基制得。第三多个细胞可包括哺乳动物视网膜祖细胞。哺乳动物视网膜祖细胞可为人类视网膜祖细胞。第三多个细胞可包括0.1×106个至1×107个的人类视网膜祖细胞(例如0.1×106、0.2×106、0.3×106、0.4×106、0.5×106、0.6×106、0.7×106、0.8×106、0.9×106、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106或1×107个细胞)。在一些非限制性实例中，第三多个细胞可包括约9×106个人类视网膜祖细胞。
在其他实施方案中，第三多个细胞包括人类视网膜色素上皮细胞(human retinalpigment epithelial cell，hRPE)(参见例如图8)。
如本文所用，术语“候选化合物”可指毒性化合物、半毒性化合物或类似者。作为非限制性实例，毒性化合物可诱发细胞凋亡。毒性化合物可为丁酸钠。丁酸钠可以约0mM至26mM的量存在(例如约0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26mM)。在一些非限制性实例中，丁酸钠可以约8mM的量存在。
第一多个细胞及第二多个细胞可培育至少1小时、或至少12小时、或至少24小时、或至少48小时、或至少72或更多个小时的时段。第一多个细胞及第二多个细胞可培育约2小时。
确定第一多个及第二多个细胞的生活力可包括测量第一多个细胞及第二多个细胞的代谢能力。第一多个细胞及第二多个细胞的代谢能力可使用基于荧光的测定测量。
基于荧光的测定可包括：1)用刃天青(7-羟基-3H-酚噁嗪-3-酮10-氧化物钠盐)培育第一多个细胞及第二多个细胞至少1小时的时段；2)测量第一多个细胞及第二多个细胞的荧光；及3)比较所测量的荧光，从而确定第一多个细胞及第二多个细胞的生活力。
以上方面中的任一者可与任何其他方面组合。
本发明的一或多个例示性实施方案的详情阐述于附图及以下描述中。本发明的其他特征、目标及优势将根据说明书及附图及根据权利要求显而易知。
本文所引用的所有出版物、专利及专利申请均明确地以引用的方式并入本文中用于所有目的。
附图简单说明
当结合附图时，以上及其他特征将根据以下描述而更清楚地理解。
图1说明展示用于本公开内容的方法中的基于荧光的细胞生活力测定的结果的一系列图表。
图2图解说明展示如使用本公开内容的方法所测量的在各种浓度的丁酸钠下人类视网膜母细胞条件培养基(human retinal progenitor cell conditioned medium，hRPCCM)的效能的一系列条形图。每组中的蓝色或第一条形对应于在标准培养基(standardmedium，sM)中培育的细胞而每组中的橙色或第二条形对应于在hRPC CM中培育的细胞。
图3图解说明展示如使用本公开内容的方法测量的在各种浓度的丁酸钠下hRPCCM的效能的一系列条形图。每组中的蓝色或第一条形对应于在SM中培育的细胞而每组中的橙色或第二条形对应于在hRPC CM中培育的细胞。
图4图解说明展示如使用本公开内容的方法所测量的hRPC CM的各种稀释液的效能的条形图。每组中的青色或第一条形对应于在SM中培育的细胞。每组中的灰色或第二条形对应于在未稀释的hRPC CM中培育的细胞。每组中的黄色或第三条形对应于在2倍稀释的hRPC CM中培育的细胞。每组中的深蓝色或第四条形对应于在4倍稀释的hRPC CM中培育的细胞。每组中的绿色或第五条形对应于在8倍稀释的hRPC CM中培育的细胞。
图5图解说明展示如使用本公开内容的方法所测量使用不同量的人类视网膜祖细胞(hRPC)产生的hRPC CM的效能的条形图。每组中的青色或第一条形对应于在SM中培育的细胞。每组中的橙色或第二条形对应于在使用9.0×106个hRPC产生的hRPC CM中培育的细胞。每组中的灰色或第三条形对应于在使用6.0×106个hRPC产生的hRPC CM中培育的细胞。
图6图解说明展示如使用本公开内容的方法所测量的来自不同群体的hRPC产生的hRPC CM的效能的一系列条形图。在左侧图中，每组中的青色或第一条形对应于用SM培育的细胞；橙色或第二条形为用来自批次G1的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；灰色或第三条形对应于用自来自批次G2的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；每组中的黄色或第四条形对应于用使用来自批次G3的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；及每组中的深蓝色或第五条形对应于用使用来自批次G5的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞。在右侧图中，每组中的青色或第一条形对应于用SM培育的细胞；橙色或第二条形为用自来自批次G1的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；灰色或第三条形对应于用自来自批次G2的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；每组中的黄色或第四条形对应于用使用来自批次G3的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；及每组中的深蓝色或第五条形对应于用使用来自批次G5的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞。
图7图解说明展示如使用本公开内容的方法所测量的来自不同群体的hRPC产生的hRPC CM的效能的条形图。每组中的青色或第一条形对应于用SM培育的细胞；橙色或第二条形为用自来自批次G1的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；灰色或第三条形对应于用自来自批次G2的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；每组中的黄色或第四条形对应于用使用来自批次G3的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；每组中的深蓝色或第五条形对应于用使用来自批次G4的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；每组中的绿色或第六条形对应于用使用来自批次G5的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；每组中的浅蓝色或第七条形对应于用使用来自批次L-SB的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞；及每组中的粉红或第八条形对应于用使用来自批次L-PB的hRPC产生的hRPC CM培育的细胞。
图8图解说明展示如使用本公开内容的方法所测量使用各种细胞类型产生的条件培养基的效能的一系列条形图。在左侧图中，每组中的蓝色或第一条形对应于在SM中培育的细胞；每组中的橙色或第二条形对应于在hRPC CM中培育的细胞；及每组中的黄色或第三条形对应于在使用人类视网膜母细胞瘤细胞产生的条件培养基中培育的细胞。在右侧图中，每组中的青色或第一条形对应于在SM中培育的细胞且每组中的绿色或第二条形对应于在使用人类视网膜色素上皮细胞产生的条件培养基中培育的细胞。
图9展示选择为hRPC的候选神经营养因子的所选细胞因子的基因表达数据。数据经由来自多个细胞类型的qPCR获得，包括(自左至右)hRPC、hRB、hRPE及hFB。视网膜细胞类型组分别来自纤维母细胞。hRB细胞系来源于肿瘤，所有其他细胞类型均来自胎儿组织。可见到假定的营养因子OPN的表达对于hRPC而言最高。
图10图解说明展示来自本公开内容的多重效能测定的结果的一系列附图。顶部左侧图展示所测量的细胞生活力。顶部右侧图展示所测量的凋亡活性。底部图展示使用顶部两个图中所展示的数据计算的效能值。
图11图解说明本公开内容测试未经过滤及经过滤条件培养基的多重效能测定的结果。
图12图解说明本公开内容的测试阴性对照条件培养基及阳性对照条件培养基的多重效能测定的结果。
图13图解说明本公开内容的测试来源于各批次的hRPC的条件培养基的多重效能测定结果。
图14图解说明本公开内容测试来源于具有不同接种密度的hRPC培养物的条件培养基的多重效能测定结果。
图15图解说明本公开内容测试条件培养基的各种稀释液的多重效能测定结果，指示多重效能测定展现响应的线性。
具体实施方式
最常见类型的遗传性视网膜疾病(营养不良)为色素性视网膜炎(retinitispigmentosa，RP)，且最常见退化疾病为年龄相关黄斑变性(age-related maculardegeneration，AMD)。潜在疗法包括将人类视网膜祖细胞(hRPC)用于治疗RP及将干细胞源性人类色素上皮(RPE)细胞产品用于治疗AMD。RP的治疗中hRPC的测试已指示治疗依赖于可能由多种细胞因子的混合物产生的神经营养功效。这些细胞因子的作用目前仅已部分叙述。因为预期制造的hRPC细胞产物的效能在批次之间可能变化，具有能够在用于患者之前预期性地测量给定批次的制造细胞产物的营养功效的简单且方便的体外效能测定将为有用的，而无需活体内测试及相关基础设施及人员要求。
评估hRPC治疗效能的现行方法为在皇家外科学院(Royal College of Surgeons，RCS)大鼠中活体内测试，皇家外科学院大鼠为常染色体隐性RP的充分表征模型。为执行这些测试，需要具有RCS菌落的饲养箱以及外科套房、电生理学套房及眼部组织学实验室，其均必须雇有具有这些领域中特定专项知识的相关人员。因此，现行活体内测试方法为繁琐、技术密集、劳力密集、时间密集且资源密集的。
已显现hRPC治疗的神经营养功效难以在体外系统中复制。举例而言，活体内观测到的治疗的营养功效似乎发生于感光器的层级上，其为对体外维持具有挑战性的细胞。在一个方面中，本公开内容的方法提供测量制造细胞产物的效能的手段，而无需在动物中及在人类中使用之前测试。本公开内容的方法在单日时程内可能仅需要使用细胞培养设施、适当数组的设备加一个有经验的技术员的劳动力。也需要易于获得的永生细胞系或人类肿瘤细胞系及多种其他易于获得的试剂。测试物为先前自特定治疗细胞类型的活培养物取得的细胞培养基的小样品。应注意测试设施无需涉及处置敏感细胞类型。因此，本公开内容的方法与现有活体内测定相比便宜、需要最少劳动力且具有时效性。本公开内容的方法将先前为需要特定团队的多月活体内过程减少成一天、一个技术员的体外过程。
本公开内容提供测量基于细胞的疗法或治疗的效能的方法。所述方法提供可用于确定基于细胞的疗法或治疗强力提高细胞群体的生活力的定量体外效能测定。因此，所述测定提供一种定量基于细胞的疗法或治疗的营养功效的效能的方法。在一个方面中，本公开内容的方法使用毒性化合物以向细胞群体提供代谢伤害以更好地检测基于细胞的疗法或治疗的营养功效的效能。在一个非限制性实例中，本公开内容的方法可用于测试宿主视网膜(尤其包括宿主视锥)上的供体胎儿视网膜细胞(视网膜祖细胞)的营养功效的效能。供体胎儿视网膜细胞已展示具有营养功效，所述营养功效不仅为神经保护性且也对残余宿主视网膜细胞具有迅速恢复功效，如由改善的视觉功能所确定。供体细胞能够整合至视网膜中且经由细胞分化代替感光器(可能以受限数量)。总体功效是在原本注定完全衰退使得患者全盲的视网膜中快速且可持续性恢复并临床上保留显著程度的视觉功能。
本公开内容提供用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能的体外方法，所述方法包括以下步骤：用毒性化合物及基于细胞的疗法或治疗培育第一多个细胞；用毒性化合物培育第二多个细胞；确定第一多个细胞的生活力；确定第二多个细胞的生活力；及比较第一多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力，从而确定治疗的效能。
本公开内容还提供一种用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能的方法，所述方法包括以下步骤：用毒性化合物及条件培养基培育第一多个细胞，其中条件培养基包括用于培养基于细胞的疗法或治疗的培养基；用毒性化合物及对照培养基培育至少第二多个细胞；确定第一多个细胞及至少第二多个细胞的生活力；及比较第一多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力，从而确定基于细胞的疗法或治疗的效能。
在前述方法的一些方面中，其中效能为第一多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力的比率。
在一些方面中，前述方法可进一步包括用毒性化合物及无活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述无活性条件培养基包括用于培养基于无活性细胞的疗法或治疗的培养基；确定至少第三多个细胞的生活力；比较第三多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力，从而确定基于无活性细胞的疗法或治疗的效能，比较基于无活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果基于无活性细胞的疗法的效能低于或等于预定截止值，则所述方法鉴定为有效的。不希望受理论所束缚，包括用于培养基于无活性细胞的疗法或治疗的培养基的无活性条件培养基为已知为非活性的条件培养基，将不保护第三多个细胞免于毒性化合物(例如丁酸钠)的有害影响，且因此不应具有高于某一预定值的效能值。因此，无活性条件培养基充当阴性对照——如果特定测定的结果指示无活性条件培养基具有低效能或无效能，则测定的结果可视为更精确。然而，如果特定测定的结果指示无活性条件培养基具有效能，则测定结果可为受损的且不反映所测试的基于细胞的治疗或疗法的实际效能。基于无活性细胞的疗法或治疗可包括皮肤T淋巴球、HuT 78细胞或其任何组合。
在一些方面中，前述方法可进一步包括：用毒性化合物及活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述活性条件培养基包括用于培养基于活性细胞的疗法或治疗的培养基；确定至少第三多个细胞的生活力；比较第三多个细胞的生活力与第二多个细胞的生活力，从而确定基于活性细胞的疗法或治疗的效能；比较基于活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果基于活性细胞的疗法的效能大于预定截止值，则所述方法鉴定为有效的。不希望受理论所束缚，包括用于培养基于活性细胞的疗法或治疗的培养基的活性条件培养基为已知为活性的条件培养基，将保护第三多个细胞免于毒性化合物(例如丁酸钠)的有害影响，且因此应具有高于某一预定值的效能值。因此，活性条件培养基充当阴性对照——如果特定测定的结果指示活性条件培养基具有低效能或无效能，则测定结果可为受损的且不反映所测试的基于细胞的治疗或疗法的实际效能。然而，如果特定测定的结果指示活性条件培养基具有效能，则结果可视为精确。基于活性细胞的疗法或治疗可包括视网膜色素上皮细胞(RPE)、ARPE-19细胞、纤维母细胞、CCD-1112Sk细胞或其任何组合。
本公开内容也提供一种用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能的方法，所述方法包括以下步骤：用毒性化合物及基于细胞的疗法或治疗培育第一多个细胞；用毒性化合物及对照培养基培育至少第二多个细胞；确定第一多个细胞及至少第二多个细胞的生活力；确定第一多个细胞及至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性；及确定第一多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为第一多个细胞的生活力与第一多个细胞中的细胞凋亡活性的比率；确定至少第二多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为至少第二多个细胞的生活力与至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性的比率；及确定基于细胞的疗法或治疗的效能，其中效能为第一多个细胞的倍数变化保护值与至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率。如本文所用，此方法称为“多重效能测定”。
本公开内容也提供一种用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能的方法，所述方法包括以下步骤：用毒性化合物及条件培养基培育第一多个细胞，其中条件培养基包括用于培养基于细胞的疗法或治疗的培养基；用毒性化合物及对照培养基培育至少第二多个细胞；确定第一多个细胞及至少第二多个细胞的生活力；确定第一多个细胞及至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性；及确定第一多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为第一多个细胞的生活力与第一多个细胞中的细胞凋亡活性的比率；确定至少第二多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为至少第二多个细胞的生活力与至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性的比率；及确定基于细胞的疗法或治疗的效能，其中效能为第一多个细胞的倍数变化保护值与至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率。如本文所用，此方法也称为“多重效能测定”。
前述方法可进一步包括比较基于细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果效能大于预定截止值，则基于细胞的疗法或治疗被鉴定为具有足够的效能以施用至个体。
前述方法可进一步包括：比较基于细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值；及当效能大于预定截止值时向有需要的个体施用至少一种治疗上有效剂量的细胞疗法或治疗。
前述方法可进一步包括：用毒性化合物及无活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中无活性条件培养基包括用于培养基于无活性细胞的疗法或治疗的培养基；确定至少第三多个细胞的生活力；确定至少第三多个细胞中的细胞凋亡活性；及确定至少第三多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为生活力与细胞凋亡活性的比率；及确定基于无活性细胞的疗法或治疗的效能，其中效能为至少第三多个细胞的倍数变化保护值与至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率；比较基于无活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果基于无活性细胞的疗法的效能低于或等于预定截止值，则所述方法鉴定为有效的。不希望受理论所束缚，包括用于培养基于无活性细胞的疗法或治疗的培养基的无活性条件培养基为已知为非活性的条件培养基，将不保护第三多个细胞免于毒性化合物(例如丁酸钠)的有害影响，且因此不应具有高于某一预定值的效能值。因此，无活性条件培养基充当阴性对照——如果特定测定的结果指示无活性条件培养基具有低效能或无效能，则测定的结果可视为更精确。然而，如果特定测定的结果指示无活性条件培养基具有效能，则测定结果可为受损的且不反映所测试的基于细胞的治疗或疗法的实际效能。基于无活性细胞的疗法或治疗可包括皮肤T淋巴细胞、HuT 78细胞或其任何组合。
在一些方面中，前述方法可包括：用毒性化合物及活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中活性条件培养基包括用于培养基于活性细胞的疗法或治疗的培养基；确定至少第三多个细胞的生活力；确定至少第三多个细胞中的细胞凋亡活性；确定至少第三多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为生活力与细胞凋亡活性的比率；确定基于活性细胞的疗法或治疗的效能，其中效能为至少第三多个细胞的倍数变化保护值与至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率；及比较基于活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果基于活性细胞的疗法的效能大于预定截止值，则所述方法鉴定为有效的。不希望受理论所束缚，包括用于培养基于活性细胞的疗法或治疗的培养基的活性条件培养基为已知为活性的条件培养基，将保护第三多个细胞免于毒性化合物(例如丁酸钠)的有害影响，且因此应具有高于某一预定值的效能值。因此，活性条件培养基充当阳性对照——如果特定测定的结果指示活性条件培养基具有低效能或无效能，则测定结果可为受损的且不反映所测试的基于细胞的治疗或疗法的实际效能。然而，如果特定测定的结果指示活性条件培养基具有效能，则结果可视为精确。基于活性细胞的疗法或治疗可包括视网膜色素上皮细胞(RPE)、ARPE-19细胞、纤维母细胞、CCD-1112Sk细胞或其任何组合。
在一些方面中，预定截止值可为约0.5、或约1.0、或约1.5、或约2.0、或约3.0、或约3.5、或约4.0、或约4.5、或约5.0、或约5.5、或约6.0、或约6.5、或约7.0、或约7.5、或约8.0、或约8.5、或约9.0、或约9.5、或约10、或约15、或约20、或约25、或约30、或约35、或约40、或约45、或约50、或约60、或约70、或约80、或约90、或约100。
在本公开内容的方法的一些方面中，基于细胞的疗法或治疗包括条件培养基。“条件培养基”指与标准、基本或基础培养基相比较有改变的培养基。培养基的调节可造成将分子(诸如养分及/或生长因子)添加至或耗尽基本培养基中所存在的原始水平。在一些方面中，培养基通过允许某些类型的细胞在某些条件下在培养基中生长或维持某一时间段而调节。在本公开内容的一些方面中，条件培养基通过收集用于培养第三多个细胞的培养基制得。在一非限制性实例中，第三多个细胞可包括哺乳动物视网膜祖细胞(RPC)、人类视网膜祖细胞(hRPC)、哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPE)、人类视网膜色素上皮细胞(hRPE)、ARPE-19细胞、神经干/祖细胞、间充质干细胞、CD34+细胞、干/祖细胞、白细胞、纤维母细胞或其任何组合。哺乳动物视网膜祖细胞可为人类视网膜祖细胞(hRPC)。第三多个细胞可包括hRPC。在一些方面中，培养基可通过允许视网膜祖细胞在限定温度下在具有限定组成的培养基中扩增、分化或维持限定小时数而调节。如本领域技术人员将了解，细胞、培养基类型、持续时间及环境条件的许多组合可用于产生接近无限数组的条件培养基。
在如本文所提供的方法的一些方面中，条件培养基可通过收集用于培养、扩增、分化或维持第三多个细胞的培养基制得，第三多个细胞包含1×106至1×107个的人类视网膜祖细胞。在其他方面中，第三多个细胞可包括约9×106个人类视网膜祖细胞。在一些方面中，第三多个细胞可包括约8×106个人类视网膜祖细胞。在一些方面中，第三多个细胞可包括约6×106个人类视网膜祖细胞。在一些方面中，第三多个细胞可包括约4×106个人类视网膜祖细胞。自人类视网膜祖细胞培养及产生条件培养基的方法描述于WO 2012/158910中，其以全文引用的方式并入本文中。在一些方面中，条件培养基可通过收集用于培养、扩增分化或维持第三多个细胞的培养基制得，第三多个细胞以至少约1×106个细胞、或至少约2×106个细胞、或至少约3×106个细胞、或至少约4×106个细胞、或至少约5×106个细胞、或至少约6×106个细胞、或至少约7×106个细胞、或至少约8×106个细胞、或至少约9×106个细胞、或至少约10×106个细胞的密度接种。在一些方面中，条件培养基可通过收集用于培养、扩增分化或维持第三多个细胞的培养基制得，第三多个细胞在接种后培养至少约4小时、或至少约8小时、或至少约12小时、或至少约16小时、或至少约20小时、或至少约24小时、或至少约36小时、或至少约48小时、或至少约60小时、或至少约72小时。
在本公开内容的方法的一些方面中，条件培养基可在用于本公开内容的测定之前过滤。在一些方面中，条件培养基可使用浓缩器或过滤装置与离心组合来过滤。在一些方面中，条件培养基可经由过滤器用至少约3kDa、或至少约10kDa、或至少约30kDa、或至少约50kDa、或至少约100kDa的MWCO过滤。在一些方面中，在过滤条件培养基后，可将“渗余物”或“顶部”级分分离以用于本公开内容的方法。在一些方面中，在过滤条件培养基后，可将“滤过物”或“底部”级分分离以用于本公开内容的方法。
在如本文所提供的方法的一些方面中，基于细胞的疗法或治疗包括哺乳动物视网膜祖细胞(RPC)、人类视网膜祖细胞(hRPC)、哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPE)、人类视网膜色素上皮细胞(hRPE)、ARPE-19细胞、神经干/祖细胞、间充质干细胞、CD34+细胞、干/祖细胞、白细胞、纤维母细胞或其任何组合。哺乳动物视网膜祖细胞可为人类视网膜祖细胞(hRPC)。基于细胞的疗法或治疗可包括hRPC。细胞可为经基因修饰细胞。在一非限制性实例中，经基因修饰细胞可已经基因转染以表达至少一种多肽。在一非限制性实例中，经基因修饰细胞可已通过使细胞与至少一种病毒颗粒接触而感染，其中病毒颗粒包含至少一种多核苷酸。
在如本文所提供的方法的一些方面中，基于细胞的疗法或治疗或条件培养基可包括外来体(exosome)及/或微泡。基于细胞的疗法或治疗或条件培养基可包括在外来体及/或微泡中富集的级分。外来体及/或微泡可来源于任何细胞类型，包括(但不限于)哺乳动物视网膜祖细胞(RPC)、人类视网膜祖细胞(hRPC)、哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPE)、人类视网膜色素上皮细胞(hRPE)、ARPE-19细胞、神经干/祖细胞、间充质干细胞、CD34+细胞、干/祖细胞、白细胞、纤维母细胞或其任何组合。细胞可为经基因修饰细胞。在一非限制性实例中，经基因修饰细胞可已经至少一种基因转染以表达至少一种多肽。在一非限制性实例中，经基因修饰细胞可已通过使细胞与至少一种病毒颗粒接触而感染，其中病毒颗粒包含至少一种多核苷酸。外来体及/或微泡或外来体及/或微泡中富集的级分可使用本领域中的外来体/微泡技术来纯化，包括(但不限于)离心、超速离心、尺寸排阻层析法、离子交换层析法、免疫亲和层析法或本领域中的任何其他技术标准。
在本公开内容的方法的一些方面中，对照培养基包括标准培养基。
在本公开内容的方法的一些方面中，基于细胞的疗法或治疗可用于治疗有需要的个体的视网膜疾病或病况。视网膜疾病或病况可包括(但不限于)尤希尔氏病(Usher'sdisease)、色素性视网膜炎(RP)、变性视网膜疾病、年龄相关黄斑变性(AMD)、湿AMD或干AMD、地图状萎缩、视网膜感光器病、糖尿病性视网膜病变、囊样黄斑部水肿、葡萄膜炎、视网膜剥离、视网膜损伤、黄斑孔、黄斑毛细管扩张、创伤或医原性视网膜损伤、神经节细胞或视神经细胞疾病、青光眼、眼神经病变、缺血性视网膜疾病(诸如早产儿视网膜病)、视网膜血管阻塞或缺血性视神经病变；或改善亮(日光)视觉；或改善校正视力、或改善黄斑功能、或改善视场、或改善暗(夜)视觉。
在前述方法的一些方面中，第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括相同细胞类型或可为不同细胞类型。第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括不同细胞类型的混合群体。细胞类型可为自生物样品分离的任何初代细胞及/或非永生细胞类型细胞(也即自多能/干细胞群体分化的细胞)。细胞类型可为任何永生化细胞系，包括(但不限于)自发永生化细胞。细胞类型可为哺乳动物视网膜母细胞瘤细胞(RB)、哺乳动物视网膜色素上皮细胞(RPE)、哺乳动物视网膜祖细胞(RPC)、ARPE-19细胞、穆勒细胞源性细胞、MIO-M1细胞、神经元细胞、胶细胞、纤维母细胞、非眼细胞或其任何组合。细胞类型可为人类视网膜母细胞瘤细胞(hRB)、人类视网膜色素上皮细胞或人类视网膜祖细胞。第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可在细胞培养期间于悬浮液中生长。第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可使用贴壁细胞培养方法来生长。
在本公开内容的方法的一些方面中，第一多个细胞及第二多个细胞可各自包括约1,000至约250,000个细胞。通过非限制性实例，第一多个细胞及第二多个细胞可各自包括约25,000个细胞。在本公开内容的方法的一些方面中，第一多个、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合中的细胞数目可根据正在用于测定的微量滴定板的尺寸按比例调整。在非限制性实例中，当在96孔板中执行本公开内容的方法时，第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括至少约25,000个细胞。当使用6孔板时，第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括至少约400,000个细胞。当使用12孔板时，第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括至少约200,000个细胞。当使用24孔板时，第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括至少约100,000个细胞。当使用48孔板时，第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括至少约50,000个细胞。当使用384孔板时，第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括至少约6,250个细胞。当使用1536孔板时，第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合可包括至少约1,562个细胞。
在本公开内容的方法的一些方面中，在添加毒性化合物及条件及/或标准培养基之前，可使第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合悬浮于至少约25μl的标准培养基中。可使用的标准培养基的量可基于正在用于测定的微量滴定板的尺寸而调整。在一非限制性实例中，当使用6孔板时，可使用约400μl的标准培养基。在一非限制性实例中，当使用12孔板时，可使用约200μl的标准培养基。在一非限制性实例中，当使用24孔板时，可使用约100μl的标准培养基。在一非限制性实例中，当使用48孔板时，可使用约50μl的标准培养基。在一非限制性实例中，当使用96孔板时，可使用约25μl的标准培养基。在一非限制性实例中，当使用384孔板时，可使用约6.25μl的标准培养基。在一非限制性实例中，当使用1536孔板时，可使用约1.56μl的标准培养基。
在本公开内容的方法的一些方面中，可用至少约50μl至至少约100μl的条件培养基或对照培养基培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合。在一些方面中，可用至少约75μl的条件培养基或对照培养基培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合。条件培养基或对照培养基的量可基于正用于测定的微量滴定板的尺寸而调整。在一非限制性实例中，当使用6孔板时，可使用约1200μl的条件培养基或对照培养基。在一非限制性实例中，当使用12孔板时，可使用约600μl的条件培养基或对照培养基。在一非限制性实例中，当使用24孔板时，可使用约300μl的条件培养基或对照培养基。在一非限制性实例中，当使用48孔板时，可使用约150μl的条件培养基或对照培养基。在一非限制性实例中，当使用96孔板时，可使用约75μl的条件培养基或对照培养基。在一非限制性实例中，当使用384孔板时，可使用约18.75μl的条件培养基或对照培养基。在一非限制性实例中，当使用1536孔板时，可使用约4.68μl的条件培养基或对照培养基。
在如本文所提供的方法的一些方面中，毒性化合物可诱发细胞凋亡。在一些方面中，毒性化合物可诱发细胞凋亡、自噬、第I型细胞死亡、第II型细胞死亡、坏死、坏死性凋亡、大自噬、失巢凋亡(anoikis)、角化、兴奋性毒性、铁死亡、活化诱发的细胞死亡、缺血性细胞死亡、肿瘤病、细胞焦亡或其任何组合。
毒性化合物可包括(但不限于)烷基化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、化学治疗剂、生物碱、紫杉烷、抗微管试剂、毒素、膜渗透剂、酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、DNA修复酶抑制剂、DNA损伤剂、UV辐射、γ放射、白消安(busulfan)、胞嘧啶、依托泊苷(etoposide)、博莱霉素、l-天冬酰胺酶、卡莫司汀(carmustine)、阿拉伯糖苷(arabinoside)、替尼泊苷(teniposide)、放线菌素、羟基脲、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氟尿苷(floxuridine)、长春碱(vinblastine)、道诺霉素(daunorubicin)、丙卡巴肼(procarbazine)、顺铂(cisplatin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、长春新碱(vincristine)、阿霉素(doxorubicin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、长春地辛(vindesine)、丝裂霉素-c(mitomycin-c)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲胺喋呤(methotrexate)、紫衫烷类(taxoids)、米托蒽醌(mitoxantrone)、美法仑(melphalan)、吉西他滨(gemcitabine)、普卡霉素(plicamycin)、培美曲塞蒽环霉素(pemetrexedanthracyclines)及/或埃博霉素(epothilones)。
在本公开内容的方法的一些方面中，毒性化合物为丁酸钠。丁酸钠可以约1mM至约26mM的浓度存在。丁酸钠可以约2mM至约24mM的浓度存在。丁酸钠可以约0mM至约32mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约0mM的浓度存在，也即未添加丁酸钠。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约2mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约4mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约6mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约8mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约10mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约12mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约14mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约16mM的浓度存在。在本公开内容的方法的一些方面中，丁酸钠以约18mM、或约20mM、或约22mM、或约24mM、或约26mM、或约28mM、或约30mM、或约32mM、或约34mM、或约36mM、或约38mM、或约40mM的浓度存在。
在本公开内容的方法的一些方面中，在确定细胞的生活力之前培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合至少1小时、或至少12小时、或至少24小时、或至少46小时、或至少48小时、或至少72小时或更多的时段。在一些方面中，培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合约1小时、或约2小时、或约72小时或更多。在一些方面中，在确定细胞的生活力之前培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合至少46小时。
在如本文所提供的方法的一些方面中，确定第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的生活力可包括使用本领域中已知的任何细胞生活力测定。这些包括(但不限于)ATP测试测定、钙黄绿素AM测定、克隆形成测定、乙锭均二聚体测定、伊凡氏蓝(Evans blue)测定、荧光素二醋酸酯水解/碘化丙锭染色测定、流式细胞术测定、基于甲臜的测定、MTT测定、XTT测定、绿色荧光蛋白测定、乳酸脱氢酶测定、甲基紫测定、碘化丙锭测定、刃天青测定、锥虫蓝测定、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(terminaldeoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)测定或其组合。
在本公开内容的方法的一些方面中，确定第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的生活力可包括确定第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的增殖。在本公开内容的方法的一些方面中，确定第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的生活力包括测量第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的代谢能力。
第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的代谢能力可使用基于荧光的测定来测量。基于荧光的测定可包括：1)用刃天青(7-羟基-3H-酚噁嗪-3-酮10-氧化物钠盐)培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合至少1小时的时段；2)测量第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的荧光。基于荧光的测定可进一步包括3)比较所测量的荧光，从而确定第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的生活力。在一些方面中，用刃天青培育细胞至少约1小时、或至少约1.5小时、或至少约2.0小时、或至少约2.5小时、或至少约3.0小时、或至少约3.5小时、或至少约4.0小时、或至少约4.5小时、或至少约5.0小时、或至少约5.5小时、或至少约6.0小时、或至少约6.5小时、或至少约7.0小时、或至少约7.5小时、或至少约8.0小时、或至少约8.5小时、或至少约9.0小时、或至少约9.5小时、或至少约10小时、或至少约15小时、或至少约20小时的时间段。第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的代谢能力可使用
Figure BDA0003019650680000211
Figure BDA0003019650680000212
细胞生活力测定来测量。在一些方面中，
Figure BDA0003019650680000213
试剂可以1:4稀释。在一些方面中，
Figure BDA0003019650680000214
试剂可以1:4稀释于杜尔贝科氏(Dulbecco's)PBS中。在一些方面中，
Figure BDA0003019650680000215
试剂未经稀释。在一些方面中，可用至少约20pl的未经稀释或经稀释
Figure BDA0003019650680000216
试剂培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合。在一些方面中，所用的未经稀释或经稀释
Figure BDA0003019650680000217
试剂的量可基于正用于测定的微量滴定板而调整。
在本公开内容的方法的一些方面中，确定第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合中的细胞凋亡活性可包括基于发光的测定。基于发光的测定可包括：用致发光半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7底物培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合至少约1小时；及测量第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合的发光。用致发光半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7底物培育可为至少约1小时、或至少约1.5小时、或至少约2.0小时、或至少约2.5小时、或至少约3.0小时、或至少约3.5小时、或至少约4.0小时、或至少约4.5小时、或至少约5.0小时、或至少约5.5小时、或至少约6.0小时、或至少约6.5小时、或至少约7.0小时、或至少约7.5小时、或至少约8.0小时、或至少约8.5小时、或至少约9.0小时、或至少约9.5小时、或至少约10小时、或至少约15小时、或至少约20小时的时间段。在一些方面中，致发光半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7底物包括通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7裂解的四肽序列DEVD，从而产生荧光素酶底物。在一些方面中，基于发光的测定为
Figure BDA0003019650680000221
3/7测定系统。在一些方面中，可用至少约120μl的
Figure BDA0003019650680000222
3/7测定试剂培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合。
Figure BDA0003019650680000223
3/7测定试剂的量可基于正用于测定的微量滴定板而调整。在一非限制性实例中，当使用96孔微量滴定板时，可使用约120μl的
Figure BDA0003019650680000224
3/7测定试剂。
在本公开内容的方法的一些方面中，可在标准测定培养板中培育第一多个细胞、第二多个细胞、第三多个细胞或其任何组合。此包括(但不限于)具有6、12、14、48、96、384或1536个样品孔的微量滴定板、微量板或微孔板。测定板的表面可涂布有分子以促进细胞贴壁至测定板上。示例性涂层包括(但不限于)聚-D-赖氨酸或人类纤连蛋白。测定板可保持未经涂布。
以上方面及实施方案中的任一者可与如本文发明内容及/或具体实施方式部分中所公开的任何其他方面或实施方案组合。
除非上下文另外明确指示，否则如本说明书及所附权利要求中所用，单数形式“一(a/an)”及“所述(the)”包括多个指示物。
除非明确陈述或自上下文显而易见，否则如本文所用的术语“或”应理解为包括性的且涵盖“或”与“及(和)”。
除非明确陈述或为自上下文显而易见的，否则如本文中所使用的术语“约”应理解为在本领域中的一般公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文另外明确说明，否则本文所提供的所有数值均由术语约来修饰。
除非另作定义，否则本文所用的所有技术及科学术语均具有与由本发明所属的领域中本领域技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所描述的相似的其他探针、组合物、方法及试剂盒可用于实践本公开内容，但本文描述示例性材料及方法。应理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的，且并不意欲为限制性的。
实施例
在以下实施例中，通过在补充有20％胎牛血清的
Figure BDA0003019650680000231
配制的RPMI-1640培养基中培养扩增并维持人类视网膜母细胞瘤(hRB)Y79(
Figure BDA0003019650680000232
HTB-18TM)细胞以供使用。根据
Figure BDA0003019650680000233
建议维持细胞。人类视网膜祖细胞(hRPC)及人类视网膜色素上皮细胞(hRPE细胞)是自18至20周人类胎儿分离且在标准培养基(SM)中繁殖，所述标准培养基包含具有1xN-2补充物的Advanced DMEM/F12、1x GlutaMax-1、20ng/ml人类FGF-碱性蛋白及20ng/ml人类EGF蛋白。
在以下实验中，条件培养基(CM)是从在SM中生长48小时(在24小时后替换SM)的hRPC、hRB细胞或hRPE收集。在每次CM收集之后采集及统计细胞。
实施例1-涂布及未经涂布基质
测试不同涂布试剂以确定适用于本公开内容的方法的基质。
不透明96孔测定板未经涂布或用聚-D-赖氨酸涂布或用人类纤连蛋白涂布。通过在室温下在各孔中培育25μl至50μl的200μg/ml聚-D-赖氨酸溶液五分钟至两小时来将板用聚-D-赖氨酸涂布。或者，在室温下在各孔中培育250μl的200μg/ml聚-D-赖氨酸溶液一小时。在培育后，将板用ddH2O淋洗，随后保持至风干两小时。通过在37℃下培育300μl的20μg/ml人类纤连蛋白溶液整夜来将板用人类纤连蛋白涂布。在整夜培育后，用Advanced DMEM/F12淋洗板。
随后将人类视网膜母细胞瘤(hRB)Y79(
Figure BDA0003019650680000234
HTB-18TM)细胞添加至三个不同的测定板。在人类纤连蛋白板的情形下，观测到hRB细胞大量定殖。相反地，在聚-D-赖氨酸板中，观测到hRB细胞均匀分布。当将细胞添加至在人类视网膜母细胞标准培养基中的未经涂布板时，尽管缺少涂布细胞仍贴壁至板。因此，未经涂布的板也可用于本公开内容的方法。
实施例2-基于荧光的细胞生活力测定
测试测量细胞生活力的基于荧光的测定以用于本公开内容的方法。
首先，将12.5×103、2.5×104、5.0×104、1.0×105及2.0×105个人类视网膜母细胞瘤(hRB)Y79(
Figure BDA0003019650680000241
HTB-18TM)细胞接种于96孔测定板的五个单独孔中且在50μl SM中培育。在使得细胞沈降30分钟至两小时后，随后在将细胞与250μl的人类视网膜母细胞条件培养基充分混合后将细胞培育。随后抽取200μl的培养基且在37℃下向细胞添加20μl的包括刃天青(7-羟基-3H-酚噁嗪-3-酮10-氧化物钠盐)的经稀释
Figure BDA0003019650680000242
试剂(于DPBS中1:4)持续1、2、3或4小时。刃天青为当通过活细胞内化时还原至称为试卤灵(resorufin)的化合物的化合物。试卤灵高度荧光的，意谓所产生的荧光信号可用于确定用刃天青培育的细胞的生活力。缺少代谢能力的非活性细胞不会将刃天青还原成试卤灵，且因此不产生荧光信号。
在用刃天青培育后测量各孔的荧光。在520nm的激发波长及580至640nm的发射波长处读取荧光信号。每个处理重复三次或重复四次进行。如图1中所示，在所有细胞量中存在对1、2或3小时的培育时间的线性响应(R2＝0.99)。这些结果指示为了达成每细胞的最大治疗效果且使实验持续时间及内部样品变化减到最少，本公开内容的方法可使用2.5×104个细胞/孔及2小时刃天青培育时间。
实施例3-确定人类视网膜母细胞条件培养基的效能
本公开内容的方法用于测试人类视网膜母细胞条件培养基的效能。
首先，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用人类视网膜母细胞条件培养基(hRPC CM)或标准培养基(SM；尚未曝露于人类视网膜祖细胞的标准人类视网膜母细胞培养基)培育细胞。培养基未补充丁酸钠、补充有2mM丁酸钠、4mM丁酸钠或8mM丁酸钠。将新制200mM丁酸钠添加至250μl的培养基以产生各种丁酸钠浓度。使用9.0×106个人类视网膜祖细胞产生hRPC CM。
在300μl的各种培养基中培育hRB细胞一小时或72小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000251
试剂来测量细胞生活力。简言之，使200μl的细胞培养物与20μl的经稀释
Figure BDA0003019650680000252
试剂混合且培育一至两个小时。随后测量各样品的荧光。如图2中所展示，由于细胞增殖与培育一小时(左侧图)相比在培育72小时(右侧图)后观测到更强荧光信号。然而，在培育72小时的样品中观测到显著剂量依赖性、丁酸钠诱发的细胞凋亡，因为较高浓度的丁酸钠引起荧光信号减小，指示细胞增殖及生活力减小。
与用SM培育的细胞相比用hRPC CM培育一小时及72小时的细胞均显示增加的荧光信号。这些结果指示即使在诱发细胞凋亡的丁酸钠存在下hRPC CM仍强力增加hRB细胞的生活力。在用8mM丁酸钠培育的细胞中观测到最高hRPC CM效能，其中与SM比较在一小时及72小时时间点hRPC CM显示约2倍效能的提高细胞生活力。这些初步结果指示8mM丁酸钠提供最大可检测信号。
在另一实验中，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用hRPC CM或SM培育细胞。培养基未补充丁酸钠、补充有8mM丁酸钠、16mM丁酸钠或24mM丁酸钠。使用9.0×106个人类视网膜祖细胞产生hRPC CM。
培育hRB细胞一小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000253
试剂来测量细胞生活力。如图3中所示，与用SM培育的hRB细胞比较，用hRPC CM培育的hRB细胞显示增加的荧光信号。此趋势在所有四个丁酸钠浓度中均一致。这些结果指示即使在高浓度的诱发细胞凋亡的丁酸钠存在下hRPC CM仍强力增加hRB细胞的生活力。
实施例4-在不同剂量下确定人类视网膜母细胞条件培养基的效能
本公开内容的方法用于测试人类视网膜母细胞条件培养基的效能是否为剂量依赖性。
首先，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用hRPC CM、SM、经SM稀释2倍的hRPC CM(0.5x hRPC CM)、经SM稀释4倍的hRPC CM(0.25x hRPC CM)或经SM稀释8倍的hRPC CM(0.125x hRPC CM)培育细胞。培养基未补充丁酸钠或补充有8mM丁酸钠。使用9.0×106个人类视网膜祖细胞产生hRPC CM。
培育hRB细胞一小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000262
试剂来测量细胞生活力。如图4中所示，与用更稀的hRPC CM培育的细胞及用SM培育的细胞相比用更浓的hRPC CM培育的细胞显示增加的荧光信号。这些结果指示hRPC CM以剂量依赖型方式强力增加hRB细胞的生活力。
在另一实验中，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用使用9.0×106个人类视网膜祖细胞产生的hRPC CM(hRPC CM9M)、使用6.0×106个人类视网膜祖细胞产生的hRPC CM(hRPC CM 6M)或SM培育细胞。培养基未补充丁酸钠或补充有8mM丁酸钠。
培育hRB细胞一小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000261
试剂来测量细胞生活力。如图5中所示，在两种丁酸钠浓度下，与用hRPC CM 6M培育的细胞及用SM培育的细胞相比用hRPC CM 9M培育的细胞显示增加的荧光值。此结果指示hRPC CM处理的效能依赖于用于产生条件培养基的hRPC的数目。
这些结果指示如本文所提供的方法可用于确定用于治疗色素性视网膜炎的基于hRPC的疗法的效能。
实施例5-使用不同hRPC群体确定人类视网膜母细胞条件培养基的效能是否可再现
本公开内容的方法用于测试当使用来自不同产品批次的单独hRPC群体产生条件培养基时人类视网膜母细胞条件培养基的效能是否可再现。
首先，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用使用5.4×106/10ml来自称为G1的批次的hRPC产生的hRPC CM(hRPC CM G1 5.4)、使用3.7×106/10ml来自称为G2的批次的hRPC产生的hRPC CM(hRPC CM G2 3.7)、使用4.5×106/10ml来自称为G3的批次的hRPC产生的hRPC CM(hRPC CM G3 4.5)、使用5.0×106/10ml来自称为G5的批次的hRPC产生的hRPC CM(hRPC CM G5 5.0)或SM来培育细胞。培养基未补充丁酸钠或补充有8mM丁酸钠。
培育hRB细胞2小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000271
试剂来测量细胞生活力。如图6的左侧图中所示，在两种丁酸钠浓度下，与用SM培育的细胞相比用hRPC CM培育的细胞显示增加的荧光值。观测到此增加与用于生成条件培养基的hRPC的批次无关。
在另一实验中，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用使用3.7×106/10ml来自称为G1的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G1 3.7)、使用2.9×106/10ml来自称为G2的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G2 2.9)、使用3.35×106/10ml来自称为G3的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G4 3.35)、使用3.25×106/10ml来自称为G5的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G5 3.25)或SM来培育细胞。培养基未补充丁酸钠或补充有8mM丁酸钠。
培育hRB细胞2小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000272
试剂来测量细胞生活力。如图6的右侧图中所示，在两种丁酸钠浓度下与用SM培育的细胞相比用hRPC CM培育的细胞显示增加的荧光值。观测到此增加与用于生成条件培养基的hRPC的来源无关。
在另一实验中，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用使用2.038×106/4ml来自称为G1的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G1 2.038)、使用1.774×106/4ml来自称为G2的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G2 1.774)、使用1.543×106/4ml来自称为G3的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G3 1.543)、使用1.542×106/4ml来自称为G4的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G4 1.542)、使用1.318×106/4ml来自称为G5的批次的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM G5 1.318)、使用1.977×106/4ml来自称为L-SB的CMO种子库样品的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM L-SB)、使用1.162×106/4ml来自称为L-PB的L产物库样品的hRPC而产生的hRPC CM(hRPC CM L-PB)或SM来培育细胞。培养基未补充丁酸钠或补充有8mM丁酸钠。
培育hRB细胞2小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000284
试剂来测量细胞生活力。如图7中所示，在两种丁酸钠浓度下与用SM培育的细胞相比用hRPC CM培育的细胞显示增加的荧光值。观测到此增加与用于生成条件培养基的hRPC的来源无关。
此实施例中的结果指示不同群体的hRPC可用于产生有效条件培养基。对比SM，来自不同hRPC批次的条件培养基的效能一致性地展示较高代谢活性。当批次存在一些效能差异时，此最可能由于在条件培养基收集时缺少标准化。
实施例6-确定人类视网膜母细胞条件培养基的效能是否为特异性
本公开内容的方法用于测试与使用其他细胞类型产生的条件培养基相比，hRPCCM的效能是否对使用hRPC产生的条件培养基具有特异性。
首先，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用使用9.0×106个人类视网膜祖细胞产生的hRPC CM(hRPC CM 9M)、使用12.2×106个hRB细胞产生的hRB条件培养基(hRB CM 12.2M)或SM培育细胞。培养基未补充丁酸钠或补充有8mM丁酸钠。
培育hRB细胞1或2小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000281
Figure BDA0003019650680000282
试剂来测量细胞生活力。如图8的左侧图中所示，与用hRB条件培养基及SM培育的细胞相比，用hRPC条件培养基培育的细胞显示增加的荧光信号。此趋势在整个丁酸钠浓度中一致。
在另一实验中，以2.5×104个细胞/孔的密度将hRB细胞接种在测定板上。随后用使用7.0×106个人类视网膜色素上皮细胞产生的人类视网膜色素上皮细胞条件培养基(hRPE CM 7M)或标准培养基(SM；尚未曝露于人类视网膜祖细胞的标准人类视网膜母细胞培养基)来培育细胞。培养基未补充丁酸钠或补充有8mM丁酸钠。
培育hRB细胞1或2小时。在培育后，如上文所描述使用
Figure BDA0003019650680000283
Figure BDA0003019650680000291
试剂来测量细胞生活力。如图8中所示，与用SM培育的细胞相比用hRPE条件培养基培育的细胞显示增加的荧光信号。此趋势在整个丁酸钠浓度中一致。
实施例1至6的概述
当前述实施例中所用的目标细胞类型(hRB系)实质上不同于预期的活体内细胞目标(也即病患的视网膜)时，本公开内容的方法仍然展现检测及区分治疗性细胞的可扩散营养活性的不同层级的能力。选择用于测定的高度异常目标细胞使得本公开内容的方法高度适合于各种不同疾病情形，尤其可能具有难以体外实验的目标细胞类型的情形。
实施例7-条件培养基收集
以下实施例描述产生及收集用于本公开内容的方法的条件培养基。更具体言的，此实施例描述收集用于生长hRPC的条件培养基。
将含有hRPC细胞的第一小瓶自液氮取出且在细胞培养套管中使其盖松开以释放压力。随后将盖再拧紧。随后通过将小瓶置放于37℃水浴处2至3分钟直至冰晶消失以将hRPC细胞解冻。随后使用1ml移液器尖端将整个细胞悬浮液(约1ml/小瓶)转移至15ml锥形底管子中。用新鲜冷标准培养基(SM)淋洗小瓶1至2次且将用于淋洗的SM逐滴添加至细胞悬浮液。随后轻轻摇晃整个细胞混合物。
将10至14ml冷新鲜SM添加至15ml锥形底管子中的细胞悬浮液且轻轻摇晃混合物。随后通过以300x g离心管子5分钟来使细胞成沉淀。随后抽吸并丢弃上清液。随后将新鲜冷SM用于使用1ml移液器尖端轻轻上下吸放细胞沉淀6至8次以使细胞沉淀再悬浮。随后使用血球计或Countess计数器来测量细胞生活力及细胞数目。基于所测量的细胞数目，将8百万个经解离的活细胞接种至预涂布10ml新鲜SM中的纤连蛋白的新T75烧瓶中。随后立即轻轻摇动细胞培养物。
在接种后，通过倒置显微镜检查细胞以确保细胞均匀分布于细胞培养烧瓶中。如果观测到不均匀分布，则进一步轻轻摇动细胞直至达成均匀分布。随后在37℃及5％CO2下培育细胞。
次日，在倒置显微镜下检验细胞且记录其状态。在观测后，自hRPC培养烧瓶抽吸整个细胞培养基并丢弃。随后，添加10ml的预温热(37℃)SM至各T75烧瓶。随后在37℃及5％CO2下培育细胞。
随后，在倒置显微镜下再次检验细胞的状态。随后自hRPC培养烧瓶抽吸条件培养基并收集。随后在475x g下离心培养基5分钟。随后将经离心的条件培养基置放于冷方块上。随后将条件培养基等分至1.5ml管子中，注意避免抽吸在管子底部的含有死细胞及细胞碎片的沉淀。随后立即将等分条件培养基转移至-80℃长期储存以用于本公开内容的方法中。
随后，将5ml的预温热37℃SM培养基添加至含有hRPC细胞的T75培养烧瓶。随后轻轻摇动烧瓶且抽吸培养基并丢弃。随后将4ml的TrypLE Select工作溶液添加至各T75烧瓶，且随后轻轻摇动烧瓶以完全覆盖表面，在所述表面上用TrypLE Select工作溶液生长细胞。在37℃及5％CO2下在TrypLE Select工作溶液中培育细胞五分钟。
在培育后，在倒置显微镜下检查细胞以确保至少95％的细胞自细胞培养表面脱离。如果需要进一步脱离，则进一步搅动培养烧瓶。
为停止细胞的酶促解离，将5ml的SM添加至T75烧瓶。随后轻轻滴定培养基以使用无菌血清学移液器将细胞自烧瓶的表面洗掉。随后将细胞悬浮液转移至无菌15ml管子。随后将管子置于冷方块中。随后再次使用另外5ml的新鲜SM淋洗T75烧瓶，随后将新鲜SM转移至无菌15ml管子。随后在4℃下在台面离心机中以300x g离心含有细胞的15ml锥形管5分钟。在离心后，抽吸上清液并丢弃。随后将冷(4℃)BSS Plus溶液添加至成沉淀的细胞。随后使用1ml移液器尖端轻轻上下吸取BSS Plus溶液6至10次使沉淀再悬浮。使悬浮液持续保持冷。最后，使用血球计或Countess计数器来测量细胞生活力及细胞数目。
实施例8-本公开内容的多重效能测定
此实施例描述各种实验，包括本公开内容的多重效能测定及其在确定基于细胞的疗法或治疗的效能中的用途。
在多重效能测定的一非限制性实施例中，将RB细胞接种至96孔板中。对于各孔，将25,000个RB细胞接种于25μl的SM中。随后用75μl的条件培养基(在一些情况下，视实验而定为经稀释的条件培养基)或75μl的对照培养基(标准培养基，阳性对照条件培养基、阴性对照条件培养基)处理各孔。随后将丁酸钠添加至各孔至16mM的最终浓度。在一些实验中，添加丁酸钠至8mM、16mM或32mM的最终浓度，或根本不添加丁酸钠以确定丁酸钠浓度对测定的输出的影响。随后在37℃下培育细胞46小时。
在培育46小时后，将20μl的
Figure BDA0003019650680000314
试剂(用杜尔贝科氏PBS1:4稀释)添加至各孔。随后在37℃下培育细胞。在培育后，通过记录在(530Ex/590Em)下各孔的荧光来测量细胞的生活力。
在测量细胞生活力后，将相等体积(120μl)的
Figure BDA0003019650680000311
3/7试剂添加至各孔。随后在室温下培育细胞1.5小时以达成荧光素酶输出的稳态。在培育后，测量各孔的发光以确定各孔中的细胞凋亡活性。随后如上文所描述计算各孔的倍数变化保护值。随后通过获取各孔的倍数变化保护值的比率并归一化至针对使用对照培养基(更具体地，标准培养基)的孔所计算的倍数变化保护值来计算各孔的效能值。
图10展示来自实验的结果，所述实验使用前述多重方法、不同的丁酸钠的量以及包括标准培养基、来自一个hRPC群体的条件培养基或来自不同hRPC群体的条件培养基的条件。图10的顶部左侧图展示针对使用
Figure BDA0003019650680000312
试剂的各条件所测量的生活力。图10的顶部右侧图展示针对使用
Figure BDA0003019650680000313
3/7试剂的各条件所测量的细胞凋亡活性。图10的底部图展示如上文所描述计算的效能值。这些结果指示来自两个hRPC群体的条件培养基均保护RB细胞免于丁酸钠的有害影响。另外，结果指示使用16mM丁酸钠产生使用本公开内容的多重效能测定的最大效能信号。
图11展示实验的结果，所述实验使用前述多重方法使用16mM丁酸钠及未经过滤或经过滤的条件培养基。简言之，将10ml的来自hRPC的条件培养基添加至
Figure BDA0003019650680000321
Ultra3K过滤装置(Millipore UFC900324)。使用摆动桶转子，以4,000x g离心具有条件培养基的装置约10至15分钟。通过将移液器插入过滤装置中回收“顶部”或“渗余物”级分并用边到边扫动抽取样品以确保完全回收。通过移除过滤装置并收集流动通过过滤器的样品部分来回收“底部”或“滤过物”级分。如图11中所展示，未经过滤的条件培养基保护RB细胞免于丁酸钠的有害影响。相比之下，“底部”或“滤过物”级分并不以相同程度保护RB细胞。
图12展示实验的结果，所述实验使用前述多重方法使用16mM丁酸钠以及标准培养基、来自HuT78细胞的条件培养基及来自ARPE-19细胞的条件培养基。来自HuT78细胞的条件培养基为阴性对照条件培养基，因为预期此条件培养基不保护RB细胞免于丁酸钠的有害影响。来自ARPE-19细胞的条件培养基为阳性对照条件培养基，因为预期此条件培养基保护RB细胞免于丁酸钠的有害影响。如图12中所展示，如所预期，尽管ARPE-19条件培养基保护RB细胞，但HuT78条件培养基并不保护RB细胞。因此，本公开内容的方法可包括使用阳性及阴性对照条件培养基以确保正执行的测定的完整性。
图13展示实验的结果，所述实验使用前述多重方法使用16mM丁酸钠以及标准培养基、来自三个不同“批次”(不同群体G1、G2及G5)的hRPC的条件培养基及来自CCD-1112Sk细胞的条件培养基。来自CCD-1112Sk细胞的条件培养基为阳性对照条件培养基，因为预期此条件培养基保护RB细胞免于丁酸钠的有害影响。如图13中所展示，来自全部三个批次的hRPC的条件培养基及来自CCD-1112Sk细胞的阳性对照条件培养基均保护RB细胞免于丁酸钠的有害影响。因此，这些结果指示本公开内容的方法可用于测试基于不同细胞的治疗或疗法的独立“批次”且所测量的效能值较稳固。
图14展示实验的结果，所述实验使用前述多重方法使用16mM丁酸钠以及标准培养基及来自具有不同接种密度的hRPC的培养物的条件培养基。使用与实施例7中相似的方法收集条件培养基，不同之处在于使用4百万、6百万或9百万个细胞的接种密度。如图14中所展示，来源于具有较高接种密度的hRPC培养物的条件培养基向RB细胞提供更多保护以免于丁酸钠的有害影响。因此，所测量的本公开内容的方法的效能值可展现剂量依赖性。
实施例9-本公开内容的方法展现线性
此实施例描述一实验，所述实验证实当使用稀释系列的条件培养基(CM)时本公开内容的方法在所测量的效能中展现线性。
首先，将RB细胞接种至96孔板中。对于各孔，将25,000个RB细胞接种于25μl的SM中。随后如下制备稀释系列的条件培养基(例如使用实施例7的方法产生)：
i.100％CM：仅CM
ii.75％CM：75％CM+25％SM
iii.50％CM：50％CM+50％SM
iv.25％CM：25％CM+75％SM
v.12.5％CM：12.5％CM+87.5％SM
vi.0％CM：100％SM
将75μl的各种条件培养基(a至f)添加至96孔板中的单独孔。随后将丁酸钠添加至各孔至16mM丁酸钠的最终浓度。随后在37℃下培育细胞46小时。
在培育46小时后，将20μl的
Figure BDA0003019650680000331
试剂(用杜尔贝科氏PBS1:4稀释)添加至各孔。随后在37℃下培育细胞。在培育后，通过记录在(530Ex/590Em)下各孔的荧光来测量细胞的生活力。
在测量细胞生活力后，将相等体积(120μl)的
Figure BDA0003019650680000332
3/7试剂添加至各孔。随后在室温下培育细胞1.5小时以达成荧光素酶输出的稳态。在培育后，测量各孔的发光以确定各孔中的细胞凋亡活性。
随后如上文所描述计算各孔的倍数变化保护值。随后通过获取各孔的倍数变化保护值的比率并归一化至针对包含0％CM(100％SM)的孔所计算的倍数变化保护值来计算各孔的效能值。如图15中所展示，方法的输出展现线性。包含100％CM的条件具有大约4.61的测量效能值。包含75％CM的条件具有大约3.54的测量效能值，其大约与0.75×100％CM条件的效能值(0.75×4.61)相同。相似地，包含50％CM的条件具有大约2.38的测量效能值，其大约与0.5×100％CM条件的效能值(0.5×4.61)相同。因此，本公开内容的方法提供线性的效能输出。
等效物
如本文所提供的一或多个实施方案的详情阐述于上文随附的描述中。尽管与本文所述类似或等效的任何方法及材料可用于实践或测试本发明，但现描述示例性方法及材料。
已仅出于说明的目的提供前述描述，且不意欲将本发明限制为所公开的确切形式，而是通过随附的权利要求进行限制。
可在不偏离本发明的基本方面的情况下对前述内容作出修改。尽管已参考一或多个特定实施方案相当详细地描述本发明，但本领域技术人员应认识到，可对本申请中具体公开的实施方案进行改变，且这些修饰及改良仍在本发明的范围及精神内。本文所例示性描述的发明可适当地在不存在本文未具体公开的任何要素的情况下实施。因此，例如，在本文的各情况下，术语“包含(包括)”、“基本上由……组成”及“由……组成”中的任一者可经另两个术语中的任一者替换。因此，已采用的术语及表述用作描述的术语且不具有限制，并不排除所展示及所描述的特征或其部分的等效物，且应认识到各种修改可能在本发明的范围内。本发明的实施方案阐述于以下权利要求中。

Claims (39)

1.一种用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能的方法，所述方法包括以下步骤：
用毒性化合物及条件培养基培育第一多个细胞，其中所述条件培养基包括用于培养所述基于细胞的疗法或治疗的培养基；
用所述毒性化合物及对照培养基培育至少第二多个细胞；
测定所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞的生活力；及
比较所述第一多个细胞的生活力与所述第二多个细胞的生活力，从而确定所述基于细胞的疗法或治疗的效能。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述效能为所述第一多个细胞的生活力与所述第二多个细胞的生活力的比率。
3.一种用于测量基于细胞的疗法或治疗的效能的方法，所述方法包括以下步骤：
用毒性化合物及条件培养基培育第一多个细胞，其中所述条件培养基包括用于培养所述基于细胞的疗法或治疗的培养基；
用所述毒性化合物及对照培养基培育至少第二多个细胞；
测定所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞的生活力；
测定所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性；
确定所述第一多个细胞的倍数变化保护值，其中所述倍数变化保护值为所述第一多个细胞的生活力与所述第一多个细胞中的细胞凋亡活性的比率；
确定所述至少第二多个细胞的倍数变化保护值，其中所述倍数变化保护值为所述至少第二多个细胞的生活力与所述至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性的比率；及
确定所述基于细胞的疗法或治疗的效能，其中所述效能为所述第一多个细胞的倍数变化保护值与所述至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其进一步包括：
比较所述基于细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果所述效能大于所述预定截止值，则所述基于细胞的疗法或治疗被鉴定为具有足够的效能以施用至个体。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其进一步包括：
比较所述基于细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值；及
当所述效能大于预定截止值时向有需要的个体施用至少一种治疗上有效剂量的细胞疗法或治疗。
6.如权利要求2或3所述的方法，其中所述预定截止值为约2。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述基于细胞的疗法或治疗包括视网膜祖细胞(RPC)、视网膜色素上皮细胞(RPE)、ARPE-19细胞、神经干细胞/祖细胞、间充质干细胞、CD34+细胞、干/祖细胞、白细胞、纤维母细胞或其任何组合。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述基于细胞的疗法或治疗包括来源于细胞的外来体，所述细胞选自视网膜祖细胞(RPC)、视网膜色素上皮细胞(RPE)、ARPE-19细胞、神经干/祖细胞、间充质干细胞、CD34+细胞、干/祖细胞、白细胞、纤维母细胞和其任何组合。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述基于细胞的疗法或治疗包括RPC。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞包括视网膜母细胞瘤(RB)细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、ARPE-19细胞、穆勒细胞源性细胞、MIO-M1细胞、神经元细胞、胶细胞、纤维母细胞、非眼细胞或其任何组合。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞包括RB细胞。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在至少约10μl至至少约40μl培养基中，所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞包括至少约1,000个RB细胞至至少约250,000个RB细胞。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在至少约25μl培养基中，所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞包括至少约25,000个RB细胞。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞分别用至少约50μl至至少约100μl的条件培养基及对照培养基培育。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞分别用至少约75μl的条件培养基及对照培养基培育。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述毒性化合物诱发细胞凋亡。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述毒性化合物为丁酸钠。
18.如权利要求17所述的方法，其中丁酸钠以约2mM至约32mM的浓度存在。
19.如权利要求18所述的方法，其中丁酸钠以约16mM的浓度存在。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中将所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞培育至少约1小时至至少约72小时的时间段。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中将所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞培育至少约46小时的时间段。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中确定所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞的生活力包括测量所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞的代谢能力。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述代谢能力是使用基于荧光的测定来测量。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述基于荧光的测定包括：
用刃天青(7-羟基-3H-酚噁嗪-3-酮10-氧化物钠盐)培育所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞至少约1小时的时段；及
测量所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞的荧光。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述基于荧光的测定为CellTiter-
Figure FDA0003019650670000043
细胞生活力测定。
26.如权利要求25所述的方法，其中将至少约20μl的1:4稀释的CellTiter-
Figure FDA0003019650670000044
试剂添加至所述第一多个细胞中且添加至所述至少第二多个细胞中。
27.如权利要求3至26中任一项所述的方法，其中使用基于发光的测定来测量所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞中的细胞凋亡活性。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述基于发光的测定包括：
用致发光半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7底物培育所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞至少约1小时；及
测量所述第一多个细胞及所述至少第二多个细胞的发光。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述致发光半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7底物包括通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-7裂解的四肽序列DEVD，从而产生荧光素酶底物。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述基于发光的测定为Caspase-
Figure FDA0003019650670000041
3/7测定系统。
31.如权利要求30所述的方法，其中将至少约120μl的Caspase-
Figure FDA0003019650670000042
3/7测定试剂添加至所述第一多个细胞中且添加至所述至少第二多个细胞中。
32.如权利要求3至31中任一项的方法，其进一步包括：
用毒性化合物及无活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述无活性条件培养基包括用于培养基于无活性细胞的疗法或治疗的培养基；
测定所述至少第三多个细胞的生活力；
测定所述至少第三多个细胞中的细胞凋亡活性；
确定所述至少第三多个细胞的倍数变化保护值，其中倍数变化保护值为生活力与细胞凋亡活性的比率；
确定所述基于无活性细胞的疗法或治疗的效能，其中所述效能为所述至少第三多个细胞的倍数变化保护值与所述至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率；及
比较所述基于无活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果所述基于无活性细胞的疗法的效能低于或等于所述预定截止值，则所述方法被鉴定为是有效的。
33.如权利要求1、2及4至31中任一项所述的方法，其进一步包括：
用毒性化合物及无活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述无活性条件培养基包括用于培养基于无活性细胞的疗法或治疗的培养基；
测定所述至少第三多个细胞的生活力；
比较所述第三多个细胞的生活力与所述第二多个细胞的生活力，从而确定所述基于无活性细胞的疗法或治疗的效能；及
比较所述基于无活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果所述基于无活性细胞的疗法的效能低于或等于所述预定截止值，则所述方法被鉴定为是有效的。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述基于无活性细胞的疗法或治疗包括皮肤T淋巴细胞、HuT 78细胞或其任何组合。
35.如权利要求3-32及34中任一项所述的方法，其进一步包括：
用毒性化合物及活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述活性条件培养基包括用于培养基于活性细胞的疗法或治疗的培养基；
测定所述至少第三多个细胞的生活力；
测定所述至少第三多个细胞中的细胞凋亡活性；
确定所述至少第三多个细胞的倍数变化保护值，其中所述倍数变化保护值为生活力与细胞凋亡活性的比率；
确定所述基于活性细胞的疗法或治疗的效能，其中所述效能为所述至少第三多个细胞的倍数变化保护值与所述至少第二多个细胞的倍数变化保护值的比率；及
比较所述基于活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果所述基于活性细胞的疗法的效能大于所述预定截止值，则所述方法被鉴定为是有效的。
36.如权利要求1、2、4-31及33-34中任一项所述的方法，其进一步包括：
用毒性化合物及活性条件培养基培育至少第三多个细胞，其中所述活性条件培养基包括用于培养基于活性细胞的疗法或治疗的培养基；
测定所述至少第三多个细胞的生活力；
比较所述第三多个细胞的生活力与所述第二多个细胞的生活力，从而确定所述基于活性细胞的疗法或治疗的效能；及
比较所述基于活性细胞的疗法或治疗的效能与预定截止值，其中如果所述基于活性细胞的疗法的效能大于所述预定截止值，则所述方法被鉴定为是有效的。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述基于活性细胞的疗法包括视网膜色素上皮细胞(RPE)、ARPE-19细胞、纤维母细胞、CCD-1112Sk细胞或其任何组合。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述对照培养基包括标准培养基。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述基于细胞的疗法或治疗用于治疗视网膜疾病或病况。
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