CN112903403B - 一种利用滤膜实现外泌体富集的装置和外泌体富集方法 - Google Patents

一种利用滤膜实现外泌体富集的装置和外泌体富集方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用滤膜实现外泌体富集的装置及其应用，是一种可高通量，快速对体液中外泌体进行富集的装置。本发明的特点是利用抽滤原理选择与外泌体尺寸匹配的孔径的滤膜实现体液中外泌体的富集及其干扰成分的去除。该装置操作简单，处理通量大，可控制抽滤速度，可实现外泌体的快速富集。该装置可应用于血浆，尿液，细胞培养液等中的外泌体的获取。

Description

一种利用滤膜实现外泌体富集的装置和外泌体富集方法
技术领域
本发明涉及一种利用滤膜实现外泌体富集的装置，是一种可对多种体液及其他样本中的外泌体进行快速富集的装置。
背景技术
外泌体是由细胞分泌的一种囊泡，具有磷脂双分子层结构，尺寸在30-200nm之间，其中包含核酸，蛋白质等许多重要物质。广泛存在于血浆，尿液，细胞培养液，唾液，精液等中，与细胞间交流，信号传导及其疾病诊断诊疗等密切相关[1]。近几年来，研究发现，可以参与癌症发生，及其作为治疗疾病的重要物质，因此被广泛的研究。
传统的外泌体的富集方法包含超速离心法，依赖聚合物沉降，依赖免疫亲和的方法[2]等等。通常面临获取的时间较长，回收率低，外泌体纯度低，不能保证外泌体的完整性等各种问题。因此发展一种能够维持外泌体结构的快速，高回收率富集手段是十分必要的。
该装置是一种利用尺寸筛分原理通过滤膜拦截进行体液中干扰成分的去除外泌体的选择性富集的装置。该设备可以实现高通量、快速、高回收率、完整的外泌体的富集，在后续蛋白质组学研究中具有很好的应用前景。
参考文献
[1].Huilin Shao,et al.Chem.Rev.2018,118,1917-1950.
[2].Kaixiang Zhang,et al.ACS Sens.2019,4,1245-1251.
发明内容
本发明的目的是提供一种装置实现外泌体的富集，该功能的实现需要选择合适的滤膜，合适的抽滤装置及其相应的处理条件。
为实现上述的目的，本发明采用如下的技术方案。
(1)在密闭性较好的装置内装亲水性，孔径范围在5-100nm之间，尺寸大于抽滤装置砂芯尺寸的无机氧化铝(AAO)，聚碳酸酯，硝酸纤维素滤膜中的一种；
(2)外泌体富集的装置的使用过程为：用水，PBS或乙醇清洗好所有组件后，将5-100nm孔径的膜安装在器件中。打开泵后，用0.5-10mL水或者PBS等中性溶剂清洗膜，抽干后在膜上加入样品，进行抽滤。抽2-60min后，保证膜上残余液体为0-200μL。之后，加入体积为1-10mL的水，PBS，0.05-1M的氯化钠溶液，5-30％乙腈中的一种或两种以上进行膜的清洗，清洗1-5次，以尽可能多的洗掉杂质，膜上残余的样品即为收集的外泌体样品。
(3)对于滤膜上的外泌体的回收可分为以下两种方式：
(i)用干净的镊子取下滤膜放于试管内，用0.2-5mL水，磷酸盐缓冲液(PBS)，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，3-8M尿素，4-7M盐酸胍，1-6％十二烷基磺酸钠(SDS)，0.1-2％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，1-4％十二烷基麦芽糖苷(DDM)溶液中的一种或两种以上反复吹打膜表面，之后利用超声破碎，在37-95℃高温煮膜即可得到含有外泌体的样品；
(ii)在器件上将膜反向安装，在膜反面上加入0.2-5mL水，磷酸盐缓冲液(PBS)，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)，3-8M尿素，4-7M盐酸胍，1-6％十二烷基磺酸钠(SDS)，0.1-2％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，1-4％十二烷基麦芽糖苷(DDM)溶液中的一种或两种以上，抽滤收集滤过的成分即为得到的外泌体样品。
(4)将得到的样品加入5-20mM的还原剂(三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT))在37-95℃反应5-90min，后加入10-40mM的碘代乙酰胺(IAA),在15-30℃下避光反应20-40min,之后进行自由溶液酶解或者通过依赖滤膜辅助的样品处理方法(FASP)处理，以胰蛋白酶与原始蛋白量质量比1：15-1：50加入胰蛋白酶,在37℃下过夜反应或者在紫外辅助下快速酶解0.5-6h。得到的样品进行质谱分析。
将包含滤膜的装置通过抽滤作用用于外泌体的富集。通过调节滤膜种类，清洗缓冲液等条件来实现更高纯度外泌体的富集。使用不同的缓冲体系实现外泌体在膜上的有效回收。应用不同的裂解处理条件，实现快速高覆盖外泌体蛋白质组的研究。同时，此装置应用于与超速离心，依赖聚合物沉降，尺寸排阻柱方法处理得到外泌体样品的联用中，实现更高纯度的外泌体的获取。
本发明具有如下特点：
1.操作简单，安装方便，成本低，膜便于更换；
2.样品处理量范围广，处理速度快；
3.对目标产物无损害，可以高回收率的获取完整的样品；
4.可与其他方法联合使用，进一步提高外泌体的纯度。
附图说明
图1：外泌体富集实验装置图
图2：获取外泌体的NTA测定
图3：尿液样品外泌体质谱鉴定结果
图4：血浆样品外泌体质谱鉴定结果
图5：细胞培养液样品外泌体质谱鉴定结果
具体实施方式
实验采用接口内径为25mm的微型抽滤装置，砂芯直径小于25mm,采用直径为25mm的不同材质与孔径的滤膜，安装后保持密闭性进行后续的操作。
如图1所示，装置包括：抽滤泵，滤器，滤膜；滤器为一上下二端开口的容器，于容器中部横向设有支撑筛板，于支撑筛板上设有滤膜，于支撑筛板和容器下开口端之间的容器侧壁上设有抽气口，抽气口通过管路与抽滤泵；容器下开口端设有一滤液收集瓶。
实施例1
如图1所示，在连接好的装置内加入核孔刻蚀孔径均一的聚碳酸酯膜，膜孔为200nm,打开泵，在膜上加入1mLPBS清洗膜，后加入2mL尿样。打开泵，实现样品在膜上的过滤，后用3mLPBS清洗膜，收集滤过的成分。更换30nm的核孔刻蚀孔径均一的聚碳酸酯膜夹在器件中，将滤过的收集的液体加入到滤膜上，打开泵进行抽滤，抽约30min，待全部液体滤过后，用3mLPBS清洗膜。再次全部滤过后，用镊子取下膜，用1mLPBS吹打膜表面，得到的溶液中即为外泌体样品。
将得到的样品加入终浓度为8M尿素，在微量样品超声器中超声10min,后加入终浓度为10mM的TCEP,在56℃下反应30min，放至室温后加入终浓度为20mM的IAA,在25℃下避光反应30min，后将样品稀释至尿素终浓度小于1M,加入400ng的胰蛋白酶，在紫外辅助条件下反应1h，后除盐后冻干，用15μL的0.1％FA复溶后，上QE分析,谱图如图3所示。
鉴定蛋白数为1100个，外泌体蛋白600个，外泌体top100蛋白60个。
实施例2
如图1所示，在连接好的装置内加入核孔刻蚀孔径均一的聚碳酸酯膜，膜孔为200nm,打开泵，在膜上加入2mLPBS清洗膜，后加入100μL血浆样品。打开泵，实现样品在膜上的过滤，后用1mLPBS清洗膜，收集滤过的成分。更换30nm的核孔刻蚀孔径均一的聚碳酸酯膜夹在器件中，将滤过的收集的液体加入到滤膜上，打开泵进行抽滤，抽约20min，待全部液体滤过后，用1mLPBS清洗膜。再次全部滤过后，用镊子取下膜，用0.5mLPBS吹打膜表面，得到的溶液中即为外泌体样品。
将得到的样品加入终浓度为2％Triton X-100，加入终浓度为10mM的DTT,在95℃下反应5min，放至室温后加入终浓度为20mM的IAA,在25℃下避光反应30min，后利用FASP处理，利用8M尿素替换三次，每次200μL，16000g离心30min，利用50mM的碳酸氢铵溶液,每次200μL，16000g离心30min共三次，后加入100μL的50mM的碳酸氢铵溶液，加入400ng的胰蛋白酶，在37℃下反应14h，16000g离心20min，冻干后，用15μL的0.1％FA复溶后，上Lumos分析，谱图如图4所示。
鉴定蛋白数为300个，外泌体蛋白130个，外泌体top100蛋白20个。
实施例3
如图1所示，在连接好的装置内加入无极氧化铝(AAO)膜，膜孔为20nm,打开泵，在膜上加入1.5mL水清洗膜，后加入在-80℃经过50％聚乙二醇(PEG)水溶液沉降20min的100μL血浆样品。打开泵，实现样品在膜上的过滤，后用3mLPBS清洗膜，抽滤干净后，用1mL的PBS吹打膜表面，收集膜上的成分用于NTA测定粒子数，结果如图2所示。
将得到的样品加入终浓度为4％SDS，加入终浓度为10mM的TCEP,在56℃下反应30min，放至室温后加入终浓度为20mM的IAA,在20℃下避光反应30min，后利用FASP处理，利用8M尿素替换三次，每次400μL，14000g离心30min，利用50mM的碳酸氢铵溶液,每次200μL，14000g离心30min共三次，后加入50μL的50mM的碳酸氢铵溶液，加入1μg的胰蛋白酶，在37℃下反应16h，16000g离心20min，冻干后，用15μL的0.1％FA复溶后，上Lumos分析。
鉴定蛋白数为380个，外泌体蛋白180个，外泌体top100蛋白35个。
实施例4
如图1所示，在连接好的装置内加入硝酸纤维素膜，膜孔为50nm,打开泵，在膜上加入0.5mL水清洗膜，后加入5mL细胞培养液。打开泵，实现样品在膜上的过滤，后用1mL的水与5mLPBS清洗膜，抽滤干净后，将膜反向放置，之后在膜上加入1％DDM，进行抽滤，之后加入1mL的PBS冲洗，收集的样品加入终浓度为5mM的TCEP,在37℃下反应60min，放至室温后加入终浓度为15mM的IAA,在20℃下避光反应30min，之后加入1μg的胰蛋白酶，在紫外辅助条件下反应6h，之后经过C18的tip除盐，冻干后，用15μL的0.1％FA复溶后，上Lumos分析，谱图如图5所示。
鉴定蛋白数为1863个，外泌体蛋白789个，外泌体top100蛋白65个。
实施例5
如图1所示，在连接好的装置内加入100nm膜孔的聚碳酸酯膜，打开泵，在膜上加入0.5mLPBS清洗膜，后加入2mL超速离心之后的血浆样品。打开泵，实现样品在膜上的过滤，后用8mLPBS清洗膜，抽滤干净后，将膜反向放置，之后在膜上加入2mLTris-HCl，进行抽滤，收集的样品超声10分钟，之后加入终浓度为5mM的TCEP,在37℃下反应35min，放至室温后加入终浓度为10mM的IAA,在25℃下避光反应35min，之后加入0.8μg的胰蛋白酶，在37℃下反应18h，之后经过C18的tip除盐，冻干后，用15μL的0.1％FA复溶后，上QE分析。
鉴定蛋白数为422个，外泌体蛋白280个，外泌体top100蛋白45个。

Claims (3)

1.一种利用滤膜实现外泌体富集的装置用于外泌体富集的方法，其特征在于：
用于外泌体富集的装置包括：抽滤泵，滤器，滤膜；
滤器为一上下二端开口的容器，于容器中部横向设有支撑筛板，于支撑筛板上设有滤膜，于支撑筛板和容器下开口端之间的容器侧壁上设有抽气口，抽气口通过管路与抽滤泵；容器下开口端设有一滤液收集瓶；
外泌体富集的装置的使用过程为：用水、磷酸盐缓冲液（PBS）、乙醇溶液中的一种或两种以上清洗好直径2-5cm圆筒状滤器后，将5-100nm孔径的滤膜安装在滤器中；打开抽气泵后，用0.5-10mL水、磷酸盐缓冲液（PBS）中的一种清洗膜，抽干后在滤器膜上加入样品，进行抽滤；抽滤2-60min后，保证膜上残余液体为0-200μL；之后，加入体积为1-10mL的水、磷酸盐缓冲液（PBS）、0.05-1M的氯化钠溶液、体积浓度5-30%乙腈中的一种或两种以上进行膜的清洗，清洗1-5次，以尽可能多的洗掉杂质，膜上残余的样品即为收集的外泌体样品；
抽滤泵为一抽气泵，滤器为圆形筒体，筒体中部径向设有带有通孔的支撑筛板，滤膜直径略大于筒体直径，以防止漏液；
为实现外泌体的有效拦截及其杂质的有效去除，滤膜的孔径在5-100mm之间，滤膜的材质为：无机氧化铝（AAO），聚碳酸酯，硝酸纤维素中的一种或两种以上；
对于滤膜上的外泌体的回收可分为以下两种方式中的一种：
（1）用干净的镊子取下滤膜放于试管内，用0.2-5mL水、磷酸盐缓冲液（PBS）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）、3-8M尿素、质量浓度1-6% 十二烷基磺酸钠（SDS）、质量浓度0.1-2% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、质量浓度1-4%十二烷基麦芽糖苷（DDM）溶液中的一种或两种以上反复吹打膜表面或利用超声破碎或37-95℃高温煮膜即可得到含有外泌体的样品；
（2）在滤器上将滤膜上下面互换反向安装，在膜上加入0.2-5mL水、磷酸盐缓冲液（PBS）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）、3-8M尿素、质量浓度1-6% 十二烷基磺酸钠（SDS）、质量浓度0.1-2% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、质量浓度1-4%十二烷基麦芽糖苷（DDM）溶液中的一种或两种以上，抽滤收集滤过的成分即为得到的外泌体样品。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
将得到的外泌体样品用于蛋白质组学分析，得到的外泌体样品加入5-20mM的还原剂（三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇（DTT））在37-95℃反应5-90min，后加入10-40mM的碘代乙酰胺（IAA）,在15-30℃下避光反应20-40min,之后进行溶液中酶解或者通过依赖滤膜辅助的样品处理方法（FASP）处理，以胰蛋白酶与原始蛋白量质量比1：15-1：50加入胰蛋白酶, 在37℃下10-18小时反应或者在紫外辅助下快速酶解0.5-6h；得到的溶液进行除盐处理后质谱分析或直接的质谱分析。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
将包含滤膜的装置通过抽滤作用用于外泌体的富集，同时，此装置也可应用于与超速离心，依赖聚合物沉降，尺寸排阻柱方法处理得到外泌体样品的联用中，实现更高纯度的外泌体的获取。
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