BR112021006065A2 - ensaios para terapias e tratamentos à base de célula - Google Patents

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Abstract

ENSAIOS PARA TERAPIAS E TRATAMENTOS À BASE DE CÉLULA. A presente divulgação provê métodos in vitro para determinar a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula. Em modalidades alternativas, são providas composições, incluindo produtos de fabricação e kits e métodos, compreendendo (ou compreendendo o uso de) ensaios in vitro quantitativos para determinar a potência de terapias ou tratamentos à base de célula, incluindo aqueles usados no tratamento de degeneração retinal.

Description

“ENSAIOS PARA TERAPIAS E TRATAMENTOS À BASE DE CÉLULA” PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao, e o benefício do Pedido Provisório U.S No. 62/737.359, depositado em 27 de setembro de 2018, o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[0002] Esta invenção geralmente diz respeito aos ensaios e terapias com base em célula. Em modalidades alternativas, são providas as composições, incluindo produtos de fabricação e kits, e métodos, compreendendo (ou compreendendo o uso de) ensaios quantitativos in vitro para determinar a potência das terapias ou tratamentos com base em célula, incluindo aqueles usados no tratamento da degeneração da retina.
FUNDAMENTOS
[0003] A degeneração da retina se refere à deterioração ou degeneração causada pelo declínio e morte progressivos e irreversíveis das células fotoprotetoras na retina. A morte das células fotoprotetoras pode resultar em cegueira. As células tronco e outras células pluripotentes foram consideradas para o uso no tratamento de pacientes com degeneração da retina e podem ser isoladas de várias fontes incluindo tecido embrionário, cérebro adulto, fibroblastos dérmicos geneticamente manipulados e ainda a retina. Contudo, testar estas terapias e tratamentos à base de célula, e mais geralmente terapias e tratamentos à base de célula direcionados para uma ampla variedade de doenças incluindo câncer e condições autoimune, permanece difícil conforme os ensaios in vivo em seres humanos ou organismos modelos são dispendiosos, demorados e muitas vezes sem resultados quantitativos. Deste modo, há uma necessidade na técnica quanto um ensaio in vitro robusto, eficiente em custo, eficiente em tempo e quantitativo para determinar a potência das terapias ou tratamentos à base de célula, incluindo aqueles usados no tratamento da degeneração da retina.
SUMÁRIO
[0004] A presente divulgação provê um método para medir a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula, o método compreendendo as etapas de: incubar uma primeira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado, em que o meio condicionado compreende o meio usado para cultivar a terapia ou tratamento à base de célula; incubar pelo menos uma segunda pluralidade de células com o composto tóxico e meio de controle; determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células; e comparar a viabilidade da primeira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, deste modo determinando a potência da terapia ou tratamento à base de célula. A potência pode ser a razão da viabilidade da primeira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células.
[0005] A presente divulgação provê um método para medir a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula, o método compreendendo as etapas de: incubar uma primeira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado, em que o meio condicionado compreende o meio usado para cultivar a terapia ou tratamento à base de célula; incubar pelo menos uma segunda pluralidade de células com o composto tóxico e meio de controle; determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da primeira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade da primeira pluralidade de células para a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade da pelo menos uma segunda pluralidade de células para a atividade de apoptose na pelo menos uma segunda pluralidade de células; e determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da primeira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células.
[0006] Os métodos precedentes também podem compreender comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula a um valor de corte predeterminado, em que se a potência é maior do que o valor de corte predeterminado, então a terapia ou tratamento à base de célula são identificados como suficientemente potentes para a administração a um sujeito.
[0007] Os métodos precedentes também podem compreender: comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula a um valor de corte predeterminado; e administrar a um sujeito em necessidade deste pelo menos uma dose terapeuticamente eficaz terapia ou tratamento celular quando a potência é maior do que o valor de corte predeterminado.
[0008] Um valor de corte predeterminado pode ser de cerca de 2.
[0009] Uma terapia ou tratamento à base de célula pode compreender as células progenitoras retinais (RPCs), células epiteliais do pigmento da retina (RPEs), células ARPE-19, células tronco/progenitoras neurais, células tronco mesenquimais, células CD34+, células tronco/progenitoras, leucócitos, fibroblastos ou qualquer combinação destes. Uma terapia ou tratamento à base de célula compreende as RPCs.
[0010] Uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem compreender as células de retinoblastoma (RB), células epiteliais do pigmento da retina (RPEs), células ARPE-19, células derivadas da célula de Müller, células MIO-M1, células neuronais, células da glia, fibroblastos, células não oculares ou qualquer combinação destas. Uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem compreender as células de RB. Uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem compreender pelo menos cerca de 1.000 células de RB a pelo menos cerca de 250.000 células de RB em pelo menos cerca de 10 µl a pelo menos cerca de 40 µl de meio. Uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem compreender pelo menos cerca de 25.000 células de RB em pelo menos cerca de 25 µl de meio.
[0011] Uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem ser incubadas com pelo menos cerca de 50 µl a pelo menos cerca de 100 µl de meio condicionado e meio de controle, respectivamente. Uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem ser incubadas com pelo menos cerca de 75 µl de meio condicionado e meio de controle, respectivamente.
[0012] Um composto tóxico pode induzir a apoptose. Um composto tóxico pode ser butirato de sódio. O butirato de sódio pode estar presente em uma concentração de cerca de 2 mM a cerca de 32 mM. O butirato de sódio pode estar presente em uma concentração de cerca de 16 mM.
[0013] Uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem ser incubadas por um período de pelo menos cerca de 1 hora a pelo menos cerca de 72 horas. Uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem ser incubadas por um período de tempo de pelo menos cerca de 46 horas.
[0014] Determinar a viabilidade de uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem compreender medir a capacidade metabólica da primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células. A capacidade metabólica pode ser medida usando um ensaio com base em fluorescência.
[0015] Um ensaio com base em fluorescência pode compreender: incubar a primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células com resazurina (sal de sódio de 10-óxido de 7-hidróxi-3H-fenoxazina-3-ona) por um período de pelo menos cerca de 1 hora; e medir a fluorescência da primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células. Um ensaio com base em fluorescência pode ser um Ensaio de Viabilidade Celular CellTiter-Blue®. Pelo menos cerca de 20 µl de reagente CellTiter-Blue® diluído em 1:4 podem ser adicionados a uma primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células.
[0016] A atividade de apoptose em uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células podem ser medida usando um ensaio com base em luminescência. Um ensaio com base em luminescência pode compreender: incubar uma primeira pluralidade de células e pelo menos uma segunda pluralidade de células com um substrato de caspase-3/7 luminogênico por pelo menos cerca de 1 hora; e medir a luminescência da primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células. Um substrato de caspase-3/7 luminogênico pode compreender uma sequência de tetrapeptídeo DEVD que é clivada por caspase-3 ou caspase-7, deste modo produzindo um substrato de luciferase. Um ensaio com base em luminescência pode ser um sistema de ensaio Caspase-Glo® 3/7. Pelo menos cerca de 120 µl de reagente de ensaio de Caspase-Glo® 3/7 podem ser adicionados à primeira pluralidade de células e à pelo menos uma segunda pluralidade de células.
[0017] Os métodos precedentes também podem compreender: incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado inativo, em que o meio condicionado inativo compreende o meio usado para cultivar uam terapia inativa ou tratamento à base de célula; determinar a viabilidade da pelo menos uma terceira pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na pelo menos terceira pluralidade de células; e determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos uma terceira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade para a atividade de apoptose; e determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da pelo menos uma terceira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células; e comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa a um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia à base de célula inativa for menor do que ou igual ao valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido.
[0018] Os métodos precedentes também podem compreender: incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado inativo, em que o meio condicionado inativo compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula inativa; determinar a viabilidade da pelo menos uma terceira pluralidade de células; comparar a viabilidade da terceira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, deste modo determinando a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa;
e comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa a um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia à base de célula inativa é menor do que ou igual ao valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido.
[0019] Uma terapia ou tratamento à base de célula inativa podem compreender os linfócitos T cutâneos, células HuT 78 ou qualquer combinação destes.
[0020] Os métodos precedentes também podem compreender: incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado ativo, em que o meio condicionado ativo compreende o meio usado para cultivar uma terapia ativa ou tratamento à base de célula; determinar a viabilidade da pelo menos uma terceira pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na pelo menos terceira pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos uma terceira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade para a atividade de apoptose; determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da pelo menos uma terceira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células, e comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa a um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia com base em célula ativa é maior do que o valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido.
[0021] Os métodos precedentes também podem compreender: incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado ativo, em que o meio condicionado ativo compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula ativa; determinar a viabilidade da pelo menos uma terceira pluralidade de células; comparar a viabilidade da terceira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, deste modo determinando a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa; e comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa a um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia com base em célula ativa é maior do que o valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido.
[0022] Uma terapia com base em célula ativa pode compreender as células epiteliais do pigmento da retina (RPEs), células ARPE-19, fibroblastos, CCD-1112Sk células ou qualquer combinação destas.
[0023] O meio de controle pode compreender o meio padrão. Uma terapia ou tratamento à base de célula é para tratar uma doença ou condição da retina.
[0024] São providos os métodos para medir a potência ou eficácia de uma terapia ou tratamento à base de célula, os métodos compreendendo as etapas de: 1) incubar uma primeira pluralidade de células com um composto candidato e a terapia ou tratamento à base de célula; 2) incubar uma segunda pluralidade de células com um composto candidato; 3) determinar a viabilidade e/ou atividade metabólica da primeira pluralidade de células; 4) determinar a viabilidade e/ou atividade metabólica da segunda pluralidade de células; e 5) comparar a viabilidade e/ou atividade metabólica da primeira pluralidade de células com a viabilidade e/ou atividade metabólica da segunda pluralidade de células, deste modo determinando a potência do tratamento. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de células é substancialmente a mesma que a segunda pluralidade de células.
[0025] A primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células pode compreender o mesmo tipo de célula. Por via de exemplo não limitante, o tipo de célula pode ser as células de retinoblastoma humano.
[0026] A primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células pode cada uma compreender entre cerca de 1.000 a cerca de 250.000 células (por exemplo, cerca de 1.000; 25.000; 50.000; 75.000; 100.000; 125.000; 150.000; 175.000;
200.000; 225.000; ou 250,000). Em alguns exemplos não limitantes, a primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células pode cada uma compreender cerca de 25.000 células.
[0027] A terapia ou tratamento à base de célula pode compreender um meio condicionado. O meio condicionado pode ser produzido coletando-se o meio usado para cultivar uma terceira pluralidade de células. A terceira pluralidade de células pode compreender as células progenitoras retinais mamíferas. As células progenitoras retinais mamíferas podem ser as células progenitoras retinais humanas. A terceira pluralidade de células pode compreender entre 0,1x106 e 1x107 células progenitoras retinais humanas (por exemplo, 0,1 x106, 0,2 x106, 0,3 x106, 0,4 x106, 0,5 x106, 0,6 x106, 0,7 x106, 0,8 x106, 0,9 x106, 1 x106, 2 x106, 3 x106, 4 x106, 5 x106, 6 x106, 7 x106, 8 x106, 9 x106, ou 1 x107 células). Em alguns exemplos não limitantes, a terceira pluralidade de células pode compreender cerca de 9x106 células progenitoras retinais humanas.
[0028] Em uma outra modalidade, a terceira pluralidade de células compreende as células epiteliais do pigmento da retina humanas (hRPEs) (ver, por exemplo, a Fig. 8).
[0029] Como aqui usado, o termo “composto candidato” pode se referir a um composto tóxico, um composto semitóxico, ou outros. Por via de exemplo não limitante, o composto tóxico pode induzir a apoptose. O composto tóxico pode ser butirato de sódio. O butirato de sódio pode estar presente em uma quantidade entre cerca de 0 mM e cerca de 26 mM (por exemplo, cerca de 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7. 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou 26 mM). Em alguns exemplos não limitantes, o butirato de sódio pode estar presente em uma quantidade de cerca de 8 mM.
[0030] A primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células pode ser incubadas por um período de pelo menos 1 hora, ou pelo menos 12 horas, ou pelo menos 24 horas, ou pelo menos 48 horas, ou pelo menos 72 ou mais horas. A primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células pode ser incubadas por cerca de 2 horas.
[0031] Determinar a viabilidade da primeira pluralidade e a segunda pluralidade de células pode compreender medir a capacidade metabólica da primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células. A capacidade metabólica da primeira pluralidade de células e da segunda pluralidade de células pode ser medida usando um ensaio com base em fluorescência.
[0032] O ensaio com base em fluorescência pode compreender: 1) incubar a primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células com resazurina (sal de sódio de 10-óxido de 7-hidróxi-3H-fenoxazina-3-ona) por um período de pelo menos 1 hora; 2) medir a fluorescência da primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células; e 3) comparar a fluorescência medida, deste modo determinando a viabilidade da primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células.
[0033] Qualquer um dos aspectos acima pode ser combinado com qualquer outro aspecto.
[0034] Os detalhes de uma ou mais modalidades exemplares da invenção são apresentados nas figuras anexas e na descrição abaixo. Outras características, objetos, e vantagens da invenção serão evidentes da descrição e figuras, e a partir das reivindicações.
[0035] Todas as publicações, Patentes e Pedidos de Patente aqui citados são aqui expressamente incorporados por referência para todos os propósitos.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS
[0036] O acima e outras características serão mais claramente apreciadas a partir da seguinte descrição detalhada quando tomada em conjunção com as figuras anexas.
[0037] A FIG. 1 ilustra uma série de gráficos mostrando os resultados de um ensaio de viabilidade celular com base em fluorescência usado nos métodos da presente divulgação.
[0038] A FIG. 2 ilustra graficamente uma série de gráficos de barras mostrando a potência do meio condicionado de célula progenitora da retina humana (CM de hRPC) em várias concentrações de butirato de sódio como medido usando os métodos da presente divulgação. A azul ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas no meio padrão (SM) e a laranja ou segunda barra em cada grupo corresponde às células incubadas em hRPC CM.
[0039] A FIG. 3 ilustra graficamente uma série de gráficos de barras mostrando a potência do CM de hRPC em várias concentrações de butirato de sódio como medido usando os métodos da presente divulgação. A azul ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas em SM e a laranja ou segunda barra em cada grupo corresponde às células incubadas em CM de hRPC.
[0040] A FIG. 4 ilustra graficamente um gráfico de barras mostrando a potência de várias diluições do CM de hRPC como medido usando os métodos da presente divulgação. A ciano ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas em SM. A cinza ou segunda barra em cada grupo corresponde às células incubadas em CM de hRPC sem nenhuma com diluição. A amarela ou terceira barra em cada grupo corresponde às células incubadas em CM de hRPC diluídas em um fator de 2.A azul escuro ou quarta barra em cada grupo corresponde às células incubadas em CM de hRPC diluídas em um fator de 4. A verde ou quinta barra em cada grupo corresponde às células incubadas em CM de hRPC diluídas em um fator de 8.
[0041] A FIG. 5 ilustra graficamente um gráfico de barras mostrando a potência do CM de hRPC produzida usando diferentes quantidades de células progenitoras retinais humanas (hRPCs) como medido usando os métodos da presente divulgação. A ciano ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas em SM. A laranja ou segunda barra em cada grupo corresponde às células incubadas em CM de hRPC produzido usando 9,0x106 hRPCs. A cinza ou terceira barra em cada grupo corresponde às células incubadas em CM de hRPC produzido usando 6,0x106 hRPCs.
[0042] A FIG. 6 ilustra graficamente uma série de gráficos de barras mostrando a potência do CM de hRPC produzido a partir de diferentes populações de hRPCs como medido usando os métodos da presente divulgação. No painel esquerdo, a ciano ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas com SM; a laranja ou segunda barra são as células incubadas com CM de hRPC produzido a partir das hRPCs do lote G1; a cinza ou terceira barra corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido a partir das hRPCs do lote G2; a amarela ou quarta barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote G3; e a azul escuro ou quinta barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote G5. No painel direito, a ciano ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas com SM; a laranja ou segunda barra são as células incubadas com CM de hRPC produzido a partir das hRPCs do lote G1; a cinza ou terceira barra corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido a partir das hRPCs do lote G2; a amarela ou quarta barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote G3; e a azul escuro ou quinta barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote G5.
[0043] A FIG. 7 ilustra graficamente um gráfico de barras mostrando a potência do CM de hRPC produzido a partir das diferentes populações de hRPCs como medido usando os métodos da presente divulgação. A ciano ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas com SM; a laranja ou segunda barra são as células incubadas com CM de hRPC produzido a partir das hRPCs do lote G1; a cinza ou terceira barra corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido a partir das hRPCs do lote G2; a amarela ou quarta barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote G3; a azul escuro ou quinta barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote G4; a verde ou sexta barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote G5; a azul claro ou sétima barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote L-SB; e a rosa ou oitava barra em cada grupo corresponde às células incubadas com CM de hRPC produzido usando as hRPCs do lote L-PB.
[0044] A FIG. 8 ilustra graficamente uma série de gráficos de barras mostrando a potência do meio condicionado produzido usando vários tipos de células como medido usando os métodos da presente divulgação. No painel esquerdo, a azul ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas em SM; a laranja ou segunda barra em cada grupo corresponde às células incubadas em CM de hRPC; e a amarela ou terceira barra em cada grupo corresponde às células incubadas em meio condicionado produzido usando as células de retinoblastoma humano. No painel direito, a ciano ou primeira barra em cada grupo corresponde às células incubadas em SM e a verde ou segunda barra em cada grupo corresponde às células incubadas em meio condicionado produzido usando as células epiteliais humanas do pigmento da retina.
[0045] A FIG. 9 mostra os dados de expressão genética para as citocinas selecionadas, escolhidas como fatores neurotróficos candidatos para as hRPCs. Os dados foram obtidos por intermédio de qPCR, a partir de múltiplos tipos de células, incluindo (da esquerda pra direita) hRPC, hRB, hRPE e hFB. Grupo de tipos de células retinais separadamente dos fibroblastos. A linhagem de hRB foi derivada do tumor, todos os outros tipos, do tecido fetal. A expressão do fator trófico putativo OPN ser vista ser a mais alta para as hRPCs.
[0046] A FIG. 10 ilustra graficamente uma série de gráficos mostrando os resultados de um ensaio de potência multiplexada da presente divulgação. O painel do topo esquerdo mostra a viabilidade celular medida. O painel do topo direito mostra a atividade apoptótica medida. O painel do fundo mostra os valores de potência calculados usando os dados mostrados nos painéis de dois topos.
[0047] A FIG. 11 ilustra graficamente os resultados de um ensaio de potência multiplexada da presente divulgação testando o meio condicionado não filtrado e filtrado.
[0048] A FIG. 12 ilustra graficamente os resultados de um ensaio de potência multiplexada da presente divulgação testando um meio condicionado de controle negativo e meio condicionado de controle positivo.
[0049] A FIG. 13 ilustra graficamente os resultados de um ensaio de potência multiplexada da presente divulgação testando o meio condicionado derivado de vários lotes de hRPCs.
[0050] A FIG. 14 ilustra graficamente os resultados de um ensaio de potência multiplexada da presente divulgação testando o meio condicionado derivado das culturas de hRPC com diferentes densidades de semeadura.
[0051] A FIG. 15 ilustra graficamente os resultados de um ensaio de potência multiplexada da presente divulgação testando várias diluições do meio condicionado, indicando que o ensaio de potência multiplexada exibe linearidade de resposta.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0052] O tipo mais comum de doença hereditária da retina (distrofia) é a rinite pigmentosa (RP) e a doença degenerativa mais comum é a degeneração macular relacionada com a idade (AMD). As terapias potenciais incluem o uso das células progenitoras retinais humanas (hRPC) no tratamento de RP e o uso de produtos de células epiteliais humanas derivadas de célula tronco (RPE) no tratamento da AMD. Os testes das hRPCs no tratamento de RP indicaram que o tratamento depende de um efeito neurotrófico que é provável resultar de um coquetel de múltiplas citocinas. O papel destas citocinas foi apenas parcialmente delineado no presente. Por causa da potência de uma hRPC fabricada, o produto celular pode ser esperado variar de lote para lote, isso ajudaria ter um ensaio de potência in vitro simples e conveniente capaz de medir prospectivamente a eficácia trófica de um dado lote do produto celular fabricado antes do uso em pacientes, sem a necessidade do teste in vivo e infraestructure e requerimentos pessoais relacionados.
[0053] O presente método de avalia a potência do tratamento de hRPC é o teste in vivo nos ratos do Royal College of Surgeons (RCS), que são um modelo bem caracterizado de RP autossômico recessivo. Para realizar estes testes, um viveiro com uma colônia de RCS é requerido, junto com uma sala cirúrgica, sala de eletrofisiologia, e laboratório de histologia ocular, todos os quais devem ter uma equipe com pessoal associado com peritos especializados nestas áreas. Deste modo, o presente método de teste in vivo é inconveniente, de habilidade intensiva, trabalho intensivo, tempo intensivo, e recursos intensivos.
[0054] O efeito neurotrófico do tratamento com hRPC tem tornado difícil recapitular em um sistema in vitro. Por exemplo, o efeito trófico do tratamento observado in vivo parece ocorrer no nível dos fotorreceptores, que são células que inoculam para manter in vitro. Em um aspecto, os métodos da presente divulgação provêm um meio de medir a potência de um produto celular fabricado, sem a necessidade de testar em animais e antes do uso em seres humanos. Os métodos da presente divulgação podem somente requerer o uso de instalações de culturas celulares, uma matriz modesta de equipamentos, mais o trabalho de um técnico experiente no decorrer de um único dia.
Também é necessário uma linhagem celular imortal prontamente disponível ou uma linhagem celular de tumor humano e vários outros reagentes prontamente disponíveis. O artigo de teste é uma amostra pequena do meio de cultura celular previamente retirada da cultura vida de um tipo celular terapêutico específico. Note que a instalação de ensaio não precisa lidar com o manuseio de um tipo celular delicado. Deste modo, os métodos da presente divulgação, se comparado com os ensaios in vivo existentes, são baratos, requerem um trabalho mínimo e são eficazes em tempo. Os métodos da presente divulgação reduzem o que foi previamente um processo in vivo de múltiplos meses requerendo uma equipe especializada para um dia, um processo de um técnico.
[0055] A presente divulgação provê os métodos que medem a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula. Os métodos provêm um ensaio de potência in vitro quantitativo que pode ser usado para determinar o quão potentemente uma terapia ou tratamento à base de célula aumenta a viabilidade de uma população de células. Deste modo, o ensaio provê um método de quantificar a potência de um efeito trófico de uma terapia ou tratamento à base de célula. Em um aspecto, os métodos da presente divulgação usam um composto tóxico para prover um insulto metabólico para uma população de células para detectar melhor a potência do efeito trófico de uma terapia ou tratamento à base de célula. Em um exemplo não limitante, os métodos da presente divulgação podem ser usados para testar a potência do efeito trófico das células da retina fetal do doador (células progenitoras retinais) em uma retina hospedeira, notavelmente incluindo cones hospedeiros. As células da retina fetal do doador foram mostradas ter um efeito trófico que não é somente neuroprotetivo, mas também tem um efeito de revitalização rápido nas células residuais hospedeiras da retina tal como determinado pela função visual melhorada. As células doadoras são capazes de integrar na retina e, por intermédio da diferenciação celular, substituem os fotorreceptores (que podem ser em números limitados). O efeito geral é para restaurar e preservar tanto rápida quanto sustentavelmente os graus clinicamente significantes de função visual em uma retina de outro modo destinada a falhar completamente, deixando o paciente completamente cego.
[0056] A presente divulgação provê um método in vitro para medir a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula, o método compreendendo as etapas de: incubar uma primeira pluralidade de células com um composto tóxico e a terapia ou tratamento à base de célula; incubar uma segunda pluralidade de células com um composto tóxico; determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células; determinar a viabilidade da segunda pluralidade de células; e comparar a viabilidade da primeira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, deste modo determinando a potência do tratamento.
[0057] A presente divulgação também provê um método para medir a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula, o método compreendendo as etapas de: incubar uma primeira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado, em que o meio condicionado compreende o meio usado para cultivar a terapia ou tratamento à base de célula; incubar pelo menos uma segunda pluralidade de células com o composto tóxico e meio de controle; determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células; comparar a viabilidade da primeira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, deste modo determinando a potência da terapia ou tratamento à base de célula.
[0058] Em alguns aspectos dos métodos precedentes, a potência é a razão da viabilidade da primeira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células.
[0059] Em alguns aspectos, os métodos precedentes também podem compreender incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado inativo, em que o meio condicionado inativo compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula inativa; determinar a viabilidade da pelo menos uma terceira pluralidade de células; comparar a viabilidade da terceira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, deste modo determinando a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa, comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa para um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia à base de célula inativa é de menos do que igual ao valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido. Sem desejar estar ligado pela teoria, um meio condicionado inativo que compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula inativa é um meio condicionado que é conhecido ser não ativo, não protegerá a terceira pluralidade de células dos efeitos prejudiciais do composto tóxico (por exemplo, butirato de sódio), e portanto, não deve ter um valor de potência acima de um certo valor predeterminado. Deste modo, o meio condicionado inativo serve como um controle negativo - se os resultados de um ensaio particular indicam que o meio condicionado inativo tem de baixa a nenhuma potência, os resultados do ensaio podem ser vistos como mais precisos. Contudo, se os resultados de um ensaio particular indicam que o meio condicionado inativo tem potência, então os resultados do ensaio podem ser comprometidos e não refletem a potência real dos tratamentos com base em célula ou terapias testadas. A terapia ou tratamento à base de célula inativa podem compreender linfócitos T cutâneos, células HuT 78 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0060] Em alguns aspectos, os métodos precedentes também podem compreender incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado ativo, em que o meio condicionado ativo compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula ativa; determinar a viabilidade da pelo menos uma terceira pluralidade de células; comparar a viabilidade da terceira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, deste modo determinando a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa, comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa até um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia com base em célula ativa é maior do que o valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido. Sem desejar estar ligado pela teoria, um meio condicionado ativo que compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula ativa é um meio condicionado que é conhecido ser ativo, protegerá a terceira pluralidade de células dos efeitos nocivos do composto tóxico (por exemplo, butirato de sódio), e portanto, devem ter um valor de potência acima de um certo valor predeterminado. Deste modo, o meio condicionado ativo serve como um controle positivo - se os resultados de um ensaio particular indicam que o meio condicionado ativo tem de pouco a nenhuma potência, então os resultados do ensaio podem ser comprometidos e não refletivos da potência real dos tratamentos ou terapias com base em célula testados. Contudo, se os resultados de um ensaio particular indicam que o meio condicionado ativo tem potência, então os resultados podem ser vistos como precisos. A terapia ou tratamento à base de célula ativa pode compreender as células epiteliais do pigmento da retina (RPEs), células ARPE-19, fibroblastos, células CCD- 1112Sk ou qualquer combinação destas.
[0061] A presente divulgação também provê um método para medir a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula, o método compreendendo as etapas de: incubar uma primeira pluralidade de células com um composto tóxico e a terapia ou tratamento à base de célula; incubar pelo menos uma segunda pluralidade de células com o composto tóxico e meio de controle; determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células; e determinar um valor de proteção de modulação da primeira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade da primeira pluralidade de células para a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade da pelo menos uma segunda pluralidade de células para a atividade de apoptose na pelo menos uma segunda pluralidade de células; e determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da primeira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células. Como aqui usado, este método é indicado como um “ensaio de potência multiplexada”.
[0062] A presente divulgação também provê um método para medir a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula, o método compreendendo as etapas de:
incubar uma primeira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado, em que o meio condicionado compreende o meio usado para cultivar a terapia ou tratamento à base de célula; incubar pelo menos uma segunda pluralidade de células com o composto tóxico e meio de controle; determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células e a pelo menos uma segunda pluralidade de células; e determinar um valor de proteção de modulação da primeira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade da primeira pluralidade de células para a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade da pelo menos uma segunda pluralidade de células para a atividade de apoptose na pelo menos uma segunda pluralidade de células; e determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da primeira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células. Como aqui usado, este método também é indicado como um “ensaio de potência multiplexada”.
[0063] Os métodos precedentes também podem compreender comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula a um valor de corte predeterminado, em que se a potência é maior do que o valor de corte predeterminado então a terapia ou tratamento à base de célula são identificados como suficientemente potentes para a administração a um sujeito.
[0064] Os métodos precedentes também podem compreender comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula a um valor de corte predeterminado; e administrar a um sujeito em necessidade deste pelo menos uma dose terapeuticamente efizaz da terapia ou tratamento celulares quando a potência é maior do que o valor de corte predeterminado.
[0065] Os métodos precedentes também podem compreender incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado inativo, em que o meio condicionado inativo compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula inativa; determinar a viabilidade da pelo menos uma terceira pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na pelo menos terceira pluralidade de células; e determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos uma terceira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade para a atividade de apoptose; e determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da pelo menos uma terceira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células; comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa para um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia à base de célula inativa é menor do que ou igual ao valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido. Sem desejar estar ligado pela teoria, um meio condicionado inativo que compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula inativa é um meio condicionado que é conhecido ser não ativo, não protegerá a terceira pluralidade de células dos efeitos nocivos do composto tóxico (por exemplo, butirato de sódio), e portanto, não deve ter um valor de potência acima de um certo valor prédeterminado. Deste modo, o meio condicionado inativo serve como um controle negativo - se os resultados de um ensaio particular indicam que o meio condicionado inativo tem de baixa a nenhuma potência, os resultados do ensaio podem, ser vistos como mais precisos. contudo, se os resultados de um ensaio particular indicam que o meio condicionado inativo tem potência, então os resultados do ensaio podem ser comprometidos e não refletivos da potência real do tratamentos ou terapias com base em célula testados. A terapia ou tratamento à base de célula inativa podem compreender linfócitos T cutâneos, células HuT 78 ou qualquer combinação dos mesmos.
[0066] Em alguns aspectos, os métodos precedentes podem compreender incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado ativo, em que o meio condicionado ativo compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula ativa; determinar a viabilidade da pelo menos uma terceira pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na pelo menos terceira pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos uma terceira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade para a atividade de apoptose; determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da pelo menos uma terceira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos uma segunda pluralidade de células; e comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa para um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia com base em célula ativa é maior do que o valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido. Sem desejar estar ligado pela teoria, um meio condicionado ativo que compreende o meio usado para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula ativa é um meio condicionado que é conhecido ser ativo, protegerá a terceira pluralidade de células dos efeitos nocivos do composto tóxico (por exemplo, butirato de sódio), e, portanto, devem ter um valor de potência acima de um certo valor predeterminado. Deste modo, o meio condicionado ativo serve como um controle positivo - se os resultados de um ensaio particular indicam que o meio condicionado ativo tem de baixa a nenhuma potência, então os resultados do ensaio podem ser comprometidos e não reflectivos da potência real dos tratamentos ou terapias com base em célula testados. Contudo, se os resultados de um ensaio particular indicam que o meio condicionado ativo tem potência, então os resultados podem ser vistos como precisos. A terapia ou tratamento à base de célula ativa podem compreender as células epiteliais do pigmento da retina (RPEs), células ARPE-19, fibroblastos, células CCD-1112Sk ou qualquer combinação destas.
[0067] Em alguns aspectos, o valor de corte predeterminado pode ser de cerca de 0,5, ou cerca de 1,0, ou cerca de 1,5, ou cerca de 2,0, ou cerca de 3,0, ou cerca de 3,5, ou cerca de 4,0, ou cerca de 4,5, ou cerca de 5,0, ou cerca de 5,5, ou cerca de 6,0, ou cerca de 6,5, ou cerca de 7,0, ou cerca de 7,5, ou cerca de 8,0, ou cerca de 8,5, ou cerca de 9,0, ou cerca de 9,5, ou cerca de 10, ou cerca de 15, ou cerca de 20, ou cerca de 25, ou cerca de 30, ou cerca de 35, ou cerca de 40, ou cerca de 45, ou cerca de 50, ou cerca de 60, ou cerca de 70, ou cerca de 80, ou cerca de 90, ou cerca de 100.
[0068] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, uma terapia ou tratamento à base de célula compreende um meio condicionado. “Meio condicionado” se refere a um meio que é alterado se comparado a um meio padrão, base ou basal. O condicionamento de um meio pode fazer com que as moléculas, tais como nutrientes e/ou fatores de crescimento, sejam adicionados a ou esgotados dos níveis originais encontrados no meio de base. Em alguns aspectos, um meio é condicionado permitindo-se que as células de certos tipos cresçam ou sejam mantidas no meio sob certas condições por um certo período de tempo. Em alguns aspectos da presente divulgação, um meio condicionado é produzido coletando-se o meio usado para cultivar uma terceira pluralidade de células. Em um exemplo não limitante, a terceira pluralidade de células pode compreender as células progenitoras retinais mamíferas (RPCs), as células progenitoras retinais humanas (hRPCs), células epiteliais do pigmento da retina mamíferas (RPEs), células epiteliais humanas do pigmento da retina (hRPEs), células ARPE-19, células tronco/progenitoras neurais, células tronco mesenquimais, células CD34+, células tronco/progenitoras, leucócitos, fibroblastos ou qualquer combinação destas. As células progenitoras retinais mamíferas podem ser as células progenitoras retinais humanas (hRPCs). A terceira pluralidade de células pode compreender hRPCs. Em alguns aspectos, um meio pode ser condicionado permitindo-se que as células progenitoras retinais sejam expandidas, diferenciadas ou mantidas em um meio de composição definida em uma temperatura definida por um número definido de horas. Como será apreciado por aqueles habilitados na técnica, várias combinações de células, tipos de meio, durações e condições ambientais podem ser usados para produzir uma matriz quase infinita de meio condicionado.
[0069] Em alguns aspectos dos métodos como aqui providos, o meio condicionado pode ser produzido coletando-se o meio usado para cultivar, expandir, diferenciar ou manter uma terceira pluralidade de células compreendendo entre 1x106 e 1x107 células progenitoras retinais humanas. Em outros aspectos, a terceira pluralidade de células pode compreender cerca de 9x106 células progenitoras retinais humanas. Em alguns aspectos, a terceira pluralidade de células pode compreender cerca de 8x106 células progenitoras retinais humanas. Em alguns aspectos, a terceira pluralidade de células pode compreender cerca de 6x106 células progenitoras retinais humanas. Em alguns aspectos, a terceira pluralidade de células pode compreender cerca de 4x106 células progenitoras retinais humanas. Os métodos de cultivar e produzir o meio condicionado das células progenitoras retinais humanas são descritos na WO 2012/158910, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em alguns aspectos, o meio condicionado pode ser produzido coletando-se o meio usado para cultivar, expandir diferenciar ou manter uma terceira pluralidade de células que foram semeadas em uma densidade de pelo menos cerca de 1x106 células, ou pelo menos cerca de 2x106 células, ou pelo menos cerca de 3x106 células, ou pelo menos cerca de 4x106 células, ou pelo menos cerca de 5x106 células, ou pelo menos cerca de 6x106 células, ou pelo menos cerca de 7x106 células, ou pelo menos cerca de 8x106 células, ou pelo menos cerca de 9x106 células, ou pelo menos cerca de 10x106 células. Em alguns aspectos, o meio condicionado pode ser produzido coletando-se o meio usado para cultivar, expandir, diferenciar ou manter uma terceira pluralidade de células que foi cultivada por pelo menos cerca de 4 horas, ou pelo menos cerca de 8 horas, ou pelo menos cerca de 12 horas, ou pelo menos cerca de 16 horas, ou pelo menos cerca de 20 horas, ou pelo menos cerca de 24 horas, ou pelo menos cerca de 36 horas, ou pelo menos cerca de 48 horas, ou pelo menos cerca de 60 horas, ou pelo menos cerca de 72 horas após semear.
[0070] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o meio condicionado pode ser filtrado antes do uso em um ensaio da presente divulgação. Em alguns aspectos, o meio condicionado pode ser filtrado usando um concentrador ou dispositivo de filtro em combinação com a centrifugação. Em alguns aspectos, o meio condicionado pode ser filtrado através de um filtro com um MWCO de pelo menos cerca de 3 kDa, ou pelo menos cerca de 10 kDa, ou pelo menos cerca de 30 kDa, ou pelo menos cerca de 50 kDA, ou pelo menos cerca de 100 kDa. Em alguns aspectos, depois do meio condicionado ser filtrado, o “concentrado” ou a fração de
“topo” pode ser isolado para o uso em um método da presente divulgação. Em alguns aspectos, depois do meio condicionado ser filtrado, o “filtrado” ou a fração de “fundo” podem ser isolados para o uso em um método da presente divulgação.
[0071] Em alguns aspectos dos métodos como aqui providos, a terapia ou tratamento à base de célula compreende as células progenitoras retinais mamíferas (RPCs), células progenitoras retinais humanas (hRPCs), células epiteliais do pigmento da retina mamíferas (RPEs), células epiteliais humanas do pigmento da retina (hRPEs), células ARPE-19, células tronco/progenitoras neurais, células tronco mesenquimais, células CD34+, células tronco/progenitoras, leucócitos, fibroblastos ou qualquer combinação destas. As células progenitoras retinais mamíferas podem ser as células progenitoras retinais humanas (hRPCs). A terapia ou tratamento à base de célula pode compreender as hRPCs. As células podem ser células geneticamente modificadas. Em um exemplo não limitante, as células geneticamente modificadas podem ter sido transfectadas com um gene para expressar pelo menos um polipeptídeo. Em um exemplo não limitante, as células geneticamente modificadas podem ter sido infectadas colocando-se em contato as células com pelo menos uma partícula viral, em que a partícula viral compreende pelo menos um polinucleotídeo.
[0072] Em alguns aspectos dos métodos como aqui providos, uma terapia ou tratamento à base de célula ou um meio condicionado podem compreender exossomas e/ou microvesículas. Uma terapia ou tratamento à base de célula ou um meio condicionado podem compreender uma fração a qual é enriquecida em exossomas e/ou microvesículas. Os exossomas e/ou microvesículas podem ser derivados de qualquer tipo celular, incluindo, mas não limitados às células progenitoras retinais mamíferas (RPCs), células progenitoras retinais humanas (hRPCs), células epiteliais mamíferas do pigmento da retina (RPEs), células epiteliais humanas do pigmento da retina (hRPEs), células ARPE-19, células tronco/progenitoras neurais, células tronco mesenquimais, células CD34+, células tronco/progenitoras, leucócitos, fibroblastos ou qualquer combinação destas. As células podem ser as células geneticamente modificadas. Em um exemplo não limitante, as células geneticamente modificadas podem ter sido transfectadas com pelo menos um gene para expressar um polipeptídeo. Em um exemplo não limitante, as células geneticamente modificadas podem ter sido infectadas pelo contato das células com pelo menos uma partícula viral, em que a partícula viral compreende pelo menos um polinucleotídeo. Os exossomas e/ou microvesículas, ou a fração enriquecida em exossomas e/ou microvesículas podem ser purificados usando técnicas de exossomas/microvesícula padrão na técnica, incluindo, mas não limitadas a centrifugação, ultracentrifugação, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca de íons, cromatografia de imunoafinidade, ou qualquer outra prática padrão na técnica.
[0073] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o meio de controle compreende um meio padrão.
[0074] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, uma terapia ou tratamento à base de célula podem ser para tratar uma doença ou condição da retina em um sujeito em necessidade deste. Uma doença ou condição na ratina pode incluir, mas não é limitada a, doença de Usher, rinite pigmentosa (RP), uma doença degenerativa da retina, uma degeneração macular relacionada com a idade (AMD), uma AMD úmida ou uma AMD seca, atrofia geográfica, uma doença fotorreceptora da retina, uma retinopatia diabética, edema macular cistóide, uveíte, um descolamento da retina, um dano na retina, orifícios maculares, telangiectasia macular, um dano na retina traumático ou iatrogênico, doença em uma célula ganglionar ou célula do nervo ótico, um glaucoma ou uma neuropatia ótica, um doença da retina isquêmica tal como retinopatia da prematuridade, oclusão vascular da retina, ou neuropatia ótica isquêmica; ou melhorar uma visão fotópioca (luz do dia); ou melhorar a correção da acuidade visual, ou melhorar a função macular, ou melhorar um campo visual, ou melhorar a visão escotópica (noturna).
[0075] Em alguns aspectos do método precedente, uma primeira pluralidade de células, uma segunda pluralidade de células, uma terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender o mesmo tipo de célula ou podem ser diferentes tipos de célula. Uma primeira pluralidade de células, uma segunda pluralidade de células, uma terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender uma população misturada de diferentes tipos de célula. O tipo de célula pode ser qualquer uma das células primárias isoladas de uma amostra biológica e/ou células do tipo celular não imortais (isto é, células diferenciadas das populações de células pluripotentes/tronco). O tipo de célula pode ser qualquer linhagem celular imortalizada, incluindo, mas não limitado às células espontaneamente imortalizadas. O tipo de célula pode ser células mamíferas de retinoblastoma (RBs), células epiteliais mamíferas do pigmento da retina (RPEs), células progenitoras mamíferas da retina (RPCs), células ARPE-19, células derivadas da célula de Müller, células MIO-M1, células neuronais, células da glia, fibroblastos, células não oculares ou qualquer combinação destas. O tipo de célula pode ser células de retinoblastoma humano (hRBs), células epiteliais humanas do pigmento da retina ou células progenitoras retinais humanas. Uma primeira pluralidade de células, uma segunda pluralidade de células, uma terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser cultivadas em suspensão durante a cultura celular. Uma primeira pluralidade de células, uma segunda pluralidade de células, uma terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser cultivadas usando métodos de cultura de célula aderente.
[0076] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, a primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células podem, cada uma, compreender entre cerca de 1.000 a cerca de 250.000 células. Por via de exemplo não limitantes, a primeira pluralidade de células e a segunda pluralidade de células pode cada uma compreender cerca de 25.000 células. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o número de células na primeira pluralidade de células, na segunda pluralidade de células, na terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser escalonado de acordo com o tamanho da placa de microtitulação que está sendo usada para o ensaio. Em um exemplo não limitante, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender pelo menos cerca de 25.000 células quando os métodos da presente divulgação são realizados em uma placa de 96 poços. Quando uma placa de 6 poços é usada, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender pelo menos cerca de 400.000 células. Quando uma placa de 12 poços é usada, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender pelo menos cerca de
200.000 células. Quando uma placa de 24 poços é usada, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender pelo menos cerca de 100.000 células. Quando uma placa de 48 poços é usada, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender pelo menos cerca de 50.000 células. Quando uma placa de 384 poços é usada, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender pelo menos cerca de 6.250 células. Quando uma placa de 1536 poços é usada, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender pelo menos cerca de 1.562 células.
[0077] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, antes da adição de um composto tóxico e condicionado e/ou meio padrão, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser colocadas em suspensão em pelo menos cerca de 25 µl de meio padrão. A quantidade de meio padrão usado pode ser ajustado com base no tamanho da placa de microtitulação que está sendo usada para o ensaio. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 6 poços é usada, cerca de 400 µl de meio padrão podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 12 poços é usada, cerca de 200 µl de meio padrão podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 24 poços é usada, cerca de 100 µl de meio padrão podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 48 poços é usada, cerca de 50 µl de meio padrão podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 96 poços é usada, cerca de 25 µl de meio padrão podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 384 poços é usada, cerca de 6,25 µl de meio padrão podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 1536 poços é usada, cerca de 1,56 µl de meio padrão podem ser usados.
[0078] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser incubadas com pelo menos cerca de 50 µl a pelo menos cerca de 100 µl de meio condicionado ou meio de controle. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser incubadas com pelo menos cerca de 75 µl de meio condicionado ou meio de controle. A quantidade de meio condicionado ou meio de controle pode ser ajustada com base no tamanho da placa de microtitulação que está sendo usada para o ensaio. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 6 poços é usada, cerca de 1200 µl de meio condicionado ou meio de controle podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 12 poços é usada, cerca de 600 µl de meio condicionado ou meio de controle podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 24 poços é usada, cerca de 300 µl de meio condicionado ou meio de controle podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 48 poços é usada, cerca de 150 µl de meio condicionado ou meio de controle podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 96 poços é usada, cerca de 75 µl de meio condicionado ou meio de controle podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 384 poços é usada, cerca de 18,75 µl de meio condicionado ou meio de controle podem ser usados. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de 1536 é usada, cerca de 4,68 µl de meio condicionado ou meio de controle podem ser usados.
[0079] Em alguns aspectos dos métodos como aqui providos, o composto tóxico pode induzir a apoptose. Em alguns aspectos, o composto tóxico pode induzir a apoptose, autofagia, morte celular Tipo I, morte celular Tipo II, necrose, necroptose, macroautofagia, anoikis, cornificação, excitotoxicidade, ferroptose, morte celular induzida por ativação, morte celular sistêmica, oncose, piroptose, ou qualquer combinação destes.
[0080] Os composto tóxicos podem incluir, mas não são limitados a, agentes de alquilação, antimetabólitos, antibiótico antitumor, agentes quimioterapêuticos, alcalóides, taxanos, agentes antimicrotúbulos, toxinas, permeabilizadores de membrana, inibidores de enzima, antimetabólitos, inibidores mitóticos, inibidores de enzima de reparo de DNA, agentes de dano de DNA, radiação UV, radiação gama, bussulfano, citosina, etopósido, bleomicina, l-asparaginase, carmustina, arabinósido, tenipósido, dactinomicina, hidroxiuréia, clorambucila, floxuridina, vinblastina, daunorubicina, procarbazina, cisplatina, fluorouracila, vincristina, doxorubicina, ciclofosfamida, mercaptopurina, vindesina, mitomicina-c, ifosfamida, metotrexato, taxóides, mitoxantrona, melfalano, gencitabina, plicamicina, antraciclinas de pemetrexed, e/ou epotilonas.
[0081] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o composto tóxico é butirato de sódio. O butirato de sódio pode estar presente em uma concentração entre cerca de 1 mM e cerca de 26 mM. O butirato de sódio pode estar presente em uma concentração entre cerca de 2 mM e cerca de 24 mM. O butirato de sódio pode estar presente em uma concentração entre cerca de 0 mM e cerca de 32 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 0 mM, isto é, não há butirato de sódio adicionado. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 2 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 4 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 6 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 8 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 10 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 12 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 14 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 16 mM. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, o butirato de sódio está presente em uma concentração de cerca de 18 mM, ou cerca de 20 mM, ou cerca de 22 mM, ou cerca de 24 mM, ou cerca de 26 mM, ou cerca de 28 mM, ou cerca de 30 mM, ou cerca de 32 mM, ou cerca de 34 mM, ou cerca de 36 mM, ou cerca de 38 mM, ou cerca de 40 mM.
[0082] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas são incubadas por um período de pelo menos 1 hora, ou pelo menos 12 horas, ou pelo menos 24 horas, ou pelo menos 46 horas, ou pelo menos 48 horas, ou pelo menos 72 horas ou mais antes de determinar a viabilidade da células. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas são incubadas por cerca de 1 hora, ou cerca de 2 horas, ou cerca de 72 horas ou mais. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas são incubadas por pelo menos 46 horas antes de determinar a viabilidade da células.
[0083] Em alguns aspectos dos métodos como aqui providos, determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem compreender usar qualquer ensaio de viabilidade celular conhecido na técnica. Estes incluem, mas não são limitados a, um ensaio de teste de ATP, um ensaio de Calceína AM, um ensaio clonigênico, um ensaio de homodímero de etídio, um ensaio de azul de Evans, um ensaio de hidrólise de diacetato de fluoresceína/tingimento com iodeto de propídio, um ensaio de citometria de fluxo, um ensaio com base em Formazana, um ensaio de MTT, um ensaio de XTT, um ensaio de proteína verde fluorescente, um ensaio de lactato dehidrogenase, um ensaio de violeta de metila, um ensaio de iodeto de propídio, um ensaio de resazurina, um ensaio de azul de tripano, um ensaio de marcação de "nicks" por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase (TUNEL), ou uma combinação destes.
[0084] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas pode compreender determinar a proliferação da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas. Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas compreende medir a capacidade metabólica da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas.
[0085] A capacidade metabólica da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas pode ser medida usando um ensaio com base em fluorescência. Um ensaio com base em fluorescência pode compreender: 1) incubar a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas com resazurina (sal de sódio de 10-óxido de 7-hidróxi-3H- fenoxazina-3-ona) por um período de pelo menos 1 hora, 2) medir a fluorescência da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas. O ensaio com base em fluorescência também pode compreender 3) comparar a fluorescência medida, determinando deste modo a viabilidade da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas. Em alguns aspectos, as células são incubadas com resazurina por um período de tempo de pelo menos cerca de 1 hora, ou pelo menos cerca de 1,5 hora, ou pelo menos cerca de 2,0 horas, ou pelo menos cerca de 2,5 horas, ou pelo menos cerca de 3,0 horas, ou pelo menos cerca de 3,5 horas, ou pelo menos cerca de 4,0 horas, ou pelo menos cerca de 4,5 horas, ou pelo menos cerca de 5,0 horas, ou pelo menos cerca de 5,5 horas, ou pelo menos cerca de 6,0 horas, ou pelo menos cerca de 6,5 horas, ou pelo menos cerca de 7,0 horas, ou pelo menos cerca de 7,5 horas, ou pelo menos cerca de 8,0 horas, ou pelo menos cerca de 8,5 horas, ou pelo menos cerca de 9,0 horas, ou pelo menos cerca de 9,5 horas, ou pelo menos cerca de 10 horas, ou pelo menos cerca de 15 horas, ou pelo menos cerca de 20 horas. A capacidade metabólica da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas pode ser medida usando o Ensaio de Viabilidade Celular CellTiter-Blue®. Em alguns aspectos, o reagente CellTiter-Blue® pode ser diluído em 1:4. Em alguns aspectos, o reagente CellTiter-Blue® pode be diluído em 1:4 em PBS de Dulbecco. Em alguns aspectos o reagente CellTiter-Blue® é não diluído. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser incubadas com pelo menos cerca de 20 µl de reagente CellTiter-Blue® diluído ou não diluído. Em alguns aspectos, a quantidade de reagente CellTiter-Blue® diluído ou não diluído usado pode ser ajustada com base na placa de microtitulação que está sendo usada para o ensaio.
[0086] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação determinar a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células, na segunda pluralidade de células, na terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas pode compreender um ensaio com base em luminescência. O ensaio com base em luminescência pode compreender: incubar a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas com um substrato de caspase-3/7 luminogênico por pelo menos cerca de 1 hora; e medir a luminescência da primeira pluralidade de células, da segunda pluralidade de células e da terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas. A incubação com o substrato de caspase-3/7 luminogênico pode ser por um período de tempo de pelo menos cerca de 1 hora, ou pelo menos cerca de 1,5 horas, ou pelo menos cerca de 2,0 horas, ou pelo menos cerca de 2,5 horas, ou pelo menos cerca de 3,0 horas, ou pelo menos cerca de 3,5 horas, ou pelo menos cerca de 4,0 horas, ou pelo menos cerca de 4,5 horas, ou pelo menos cerca de 5,0 horas, ou pelo menos cerca de 5,5 horas, ou pelo menos cerca de 6,0 horas, ou pelo menos cerca de 6,5 horas, ou pelo menos cerca de 7,0 horas, ou pelo menos cerca de 7,5 horas, ou pelo menos cerca de 8,0 horas, ou pelo menos cerca de 8,5 horas, ou pelo menos cerca de 9,0 horas, ou pelo menos cerca de 9,5 horas, ou pelo menos cerca de 10 horas, ou pelo menos cerca de 15 horas, ou pelo menos cerca de 20 horas. Em alguns aspectos, o substrato de caspase-3/7 luminogênico compreende uma sequência de tetrapeptídeo DEVD que é clivado por caspase-3 ou caspase-7, deste modo produzindo um substrato de luciferase. Em alguns aspectos, o ensaio com base em luminescência é um sistema de ensaio Caspase-Glo® 3/7. Em alguns aspectos, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser incubadas com pelo menos cerca de 120 µl de reagente de ensaio de Caspase-Glo® 3/7. A quantidade de reagente de ensaio de Caspase-Glo® 3/7 pode ser ajustada com base na placa de microtitulação que estpa sendo usada para o ensaio. Em um exemplo não limitante, quando uma placa de microtitulação de 96 poços é usada, cerca de 120 µl de reagente de ensaio de Caspase-Glo® 3/7 podem ser usados.
[0087] Em alguns aspectos dos métodos da presente divulgação, a primeira pluralidade de células, a segunda pluralidade de células, a terceira pluralidade de células ou qualquer combinação destas podem ser incubadas em uma placa de ensaio padrão. Isto inclui, mas não é limitado a uma microtituladora, microplacas, ou placas de micropoços com 6, 12, 14, 48, 96, 384 ou 1536 poços de amostra. A superfície da placa de ensaio pode ser revestida com uma molécula para facilitar a fixação das células na placa de ensaio. Os revestimentos exemplares incluem, mas não são limitados a Poli-D-Lisina ou Fibronectina Humana. a placa de ensaio pode ser deixada não revestida.
[0088] Qualquer um dos aspectos e modalidades acima podem ser combinados com qualquer outro aspecto ou modalidade como aqui divulgado nas seções Sumário e/ou
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0089] Como usado neste Relatório Descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “a,” “o” e “um” incluem os referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0090] A menos que de outro modo especificado ou óbvio do contexto, como aqui usado, o termo “ou” é entendido ser inclusivo e abrange tanto “ou” quanto “e”.
[0091] A menos que especificamente determinado ou óbvio a partir do contexto como aqui usado, o termo “cerca de” é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão do mesmo. Cerca de pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, ou 0,01% do valor determinado. A menos que de outro modo claro a partir do contexto, todos os valores numéricos aqui providos são modificados pelo termo “cerca de.”
[0092] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a invenção pertence. Embora outras sondas, composições, métodos, e kits similares ou equivalentes, aqueles aqui descritos podem ser usados na prática da presente divulgação, os materiais e métodos exemplares são aqui descritos. Deve ser entendido que a terminologia aqui usada é para o propósito de apenas descrever os aspectos particulares, e não é intencionada ser limitante.
EXEMPLOS
[0093] Nos seguintes exemplos, as células de Retinoblastoma Humano (hRB) Y79 (ATCC® HTB-18®) foram expandidas e mantidas para o uso cultivando-se o meio formulado com ATCC® RPMI-1640 suplementado com 20% soro bovino fetal. As células foram mantidas de acordo com as recomendações da ATCC®. As células progenitoras retinais humanas (hRPCs) e as células do epitélio pigmentar da retina humana (células hRPE) foram isoladas de fetos humanos com 18 a 20 semanas de idade e propagadas em meio padrão (SM) compreendendo Advanced DMEM/F12 com 1x suplemento N-2, 1x GlutaMax-1, 20 ng/ml de proteína básica FGF humana e 20 ng/ml de proteína EGF humana.
[0094] Nos seguintes experimentos, o meio condicionado (CM) foi coletado a partir das hRPCs, células de hRB ou hRPE cultivadas em SM por 48 horas (com substituição do SM depois de 24 horas). As células foram coletadas e contadas depois de cada coleta de CM. Exemplo 1 – Substratos revestidos e não revestidos
[0095] Os reagentes de revestimento diferentes foram testados para determinar um substrato adequado para o uso nos métodos da presente divulgação.
[0096] Placas de ensaio opacas de 96 poços foram deixadas não revestidas, revestidas com Poli-D-Lisina ou revestidas com Fibronectina Humana. as placas foram revestidas com Poli-D-Lisina incubando-se de 25 µl a 50 µl de 200 µg/ml de solução Poli-D-Lisina em cada poço por cinco minutos até duas horas na temperatura ambiente. Alternativamente, 250 µl de 200 µg/ml de solução de Poli-D-Lisina foram incubados em cada poço por uma hora na temperatura ambiente. Depois da incubação, as placas foram lavadas com ddH2O, depois deixadas secar no ar por duas horas. As placas foram revestidas com Fibronectina Humana incubando-se 300 µl de 20 µg/ml de solução de Fibronectina Humana a 37ºC durante a noite. Depois da incubação noturna, as placas foram lavadas com DMEM/F12 Avançado.
[0097] As células de Retinoblastoma Humano (hRB) Y79 (ATCC® HTB-18®) foram depois adicionadas a três diferentes placas de ensaio. No caso das placas de Fibronectina Humana, as células de hRB foram observadas colonizar. Por outro lado, nas placas de Poli-D-Lisina, as células de hRB foram observadas distribuir uniformemente. Quando as células foram adicionadas às placas não revestidas no meio padrão de célula progenitora da retina humana, as células se fixaram à placa apesar da falta de revestimento. Deste modo, as placas não revestidas também podem ser usadas nos métodos da presente divulgação. Exemplo 2 – Um ensaio de viabilidade celular com base em fluorescência
[0098] Um ensaio com base em fluorescência para medir a viabilidade celular foi testado para o uso nos métodos da presente divulgação.
[0099] Primeiro, 12,5x103, 2,5x104, 5,0x104, 1,0x105 e 2,0x105 células de Retinoblastoma Humano (hRB) Y79 (ATCC® HTB-18®) foram banhadas em cinco poços separados de uma placa de ensaio de 96 poços e incubadas em 50 µl de SM. Depois de deixar as células assentar por 30 minutos a duas horas, as células foram depois incubadas com 250 µl do meio condicionado de célula progenitora da retina humana depois de ser totalmente misturada. 200 µl do meio foi depois aspirado e 20 µl de reagente CellTiter-Blue® diluído (1:4 em DPBS) compreendendo resazurina (Sal de sódio de 10-óxido de 7-Hidróxi-3H-fenoxazina-3-ona) foram adicionados às células por 1, 2, 3 ou 4 horas a 37ºC. A resazurina é um composto que, quando internalizado pelas células viáveis, é reduzido ao composto conhecido como resorufina. A resorufina é altamente fluorescente, significando que o sinal de fluorescência gerado pode ser usado para determinar a viabilidade das células incubadas com resazurina. As células não viáveis que não tem capacidade metabólica não reduzem a resazurina para resorufina, e, deste modo, nenhum sinal de fluorescência é gerado.
[0100] A fluorescência de cada poço foi medida depois da incubação com resazurina. Os sinais de fluorescência foram lidos em um comprimento de onda de excitação de 520 nm e um comprimento de onda de emissão de 580 a 640 nm. Cada tratamento foi realizado em triplicatas ou quadruplicatas. Como mostrado na FIG. 1, houve uma resposta linear (R2=0,99) para os tempos de incubação de 1, 2 ou 3 horas para todas as quantidades de células. Estes resultados indicam que de modo a obter um efeito de tratamento máximo por célula e minimizar a duração do experimento e a variação intraamostras, os métodos da presente divulgação podem usar 2,5x104 células/poço e um tempo de incubação de Resazurina de 2 horas. Exemplo 3 – Determinar a potência do meio condicionado de célula progenitora da retina humana
[0101] Os métodos da presente divulgação foram usados para testar a potência do meio condicionado de célula progenitora da retina humana.
[0102] Em primeiro lugar, as células de hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram então incubadas com meio condicionado de célula progenitora da retina humana (CM de hRPC) ou meio padrão (SM; meio de célula progenitora da retina humana padrão que não foi exposto às células progenitoras retinais humanas). O meio foi suplementado sem butirato de sódio, 2 mM de butirato de sódio, 4 mM de butirato de sódio ou 8 mM de butirato de sódio. Os 200 mM de butirato de sódio frescos foram adicionados até 250 µl de meio para gerar as várias concentrações de butirato de sódio. O CM de hRPC foi produzido usando 9,0x106 células progenitoras retinais humanas.
[0103] As células de hRB foram incubadas por uma hora ou 72 horas em 300 µl dos vársios meios. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue® como descrito acima. Em resumo, 200 µl da cultura celular foi misturada com 20 µl do reagente CellTiter-Blue® diluído e incubados por de uma a duas horas. A fluorescência de cada amostra foi então medida. Como mostrado na FIG. 2, os sinais de fluorescência mais fortes foram observados depois da incubação de 72 horas (painel direito) se comparado à incubação de uma hora (painel esquerdo) devido à proliferação celular. Não obstante, a apoptose induzida por butirato de sódio dependente de dose significante foi observadas nas amostras incubadas por 72 horas, conforme concentrações mais altas de butirato de sódio resultaram nos sinais de fluorescência diminuídos, indicando a proliferação e viabilidade celulares diminuídas.
[0104] As células que foram incubadas com CM de hRPC apresentaram sinais de fluorescência aumentados tanto para a incubação de uma hora quanto de 72 horas se comparado às células incubadas com SM. Estes resultados indicam que o CM de hRPC aumentou potentemente a viabilidade das células de hRB mesmo na presença do butirato de sódio que induz a apoptose. A potência de CM de hRPC mais alta foi observada nas células incubadas com 8 mM de butirato de sódio, em que the o CM de hRPC apresentou cerca de 2 vezes a potência na viabilidade de célula crescente se comparado ao SM nos pontos de tempo tanto de uma hora quanto de 72 horas. Estes resultados preliminares indicaram que 8 mM de butirato de sódio provê o sinal detectado mais amplo.
[0105] Em um outro experimento, as células de hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram depois incubadas com ou SM de hRPC. O meio foi suplementado sem butirato de sódio, com 8 mM de butirato de sódio, 16 mM de butirato de sódio ou 24 mM de butirato de sódio. O CM de hRPC foi produzido usando 9,0x106 células progenitoras retinais humanas.
[0106] As células de hRB foram incubadas por uma hora. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue®, como descrito acima.
Como mostrado na FIG. 3, as células de hRB incubadas com CM de hRPC apresentaram sinais de fluorescência aumentados se comparado às células hRB incubadas com SM. Esta tendência foi consistente para todas as quatro concentrações de butirato de sódio. Estes resultados indicam que o CM de hRPC aumentou potentemente a viabilidade das células de hRB, mesmo na presença de uma alta concentração de butirato de sódio que induz a apoptose. Exemplo 4 - Determinar a potência do meio condicionado de célula progenitora da retina humana em diferentes doses
[0107] Os métodos da presente divulgação foram usados para testar se a potência do meio condicionado de célula progenitora da retina humana foi dependente da dose.
[0108] Em primeiro lugar, as células hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram depois incubadas com CM de hRPC, SM, CM de hRPC diluído 2 vezes com SM (0,5x CM de hRPC), CM de hRPC diluído 4 vezes com SM (0,25x CM de hRPC) ou CM de hRPC diluído 8 vezes com SM (0,125x CM de hRPC). O meio foi suplementado sem nenhum butirato de sódio ou com 8 mM de butirato de sódio. O CM de hRPC foi produzido usando 9,0x106 células progenitoras retinais humanas.
[0109] As células de hRB foram incubadas por uma hora. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue®, como descrito acima. Como mostrado na Figura 4, as células incubadas com mais CM de hRPC concentrado apresentaram sinais de fluorescência aumentados se comparado às células incubadas com CM de hRPC mais diluído e células incubadas com SM. Estes resultados indicam que o CM de hRPC aumentou potentemente a viabilidade das células de hRB de uma maneira dependente da dose.
[0110] Em um outro experimento, as células de hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram depois incubadas com CM de hRPC produzido usando 9,0x106 células progenitoras retinais humanas (CM de hRPC 9M), CM de hRPC produzido usando 6,0x106 células progenitoras retinais humanas (CM de hRPC 6M) ou SM. O meio foi suplementado sem nenhum butirato de sódio ou com 8 mM butirato de sódio.
[0111] As células de hRB foram incubadas por uma hora. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue®, como descrito acima. Como mostrado na Figura 5, as células incubadas com CM de hRPC 9M apresentaram valores de fluorescência aumentados se comparado às células incubadas com CM de hRPC 6M e as células incubadas com SM em ambas as concentrações de butirato de sódio. Este resultado indica que a potência do tratamento com CM de hRPC é dependente do número de hRPCs usadaspara produzir o meio condicionado.
[0112] Estes resultados indicam que os métodos como aqui providos podem ser usados para determinar a potência da terapia com base em hRPC para o tratamento da rinite pigmentosa. Exemplo 5 - Determinar se a potência do meio condicionado de célula progenitora da retina humana é passível de reprodução usando diferentes populações de hRPC
[0113] Os métodos da presente divulgação foram usados para testar se a potência de meio condicionado de célula progenitora da retina humana foi passível de reprodução quando o meio condicionado foi produzido usando populações separadas de hRPCs de diferentes lotes de produto.
[0114] Em primeiro lugar, as células hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram depois incubadas com CM de hRPC produzido usando 5,4x106/10 ml de hRPCs de um lote designado G1 (5,4 do CM de hRPC G1), o CM de hRPC produzido usando 3,7x106/10 ml de hRPCs de um lote designado G2 (3,7 do CM de hRPC G2), CM de hRPC produzido usando 4,5x106/10 ml de hRPCs de um lote designado G3 (4,5 do CM de hRPC G3), CM de hRPC produzido usando 5,0x106/10 ml de hRPCs de um lote designado G5 (5,0 do CM de hRPC G5) ou SM. O meio não foi suplementado com butirato de sódio ou foi suplementado com 8 mM de butirato de sódio.
[0115] As células de hRB foram incubadas por 2 horas. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue®, como descrito acima. Como mmostrado no painel esquerdo da Figura 6, as células incubadas com CM de hRPC apresentaram valores de fluorescência aumentados se comparado às células incubadas com SM em ambas as concentrações de butirato de sódio. Este aumento foi observado independentemente do lote de hRPCs usado para gerar o meio condicionado.
[0116] Em um outro experimento, as células de hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram depois incubadas com CM de hRPC produzido usando 3,7x106/10 ml de hRPCs de um lote designado G1 (3,7 do CM de hRPC G1), CM de hRPC produzido usando 2,9x106/10 ml de hRPCs de um lote designado G2 (2,9 do CM de hRPC G2), CM de hRPC produzido usando 3,35x106/10 ml de hRPCs de um lote designado G3 (3,35 do CM de hRPC G4), CM de hRPC produzido usando 3,25x106/10 ml de hRPCs de um lote designado G5 (3,25 do CM de hRPC G5) ou SM. O meio não foi suplementado com butirato de sódio ou foi suplementado com 8 mM de butirato de sódio.
[0117] As células de hRB foram incubadas por 2 horas. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue®, como descrito acima. Como mostrado no painel direito da Figura 6, as células incubadas com CM de hRPC apresentaram valores de fluorescência aumentados se comparado às células incubadas com SM em ambas as concentrações de butirato de sódio. Este aumento foi observado independentemente da fonte das hRPCs usadas para gerar o meio condicionado.
[0118] Em um outro experimento, as células de hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram depois incubadas com CM de hRPC produzido usando 2,038x106/4 ml de hRPCs de um lote designado G1 (2,038 do CM de hRPC G1), CM de hRPC produzido usando 1,774x106/4 ml de hRPCs de um lote designado G2 (1,774 do CM de hRPC G2), CM de hRPC produzido usando 1,543x106/4 ml hRPCs de um lote designado G3 (1,543 do CM de hRPC G3), CM de hRPC produzido usando 1,542x106/4 ml de hRPCs de um lote designado G4 (1,542 do CM de hRPC G4), CM de hRPC produzido usando 1,318x106/4 ml de hRPCs de um lote designado G5 (1,318 do CM de hRPC G5), CM de hRPC produzido usando 1,977x106/4 ml de hRPCs de uma Amostra do Banco de Sementes CMO designada L-SB (CM de hRPC L-SB), CM de hRPC produzido usando
1,162x106/4 ml de hRPCs de uma Amostra do Banco de Produto L designada L-PB (CM de hRPC L-PB), ou SM. O meio foi suplementado com sem nenhum butirato de sódio ou com 8 mM de butirato de sódio.
[0119] As células de hRB foram incubadas por 2 horas. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue®, como descrito acima. Como mostrado na Figura 7, as células incubadas com CM de hRPC apresentaram valores de fluorescência aumentados se comparado às células incubadas com SM em ambas as concentrações de butirato de sódio. Este aumento foi observado independentemente da fonte das hRPCs usadas para gerar o meio condicionado.
[0120] Os resultados neste exemplo indicam que as diferentes populações de hRPCs pode ser usadas para produzir um meio condicionado potente. A potência do meio condicionado de diferentes lotes de hRPC mostraram uma atividade metabólica consistentemente elevada contra o SM. Embora houve algumas diferenças na potência entre os lotes, isto é mais provável devido à falta de padronização na hora da coleta do meio condicionado. Exemplo 6 - Determinar se a potência do meio condicionado de célula progenitora da retina humana é específica
[0121] Os métodos da presente divulgação foram usados para testar se a potência do CM de hRPC foi específica para o meio condicionado produzido usando as hRPCs contra o meio condicionado produzido usando outros tipos de células.
[0122] Em primeiro lugar, as células hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram depois incubadas com CM de hRPC produzido usando 9,0x106 células progenitoras retinais humanas (9M do CM de hRPC), meio condicionado de hRB produzido usando 12,2x106 células de hRB (12,2M do CM de hRB) ou SM. O meio não foi suplementado com butirato de sódio ou foi suplementado com 8 mM de butirato de sódio.
[0123] As células de hRB foram incubadas por 1 ou 2 horas. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue®, como descrito acima. Como mostrado no painel esquerdo da Figura 8, as células incubadas com meio condicionado de hRPC apresentaram sinais de fluorescência aumentados se comparado às células incubadas com meio condicionado de hRB e SM. Esta tendência foi consistente para todas as concentrações de butirato de sódio.
[0124] Em um outro experimento, as células de hRB foram banhadas em uma placa de ensaio em uma densidade de 2,5x104 células/poço. As células foram depois incubadas com meio condicionado de célula epitelial do pigmento da retina humano produzido usando 7,0x106 células epiteliais humanas do pigmento da retina (7M do CM de hRPE) ou meio padrão (SM; meio de célula progenitora da retina humana padrão o qual não foi exposto às células progenitoras retinais humanas). O meio foi suplementado sem nenhum butirato de sódio ou com 8 mM de butirato de sódio.
[0125] As células de hRB foram incubadas por 1 ou 2 horas. Depois da incubação, a viabilidade celular foi medida usando o reagente CellTiter-Blue®, como descrito acima. Como mostrado na Figura 8, as células incubadas com o meio condicionado de hRPE apresentaram sinais de fluorescência aumentados se comparado às células incubadas com SM. Esta tendência foi consistente para todas as concentrações de butirato de sódio. Sumário dos Exemplos de 1 a 6
[0126] Embora o tipo celular alvo usado nos exemplos precedentes (linhagem de hRB) difere substancialmente dos alvos celulares in vivo antecipados (isto é, retina dos pacientes), os métodos da presente divulgação ainda assim demonstram a capacidade de detectar e discriminar diferentes níveis de atividade trófica difusível das células terapêuticas. A seleção de uma célula alvo altamente anormal para o uso no ensaio torna os métodos da presente divulgação altamente adaptáveis a uma variedade de diferentes contextos da doença, particularmente, aqueles que podem ter um tipo celular alvo que é recalcitrante para a experimentação in vitro. Exemplo 7 – Coleta do meio condicionado
[0127] O seguinte exemplo descreve a produção e coleta do meio condicionado para o uso nos métodos da presente divulgação. Mais especificamente, este exemplo descreve a coleta do meio condicionado usado para cultivar as hRPCs.
[0128] Primeiro, os frascos contendo as células de hRPC foram removidos do nitrogênio líquido e suas tampas foram afrouxadas em uma capa de cultura celular para liberar a pressão. As tampas foram então reapertadas. As células de hRPC foram depois descongeladas colocando-se os frascos em um banho de água a 37ºC por 2 a 3 minutos até os cristais de gelo desaparecerem. A suspensão celular inteira (~1 ml/frasco) foi então transferida usando uma ponta de pipeta de 1 ml em um tubo de fundo cônico de 15 ml. O frasco foi lavado com meio padrão frio fresco (SM) 1 a 2 vezes e o SM usado para lavagem foi adicionado à suspensão celular às gotas. A mistura celular inteira foi depois gentilmente agitada.
[0129] 10 a 14 ml de SM frio fresco foram adicionados à suspensão celular no tubo de fundo cônico de 15 ml e a mistura foi gentilmente agitada. As células foram depois peletizadas centrifugando-se o tubo a 300x g por 5 minutos. O sobrenadante foi depois aspirado e descartado. O SM frio fresco foi depois usado para recolocar em suspensão a pelota celular usando uma ponta de pipeta de 1 ml para pipetar gentilmente a pelota celular para cima e para baixo de 6 a 8 vezes. A viabilidade celular e o número de células foram depos medidos usando um Hemocitômetro ou Contador Countess. Com base no número celular medido, 8 milhões de células vivas dissociadas foram semeadas em um novo frasco de T75 prerrevestido com fibronectina em um SM fresco de 10 ml. A cultura celular foi depois imediatamente balançadas de maneira gentil.
[0130] Depois de semear, as células foram inspecionadas por um microscópio invertido para garantir que as células foram uniformemente distribuídas no frasco de cultura celular. Se uma distribuição não uniforme foi observada, as células foram de novo gentilmente balançadas até uma distribuição uniforme ser obtida. As células foram depois incubadas a 37ºC e 5% de CO2.
[0131] No dia seguinte, as células foram verificadas sob um microscópio invertido e seus estados foram registrados. Após a observação, o meio de cultura celular inteiro foi aspirado do frasco de cultura de hRPC e descartado. Depois, 10 ml de SM preaquecido (37ºC) foi adicionado a cada frasco T75. As células foram depois incubadas a 37ºC e 5% de CO2.
[0132] Em seguida, o estado das células foi novamente verificado sob um microscópio invertido. O meio condicionado foi depois aspirado e coletado dos frascos de cultura de hRPC. O meio foi depois centrifugado por 5 minutos a 475x g. O meio condicionado centrifugado foi depois colocado em um bloco frio. O meio condicionado foi depois aliquotado em tubos de 1,5 ml com um dado cuidado para evitar aspirar a pelota no fundo do tubo contendo células mortas e detritos celulares. O meio condicionado aliquotado foi depois imediatamente transferido a -80ºC para um armazenamento de longo termo para o uso nos métodos da presente divulgação.
[0133] Subsequentemente, 5 ml de meio de SM preaquecido a 37ºC foram adicionados aos frascos de cultura de T75 contendo as células de hRPC. Os frascos foram depois gentilmente balançadas e o meio foi aspirado e descartado. 4 ml da solução de trabalho TrypLE Select foram depois adicionados a cada frasco T75, e o frasco foi depois gentilmente balançadas para cobrir completamente a superfície na qual as células foram cultivadas com a solução de trabalho TrypLE Select. As células foram incubadas na solução de trabalho TrypLE Select por cinco minutos a 37ºC e 5% de CO2.
[0134] Depois da incubação, as células foram examinadas sob um microscópio invertido para garantir que pelo menos 95% das células foram separadas da superfície de cultura celular. Se outra separação foi necessária, o frasco de cultura foi novamente agitado.
[0135] Para interromper a dissociação enzimática das células, 5 ml de SM foi adicionado ao frasco T75. O meio foi depois gentilmente titulado para lavar as células da superfície do frasco usando uma pipeta sorológica estéril. A suspensão celular foi depois transferida a um tubo estéril de 15 ml. O tubo foi depois colocado em um bloco frio. O frasco T75 foi depois novamente lavado usando um adicional de 5 ml de SM fresco, que foi depois transferido ao tubo de 15 ml estéril. O tubo cônico de 15 ml contendo as células foram depois centrifugados em uma centrífuga de mesa a 300x g por 5 minutos a 4ºC. Depois da centrifugação, o sobrenadante foi aspirado e descartado. A solução de BSS Plus Fria (4°C) foi depois adicionada às células peletizadas. A pelota foi depois recolocada em suspensão usando uma ponta de pipeta de 1 ml para pipetar gentilmente a solução de BSS Plus para cima e para baixo de 6 a 10 vezes. A suspensão foi continuamente mantida fria. Finalmente, a viabilidade celular e o número celular foram medidos usando um Hemocitômetro ou Contador
Countess. Exemplo 8 - Ensaio de potência multiplexada da presente divulgação
[0136] Este exemplo descreve vários experimentos compreendendo o ensaio de potência multiplexada da presente divulgação e seu uso na determinação da potência de uma terapia ou tratamento à base de célula.
[0137] Em um exemplo não limitante de um ensaio de potência multiplexada, as células RB foram banhadas em uma placa de 96 poços. Para cada poço, 25.000 células RB foram banhadas em 25 µl de SM. Cada poço foi então tratado com 75 µl de meio condicionado (em alguns casos, meio condicionado diluído dependendo do experimento) ou 75 µl de um meio de controle (meio padrão, um meio condicionado de controle positivo, um meio condicionado de controle negativo). O butirato de sódio foi depois adicionado a cada poço até uma concentração final de 16 mM. Em alguns experimentos, o butirato de sódio foi adicionado até uma concentração final de 8 mM, 16 mM ou 32 mM, ou nenhum butirato de sódio foi adicionado, para determinar o efeito da concentração de butirato de sódio na saída do ensaio. As células foram depois incubadas por 46 horas a 37ºC.
[0138] Depois de 46 horas de incubação, 20 µl de reagente CellTiter-Blue® (diluído em 1:4 com PBS de Dulbecco) foram adicionados a cada poço. As células foram depois inzzcubadas a 37ºC. Depois da incubação, a viabilidade das células foi medida registrando-se a fluorescência de cada poço a (530Ex/590Em).
[0139] Depois de medir viabilidade celular, um volume igual (120 µl) de reagente Caspase-Glo® 3/7 foi adicionado a cada poço. As células foram depois incubadas na temperatura ambiente por 1,5 hora para obter o curso estável da saída de luciferase. Depois da incubação, a luminescência de cada poço foi medida para determinar a atividade de apoptose em cada poço. O valor de proteção de modulação para cada poço foi depois calculada como descrito acima. Um valor de potência para cada poço foi depois calculado tomando-se a razão do valor de proteção de modulação de cada poço e normalizando ao valor de proteção de modulação calculado para o poço usando um meio de controle, mais especificamente um meio padrão.
[0140] A Figura 10 mostra os resultados de um experimento usando o método multiplexado precedente com quantidades variantes de butirato de sódio bem como condições compreendendo o meio padrão, meio condicionado de uma população de hRPCs ou meio condicionado de uma população diferente das hRPCs. O painel do topo esquerdo da Figura 10 mostra a viabilidade medida para cada condição usando o reagente CellTiter-Blue®. O painel do topo direito da Figura 10 mostra a atividade de apoptose medida para cada condição usando o reagente Caspase-Glo® 3/7. O painel de fundo da Figura 10 mostra o valor de potência, como calculado descrito acima. Estes resultados indicam que o meio condicionado de ambas as populações de hRPCs protegem as células RB dos efeitos nocivos do butirato de sódio. Adicionalmente, os resultados indicam que o uso de 16 mM de butirato de sódio resulta nos sinais de potência mais amplos usando o ensaio de potência multiplexada da presente divulgação.
[0141] A Figura 11 mostra os resultados de um experimento usando o método multiplexado precedente usando 16 mM de butirato de sódio e meio condicionado que foi não filtrado ou filtrado. Em resumo, 10 ml do meio condicionado das hRPCs foram adicionados a um dispositivo de filtro Amicon® Ultra 3K (Millipore UFC900324). Usando um rotor de balde oscilante, o dispositivo com o meio condicionado foi centrifugado a
4.000x g por cerca de 10 a 15 minutos. A fração de “topo” ou “concentrado” foi recuperada inserindo-se uma pipeta no dispositivo de filtro e retirando a amostra com um movimento de varredura de lado-a-lado para garantir a recuperação total. A fração de “fundo” ou “filtrado” fração foi recuperada removendo-se o dispositivo de filtro e coletando a parte da amostra que fluiu através do filtro. Como mostrado na Figura 11, o meio condicionado não filtrado protegeu as células RB dos efeitos nocivos do butirato de sódio. Ao contrário, a fração de “fundo” ou “filtrado” não protegeu as células RB no mesmo grau.
[0142] A Figura 12 mostra os resultados de um experimento usando o método multiplexado precedente usando 16 mM de butirato de sódio bem como o meio padrão, meio condicionado das células HuT78 e meio condicionado das células ARPE-19. O meio condicionado das células HuT78 é um meio condicionado de controle negativo, considerando que este meio condicionado é esperado não proteger as células RB dos efeitos nocivos do butirato de sódio. O meio condicionado que forma as células ARPE-19 é um meio condicionado de controle positivo, considerando que este meio condicionado é esperado proteger as células RB dos efeitos nocivos do butirato de sódio. Como mostrado na Figura 12, enquanto o meio condicionado de ARPE-19 protegeu as células de RB, como esperado, o meio condicionado de HuT78 não o fez. Deste modo, os métodos da presente divulgação podem compreender o uso do meio condicionado de controle positivo e negativo para garantir a integridade do ensaio sendo realizado.
[0143] A Figura 13 mostra os resultados de um experimento usando o método multiplexado precedente usando 16 mM de butirato de sódio bem como o meio padrão, meio condicionado de três diferentes “lotes” (populações diferentes, G1, G2 e G5) de hRPCs e meio condicionado das células CCD-1112Sk. O meio condicionado das células CCD-1112Sk é um meio condicionado de controle positivo, considerando que este meio condicionado é esperado proteger as células RB dos efeitos nocivos do butirato de sódio. Como mostrado na Figura 13, o meio condicionado de todos os três lotes de hRPCs e o meio condicionado de controle positivo das células CCD- 1112Sk todos protegeram as células RB dos efeitos nocivos do butirato de sódio. Deste modo, estes resultados indicam que os métodos da presente divulgação podem ser usados para testar os “lotes” independentes de diferentes tratamentos ou terapias com base em célula e que os valores de potência são robustos.
[0144] A Figura 14 mostra os resultados de um experimento usando o método de multiplexo precedente usando 16 mM de butirato de sódio bem como o meio padrão e meio condicionado das culturas de hRPCs com densidades variantes de semeadura. O meio condicionado foi coletado usando um método similar àquele no Exemplo 7, exceto que as densidades de semeadura celular de 4 milhões, 6 milhões ou 9 milhões foram usadas. Como mostrado na Figura 14, o meio condicionado derivado das culturas de hRPC com densidades de semeadura mais altas provêm mais proteção para as células de RB contra os efeitos nocivos do butirato de sódio. Deste modo, os valores de potência medidos dos métodos da presente divulgação podem apresentar dependência de dose. Exemplo 9 – Os métodos da presente divulgação apresentam linearidade
[0145] Este exemplo descreve um experimento que demonstra os métodos da presente divulgação apresentam linearidade nas potências medidas quando uma série de diluição do meio condicionado (CM) é usado.
[0146] Em primeiro lugar, as células de RB foram colocadas em uma placa de 96 poços. Para cada poço, 25.000 células RB foram banhadas em 25 µl de SM. Uma série de diluição do meio condicionado (por exemplo, produzida usando os métodos do Exemplo 7) foi então preparada como segue: i. 100% de CM: apenas CM ii. 75% de CM: 75% de CM+25% de SM iii. 50% de CM: 50% de CM+50% de SM iv. 25% de CM: 25% de CM+75% de SM v. 12,5% de CM: 12,5% de CM+87,5% de SM vi. 0% de CM: 100% de SM
[0147] 75 µl de cada um dos meios condicionados (“a” a “f”) foram adicionados para separar os poços na placa de 96 poços. O butirato de sódio foi depois adicionado a cada poço para uma concentração final de 16 mM de butirato de sódio. As células foram depois incubadas por 46 horas a 37ºC.
[0148] Depois de 46 horas de incubação, 20 µl de reagente CellTiter-Blue® (diluído a 1:4 com PBS de Dulbecco) foram adicionados a cada poço. As células foram depois incubadas a 37ºC. Depois da incubação, a viabilidade das células foi medida registrando-se a fluorescência de cada poço a (530Ex/590Em).
[0149] Depois de medir a viabilidade celular, um volume igual (120 µl) de reagente Caspase-Glo® 3/7 foi adicionado a cada poço. As células foram depois incubadas na temperatura ambiente por 1,5 hora para obter o curso estável da luciferase de saída. Depois da incubação, a luminescência de cada poço foi medida para determinar a atividade de apoptose em cada poço.
[0150] O valor de proteção de modulação para cada poço foi depois calculada como descrito acima. Um valor de potência para cada poço foi depois calculado tomando-se a razão do valor de proteção de modulação de cada poço e normalizando ao valor de proteção de modulação calculado para o poço compreendendo 0% de CM (100% de
SM). Como mostrado na Figura 15, a saída do método apresenta linearidade. A condição compreendendo 100% de CM teve um valor de potência medido de aproximadamente 4,61. A condição compreendendo 75% de CM teve um valor de potência medido de aproximadamente 3,54, que é aproximadamente o mesmo que 0,75x o valor da condição de potência de 100% de CM (0,75 x 4,61). Similarmente, a condição compreendendo 50% de CM teve um valor de potência medido de aproximadamente 2,38, que é aproximadamente o mesmo que 0,5x o valor de potência das condição de 100% de CM (0,5 x 4,61). Deste modo, os métodos da presente divulgação provêm uma potência de saída que é linear.
EQUIVALENTES
[0151] Os detalhes de uma ou mais modalidades como aqui providos são apresentados e na descrição acompanhante acima. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais exemplares são agora descritos.
[0152] A descrição anterior foi apresentada somente para os propósitos de ilustração e não é intencionada limitar a invenção para a forma precisa divulgada, mas pelas reivindicações anexas a esta.
[0153] Modificações podem ser feitas ao antecedente sem romper com os aspectos básicos da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes substanciais com referência a uma ou mais modalidades específicas, aqueles de habilidade comum na técnica reconhecerão que mudanças podem ser feitas às modalidades especificamente divulgadas neste pedido, e ainda, estas modificações e melhorias estão dentro do escopo e espírito da invenção. A invenção aqui ilustrativamente descrits pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer/quaisquer elemento(s) não especificamente aqui divulgados. Deste modo, por exemplo, em cada caso aqui contido, qualquer um dos termos “compreendendo”, “consistindo essencialmente de”, e “consistindo de” podem ser substituídos com cada um dos outros dois termos. Deste modo, os termos e expressões que foram utilizados são usados como termos de descrição e não de limitação, os equivalentes das características mostrados e descritos, ou porções destes, não são excluídos, e é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção.
As modalidades da invenção são apresentadas nas seguintes reivindicações.

Claims (39)

REIVINDICAÇÕES:
1. Método para medir a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: incubar uma primeira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado, em que o meio condicionado compreende os meios usado para cultivar a terapia ou tratamento à base de célula; incubar pelo menos uma segunda pluralidade de células com o composto tóxico e meios de controle; determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células; e comparar a viabilidade da primeira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, determinando deste modo a potência da terapia ou tratamento à base de célula.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a potência é a razão da viabilidade da primeira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células.
3. Método para medir a potência de uma terapia ou tratamento à base de célula, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: incubar uma primeira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado, em que o meio condicionado compreende os meios usados para cultivar a terapia ou tratamento à base de célula; incubar pelo menos uma segunda pluralidade de células com o composto tóxico e meios de controle; determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células; determinar a atividade da apoptose na primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da primeira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade da primeira pluralidade de células para a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células;
determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos segunda pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade da pelo menos segunda pluralidade de células para a atividade de apoptose na pelo menos segunda pluralidade de células; e determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da primeira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos segunda pluralidade de células.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula com um valor de corte predeterminado, em que se a potência for maior do que o valor de corte predeterminado então a terapia ou tratamento à base de célula é identificada como suficientemente potente para a administração a um sujeito.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula com um valor de corte predeterminado; e administrar a um sujeito em necessidade do mesmo pelo menos uma dose terapeuticamente eficaz da terapia ou tratamento de célula quando a potência é maior do que o valor de corte predeterminado.
6. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o valor de corte predeterminado é de cerca de 2.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a terapia ou tratamento à base de célula compreende células progenitoras retinais (RPCs), células epiteliais pigmentares retinais (RPEs), células ARPE-19, células tronco/progenitoras neurais, células tronco mesenquimatosas, células CD34+, células tronco/progenitoras, leucócitos, fibroblastos ou qualquer combinação dos mesmos.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a terapia ou tratamento à base de célula compreende exossomas derivados de células selecionados das células progenitoras retinais (RPCs), células epiteliais pigmentares retinais (RPEs), células ARPE-19, células tronco/progenitoras neurais, células tronco mesenquimatosas, células CD34+, células tronco/progenitoras, leucócitos, fibroblastos e qualquer combinação dos mesmos.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a terapia ou tratamento à base de célula compreende RPCs.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células compreendem células de retinoblastoma (RB), células epiteliais pigmentares retinais (RPEs), células ARPE-19, células derivadas da célula de Muller, células MIO-M1, células neuronais, células gliais, fibroblastos, células não oculares ou qualquer combinação dos mesmos.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células compreendem células RB.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células compreendem pelo menos cerca de 1.000 células RB a pelo menos cerca de 250.000 células RB em pelo menos cerca de 10 μl a pelo menos cerca de 40 μl de meio.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células compreende pelo menos ml cerca de 25.000 células RB em pelo menos ml cerca de 25 μl de meios.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células são incubadas com pelo menos ml cerca de 50 μl a pelo menos ml cerca de 100 μl de meio condicionado e meios de controle, respectivamente.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células são incubadas com pelo menos ml cerca de 75 μl de meio condicionado e meios de controle, respectivamente.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o composto tóxico induz apoptose.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o composto tóxico é butirato de sódio.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o butirato de sódio está presente em uma concentração de menos cerca de 2 mM a menos cerca de 32 mM.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o butirato de sódio está presente em uma concentração de menos cerca de 16 mM.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células são incubadas por um período de tempo de pelo menos cerca de 1 hora a pelo menos mm cerca de 72 horas.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células são incubadas por um período de tempo de pelo menos mm cerca de 46 horas.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que determinar a viabilidade da primeira pluralidade de células e da pelo menos segunda pluralidade de células compreende medir a capacidade metabólica da primeira pluralidade de células e da pelo menos segunda pluralidade de células.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a capacidade metabólica é medida usando um ensaio com base na fluorescência.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o ensaio com base na fluorescência compreende: incubar a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células com resazurin (sal de sódio de 7-Hidróxi-3H-fenoxazin-3-ona 10-óxido) durante um período de pelo menos mm cerca de 1 hora; e medir a fluorescência da primeira pluralidade de células e da pelo menos segunda pluralidade de células.
25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o ensaio com base na fluorescência é um Ensaio de Viabilidade de Célula CellTiterBlue®.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 20 μl de reagente CellTiterBlue® diluído 1:4 são adicionados à primeira pluralidade de células e à pelo menos segunda pluralidade de células.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 26, caracterizado pelo fato de que a atividade de apoptose na primeira pluralidade de células e na pelo menos segunda pluralidade de células é medida usando um ensaio com base na fluorescência.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o ensaio com base na fluorescência compreende: incubar a primeira pluralidade de células e a pelo menos segunda pluralidade de células com um substrato luminogênico de caspase-3/7 durante pelo menos cerca de 1 hora; e medir a luminescência da primeira pluralidade de células e da pelo menos segunda pluralidade de células.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o substrato luminogênico de caspase-3/7 compreende uma sequência tetrapeptídica DEVD que é clivada pela caspase-3 ou caspase-7, produzindo deste modo um substrato da luciferase.
30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o ensaio com base na fluorescência é um sistema de ensaio de Caspase- Glo® 3/7.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 120 μl de reagente de ensaio de Caspase-Glo® 3/7 são adicionados à primeira pluralidade de células e à pelo menos segunda pluralidade de células.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado inativo, em que o meio condicionado inativo compreende os meios usados para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula inativa; determinar a viabilidade da pelo menos terceira pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na pelo menos terceira pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos terceira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade para a atividade de apoptose; determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da pelo menos terceira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos segunda pluralidade de células; e comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa com um valor de corte predeterminado, em que se a terapia à base de célula inativa for menor do que ou igual ao valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 4 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado inativo, em que o meio condicionado inativo compreende os meios usados para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula inativa; determinar a viabilidade da pelo menos terceira pluralidade de células; comparar a viabilidade da terceira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, determinando deste modo a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa; e comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula inativa com um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia à base de célula inativa for menor do que ou igual ao valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido.
34. Método de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que a terapia ou tratamento à base de célula inativa compreende linfócitos T cutâneos, células HuT 78 ou qualquer combinação dos mesmos.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 32 e 34, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado ativo, em que o meio condicionado ativo compreende os meios usados para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula ativa; determinar a viabilidade da pelo menos terceira pluralidade de células; determinar a atividade de apoptose na pelo menos terceira pluralidade de células; determinar um valor de proteção de modulação da pelo menos terceira pluralidade de células, em que o valor de proteção de modulação é a razão da viabilidade para a atividade de apoptose; determinar a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa, em que a potência é a razão do valor de proteção de modulação da pelo menos terceira pluralidade de células para o valor de proteção de modulação da pelo menos segunda pluralidade de células; e a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa para um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia à base de célula ativa for maior do que o valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 4 a 31 e 33 a 34, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: incubar pelo menos uma terceira pluralidade de células com um composto tóxico e meio condicionado ativo, em que o meio condicionado ativo compreende os meios usados para cultivar uma terapia ou tratamento à base de célula ativa; determinar a viabilidade da pelo menos terceira pluralidade de células; comparar a viabilidade da terceira pluralidade de células com a viabilidade da segunda pluralidade de células, determinando deste modo a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa; e comparar a potência da terapia ou tratamento à base de célula ativa com um valor de corte predeterminado, em que se a potência da terapia à base de célula ativa for maior do que o valor de corte predeterminado, então o método é identificado como válido.
37. Método de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que a terapia à base de célula ativa compreende células epiteliais pigmentares retinais (RPEs), células ARPE-19, fibroblastos, células CCD1112Sk ou qualquer combinação dos mesmos.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo fato de que os meios de controle compreendem meios padrão.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que a terapia ou tratamento à base de célula é para tratar uma doença ou condição retinais.
Petição 870210045811, de 20/05/2021, pág. 55/69 Incubação de 1 hora Incubação de 2 horas Incubação de 3 horas Incubação de 4 horas 1/15
Fluorescência
Fluorescência Fluorescência
Fluorescência Células/poço (x10³) Células/poço (x10³) Células/poço (x10³) Células/poço (x10³)
Petição 870210045811, de 20/05/2021, pág. 56/69 Tratamento de 1 hora Tratamento de 72 horas 2/15
Fluorescência
Fluorescência CM de hRPC CM de hRPC
Butirato de Sódio Butirato de Sódio
CM de hRPC
Butirato de Sódio
Fluorescência
Petição 870210045811, de 20/05/2021, pág. 58/69 4/15
CM de hRPC
0,5x CM de hRPC
Fluorescência 0,25x CM de hRPC 0,125 CM de hRPC
Butirato de Sódio
6M do CM de hRPC 9M do CM de hRPC
Butirato de Sódio
Fluorescência
Petição 870210045811, de 20/05/2021, pág. 60/69 3,7 do CM de hRPC G1 5,4 do CM de hRPC G1
2,9 do CM de hRPC G2 3,7 do CM de hRPC G2 6/15
3,35 do CM de hRPC G3
Fluorescência 4,5 do CM de hRPC G3
Fluorescência 5,0 do CM de hRPC G5 3,25 do CM de hRPC G5
Butirato de Sódio Butirato de Sódio
Butirato de Sódio
Fluorescência
Petição 870210045811, de 20/05/2021, pág. 62/69 8/15
Fluorescência Fluorescência 9M do CM de hRPC 7M do CM de hRPC
12,5M do CM de hRPC
Butirato de Sódio Butirato de Sódio
Petição 870210045811, de 20/05/2021, pág. 64/69 Fluorescência Butirato de Sódio Butirato de Sódio 10/15
Proteção
Potência Butirato de Sódio
Fundo de hRPC-S5
Butirato de Sódio
Potência
Petição 870210045811, de 20/05/2021, pág. 66/69 Potência Meio condicionado de controle negativo 12/15
Meio condicionado de controle positivo
Butirato de Sódio
Petição 870210045811, de 20/05/2021, pág. 67/69 Potência 13/15
(Meio condicionado de controle positivo)
Butirato de Sódio
Butirato de Sódio
Potência
Butirato de Sódio
Potência
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