CN112888428A - 包封亲脂和亲水性化合物的纳米胶囊包纳米胶囊型的多隔室体系及相关生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是基于透明质酸衍生物的纳米胶囊包纳米胶囊型的多隔室体系，设计用于同时或独立地包封肽和/或疏水活性化合物，其中不需要表面活性剂、乳化剂和/或稳定剂来获得体系稳定性，所述体系起着载体的作用，能够保护敏感的亲水性物质免受侵蚀性的外部环境的影响以及由此导致的降解和失活，并且使得可以同时施用不同亲水性的活性物质。本发明的目的还包括生产水包油包水双重乳液形式的多隔室的纳米胶囊包纳米胶囊体系的方法。

Description

包封亲脂和亲水性化合物的纳米胶囊包纳米胶囊型的多隔室 体系及相关生产方法

技术领域

本发明的目的是用于包封亲脂和亲水性化合物的纳米胶囊包纳米胶囊型(nanocapsule-in-nanocapsule)的多隔室体系及相关生产方法，该体系基于水包油包水(W/O/W)双重乳液，用透明质酸的疏水化衍生物稳定，无需使用另外的乳化剂，所述体系为载体，从而还解决了与需要确保保护敏感的亲水性物质(包括蛋白质)免受侵蚀性外部环境有关的问题，并使得能同时施用具有不同亲水性的活性物质。

背景技术

同时施用疏水性和亲水性化合物的需求往往与活性物质组合的协同作用相关联(Chou TC(2006)Theoretical basis,experimental design,and computerizedsimulation of synergism and antagonism in drug combination studies.PharmacolRev 58:621-681；Zimmermann GR,Lehar J,Keith CT(2007)Multi-target therapeutics:when the whole is greater than the sum of the parts.Drug discovery today 12:34-42.)或者与同时且同位置地递送治疗剂和担载诊断过程的物质(治疗诊断学)的可能性相关联(Liu G,Deng J,Liu F,Wang Z,Peerc D,Zhao Y,Hierarchical theranosticnanomedicine:MRI contrast agents as a physical vehicle anchor for high drugloading and triggered on-demand delivery,J.Mater.Chem.B,2018,6,1995-2003)。这尤其与药剂、维生素、激素和磁共振成像等中的造影剂的施用有关。对于药物的情况下，施用在治疗复杂疾病，诸如癌症(Blanco E et al.Colocalized delivery of rapamycinand paclitaxel to tumors enhances synergistic targeting of the PI3K/Akt/mTORpathway.Mol Ther.2014Jul；22(7):1310-1319.)中或在解决细菌和真菌的耐药性(LevySB,Marshall B(2004)Antibacterial resistance worldwide:causes,challenges andresponses.Nature medicine 10:2 S122-129；Fitzgerald JB,Schoeberl B,Nielsen UB,Sorger PK(2006)Systems biology and combination therapy in the quest forclinical efficacy.Nature chemical biology 2:458--466)中尤为重要。

所施用的具有不同亲水性的活性物质通常在药代动力学方面有所不同，即使是同时施用这些物质的混合物，也会不利地影响在体内的协同作用。该问题可通过将物质在一种亚微米尺寸的载体中施用来得以解决，其中载体将两种(或多种)物质递送到一个位置(同位置)。这种载体可以是基于水包油包水型双重乳液的体系，并且在结构上它们可以被描述为具有嵌入在具有油芯的胶囊中的水芯的胶囊，如本发明中那样。

对于亲水性化合物，通过将该物质与外部环境隔离来实现保护作用也很重要，因为外部环境可能会破坏该物质(例如，pH较低的胃液、负责体内免疫应答的淋巴细胞)。这尤其涉及蛋白质和多肽的口服递送(Abdul Muheem,Faiyaz Shakeel,Mohammad Asadullah,Jahangir,Mohammed Anwar,Neha Mallick,Gaurav Kumar Jain,Musarrat HusainWarsi,Farhan Jalees Ahmad,A review on the strategies for oral delivery of proteinsand peptides and their clinical perspectives,Saudi Pharmaceutical Journal2016,24,413-428)。

生物活性物质的生物利用度取决于其被吸收的速率和范围[美国食品和药物监督管理局，联邦法规，第21篇，第5卷，第1章，第D分章，第320部，生物利用度和生物等效性要求]。药物的生物利用度低意味着药剂将无法在血液中达到最小有效浓度，并因此难以产生理想的治疗效果。物质不能到达所需位置和/或不能在所需位置积聚导致需要增加剂量，并因此可能产生不良的副作用并造成更高的治疗费用。由于上述因素，仅九分之一的新合成物质获得了监管机构的批准[Blanco E等人，Nat.Biotechnol.2015,33,941-951]。

用来提高生物利用度的方法包括生产前药、带有聚合物载体的固体分散体，微粉化物质颗粒或添加表面活性剂[Baghel，S等人，Int.J.Phann.2016,105,2527-2544]。近年来，特别是对于水溶性差的物质，许多注意力还集中在微载体和纳米载体上[Chen H等人，Drug Discov.Today.2010,7-8 354-360]。纳米化(Nanonization)能够提高治疗物质的溶解度并改善药代动力学。它还有助于减少物质吸收的不利副作用。经过全面研究的载体包括纳米乳液、胶束、脂质体、自乳化体系、固体脂质纳米颗粒和聚合物-药物缀合物[Jain S等人，Drug Dev.Ind.Pharm.2015,41,875-887]。

研究表明，使用纳米载体不仅使得能改善药代动力学参数并更好地保护敏感物质免于降解，而且还可以延长活性物质的循环时间并确保靶向递送。由于专注于药物递送体系的研究进展，当今在市场上可用的选择包括在治疗真菌感染、甲型肝炎和多发性硬化症的纳米颗粒制剂[Zhang L等人，Clin.Pharmacol.Ther.2008,83,761-769]。第一种基于纳米制剂的药物是脂质体形式的阿霉素(Doxil)，其被设计用于治疗卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)，并于1995年获得美国食品药品监督管理局的批准[BarenholzY.J.Control.Release 2012,160,117-134]。十年后，另一种制剂，即与纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇(Abraxane)获得了批准。在这种情况下，通过取消Cremophor EL的使用，可以减少常规紫杉醇制剂相关的有害副作用。

疏水性或亲脂性物质的载体体系主要旨在改善这些物质的药学和生物利用度。对于亲水性化合物，通过将该物质与外部环境隔离来实现保护作用也很重要，因为外部环境可能会破坏该物质(例如，pH较低的胃液，负责体内免疫应答的淋巴细胞)。这尤其涉及蛋白质和多肽的口服递送[Muheem A.等人,Saudi Pharm.J.2016,24,413-428]。

胰岛素是由朗格汉斯(Langerhans)胰岛β细胞合成的主要蛋白激素，其在治疗1型糖尿病中是必需的。鉴于其患病率，糖尿病是全球范围内最广泛的非传染性疾病之一[ShahR.B.等人，Int.J.Pharm.Investig.2016,6,1-9]。胰岛素最常经皮下注射，在很多情况下，这与血糖控制不佳、生活方式的不适感和劣化感有关[Owens D.R.Nat.Rev.DrugDiscov.2002,1,529-540]。胰岛素的口服递送将是激素施用的最舒适和优选的方法。此外，激素的口服递送将促进其被吸收进入肝门循环，模仿向肝脏供应胰岛素的生理途径，并减少与将胰岛素递送至外周循环的皮下注射有关的全身性高胰岛素血症，并且可以最大限度地降低低血糖的风险且改善代谢控制[Heinemann L和Jacques YJ.DiabetesSci.Technol.2009,3,568-584]。

胰岛素肠道吸收的主要障碍包括蛋白质在肠道壁中的低渗透性，以及在酸性胃环境中高度易变性和在肠中高度易酶促降解性。迄今为止，在文献中已发表的许多改善胰岛素在消化道中吸收的策略包括将胰岛素包封在纳米球或纳米颗粒、微粒和脂质体内。这些载体保护肽在消化道上部免受蛋白水解/变性过程，并能够增加小肠各部分的跨粘膜蛋白捕获。然而，由于包封的效果差，并且缺乏对活性物质的释放动力学的控制，因此载体的使用受到限制[Song L等人，Int.J.Nanomedicine 2014,9,2127-2136；Sajeesh S.和SharmaC.P.J.Biomed.Mater.Res.B Appl.Biomater.2006,76,298-305；Sarmento B.等人.,Biomacromolecules.2007,8,3054-3060；Niu M等人.,Eur.J.Pharm.Biopharm.2012,81,265-272]。

波兰专利号PL229276B公开了稳定的水包油(O/W)体系，该体系具有芯-壳结构，用经改性的多糖来稳定并能够有效地包封疏水性化合物。

国际专利号WO 2016/179251提出了稳定的乳液，其能够包封挥发性化合物，例如环丙烷的衍生物。水包油包水型双重乳液包含乳化剂和表面活性剂，从而确保其稳定性。

在美国专利US 2010/0233221中描述了稳定的双重乳液。它们包含至少两种具有不同摩尔质量的乳化剂，以确保油包水乳液和双重乳液的稳定性。

国际专利WO 2018/077977提出了包含交联脂肪酸作为内层的双重乳液，旨在包封化妆品中使用的亲水性化合物。该乳液能稳定至少三个月。

国际专利号WO 2017/199008描述了包含乳化剂和内部水性相的双重乳液，所述内部水性相包括在高温下会发生交联的聚合物，从而得到水包油包水凝胶体系。所获得的体系能够携带并入在水胶体颗粒中的活性物质(药物和细胞)。

美国专利US 2010/0233221中也描述了稳定的双重乳液。它们包含至少两种具有不同摩尔质量的乳化剂，以确保油包水乳液和双重乳液的稳定性。

美国文本US20170360894公开了口服形式的胰岛素的生产，其中涉及生产含有中和酸性胃环境的试剂以及含自乳化蛋白的体系的丸剂。

专利文本US6191105提出了包含胰岛素的油包水(W/O)乳液体系。然而，制剂的口服递送可导致乳液体系内的相变，这可能导致肽的不合时宜释放及其在消化道中的降解。

如美国专利号US 6277413中所披露的，在含聚合物微球和含脂质微球的制剂中，胰岛素被包封在内部的水性相中，然而，这种包封的有效性非常低。

专利号US 09828445中描述了多糖胰岛素载体的生产。通过使预先经脂肪酸、改性脂肪酸和/或氨基酸酰胺化的壳聚糖交联来生产壳聚糖纳米颗粒。另一方面，胰岛素被吸附到载体上。

壳聚糖还用在生产用于蛋白质包封和口服施用的W/O/W体系中。文本CN106139162中公开的纳米载体另外包含聚半乳糖醛酸(PGLA)和聚合物表面活性剂(

188)。

专利文本WO 2011086093公开了用于口服递送肽(包括胰岛素)的组合物，其中使用自微乳化药物递送体系(SMEDDS)。为了克服肽在载体体系中的不稳定性(防止在酸性胃环境中降解或失活)，将肽包埋在包衣的软胶囊中，遗憾的是，其在口服施用后表现出延迟的活性。此外，胃排空的速率因人而异，这影响了胰岛素从制剂中释放的时机以及肠道的适当吸收。这种变化会导致胰岛素吸收的显著差异，潜在地导致血糖不受控制。问题还包括载体与药物体系可能的不相容性。

相关文献没有提出如下的用于生产并稳定水包油包水型双重乳液的方法，该方法不需要添加小颗粒或大颗粒表面活性化合物或其他稳定剂，能够同时有效地包封疏水性和亲水性化合物，以能够口服递送活性物质。这个问题在本发明中已得到解决。

本发明的目的是具有纳米胶囊包纳米胶囊结构的水包油包水(W/O/W)型乳液体系，其中不需要小分子表面活性剂、乳化剂和/或稳定剂来获得体系的稳定性。所述体系用作载体，其能够保护敏感的亲水性物质免受侵蚀性外部环境的影响以及由此导致的降解和失活，并使得可以同时施用具有不同亲水性的活性物质，特别是能够递送蛋白质。

本发明的目的是提供新型的水包油包水型乳液体系(纳米胶囊包纳米胶囊，nanocapsule-in-nanocapsule)。该新的体系是药物剂型，可以包含抗肿瘤活性物质或蛋白质。

发明内容

本发明的目的是一种生物相容性的水包油包水型双重乳液体系，设计用于同时递送亲脂性化合物(在油相中)和亲水性化合物(在内部的水性相中)。不是通过使用小颗粒表面活性化合物(表面活性剂)，而是通过疏水改性的透明质酸来确保体系的稳定性。

为带油芯胶囊和带水性芯胶囊(内部胶囊)所生产的稳定化外壳由具有下式的疏水改性的透明质酸钠Hy-Cx组成：

其中，x是在1至30范围内的整数，并且它限定了疏水性侧链中的碳原子总数，数m/(m+n)的比值的范围为0.001至0.4。

纳米胶囊包纳米胶囊体系通过两阶段法来生产。在第一阶段中，通过将水性溶液(例如透明质酸十二烷基衍生物的水性溶液)与无毒性的油混合来产生油包水型反相乳液，其中无毒性的油构成混合物体积的80％至99.9％。在下一阶段中，使悬浮在连续油相中的水滴接收透明质酸盐包衣，由此产生水包油包水型双重乳液。第二阶段是必需的，因为它使得能够实现胶体体系的稳定性；在第一阶段中产生的W/O体系是不稳定的，而双重乳液表现出至少两个月的稳定性。

为了获得随时间稳定的W/O/W乳液，必须使多糖大分子的亲水性片段和疏水性片段之间保持平衡。当多糖链中疏水性基团的取代度在0.1％至40％的范围内，是有利的。所进行的研究表明，通过十二烷基侧链改性的透明质酸来稳定的体系表现出了最佳性质。多糖链中最有效的取代度不超过5％。这是因为疏水性链的含量过多会降低聚合物在水中的溶解度。

为了实现体系的良好稳定性，使用含离子基团(例如羧基)的多糖也很重要。当多糖中离子基团的含量大于20mol％(以每1个单体单元计算)时，是有利的；当含量大于40mol％，效果更好；并且当含量超过60mol％，效果最好。

为了获得W/O反相乳液和W/O/W双重乳液，必须采用超声处理(或动态混合)。如果在高于18℃但不超过40℃的温度下持续进行超声处理15分钟至60分钟，则是有利的。如果持续进行超声处理60分钟来获得反相乳液，持续进行超声处理30分钟来获得双重乳液，并且如果该过程在25℃至30℃范围内的温度下进行，则效果最好。

使用浓度为0.1g/L至20g/L且离子强度在0.001mol/dm³至1.0mol/dm³范围内的疏水改性的离子多糖的水性溶液来生产稳定的双重乳液。采用2g/L的溶解于0.15mol/dm³的氯化钠溶液中的透明质酸溶液是有利的。

所获得的纳米胶囊包纳米胶囊体系可用于广泛的用途，因为它们能够同时包封疏水性化合物(至油相中)和亲水性化合物(至内部水性相)。可以包封荧光染料以进行影像学检查。同时使用亲水性染料和疏水性染料能够使胶囊的几何形状成像。还可以使用荧光标记的透明质酸衍生物。采用具有不同光谱特性的染料是有利的；更有效的是，在共聚焦荧光显微技术中，使用由不同激光激发并在不同的发射波段中发射辐射的染料。最有效的是，使用经罗丹明异硫氰酸酯或异硫氰酸荧光素改性的透明质酸。

本发明的目的是一种用于同时递送亲水性化合物和亲脂性化合物的水包油包水双重乳液形式的纳米胶囊包纳米胶囊型的多隔室体系，包括：

a)用于输送亲脂性化合物的液态油芯，容纳有选自包括以下项的组中的油：油酸；棕榈酸异丙酯；脂肪酸；天然提取物和油，诸如玉米油、亚麻籽油、大豆油、摩洛哥坚果油；或它们的混合物；有利地是油酸；

b)用于输送亲水性化合物的胶囊或多个胶囊，具有水性芯，包埋在油芯中；

c)既用于具有油芯的胶囊又用于具有水芯的内部胶囊的稳定化外壳，其由选自包括以下项的组中的疏水改性的多糖组成：壳聚糖，寡壳聚糖，葡聚糖，角叉菜胶，淀粉糖(amylose)，淀粉，羟丙基纤维素，普鲁兰糖(pullulan)和糖胺聚糖，透明质酸，硫酸肝素，硫酸角质素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸皮肤素的衍生物；有利地是透明质酸的衍生物；

d)外部胶囊，直径小于1μm，在水溶液中稳定；

e)活性物质。

一种其中疏水改性的多糖中的疏水性侧链取代度的范围为0.1％至40％的体系。

一种其中用于具有油芯的胶囊和具有水芯的胶囊(内部胶囊)的稳定化外壳由具有下式的疏水改性的透明质酸钠Hy-Cx组成的体系：

其中，x是在1至30范围内的整数，并且它限定了疏水性侧链中的碳原子总数，数m/(m+n)的比值的范围为0.001至0.4。

一种其中所输送的亲脂性化合物可以是荧光染料、脂溶性维生素或疏水性药物的体系。

一种其中所输送的亲水性化合物可以是荧光染料、水溶性维生素、蛋白质或亲水性药物；有利地是胰岛素的体系。

一种其中胰岛素的浓度为每1ml胶囊悬浮液中0.005至20.000个胰岛素单元的体系。

一种生产如权利要求1所限定的水包油包水双重乳液形式的纳米胶囊包纳米胶囊型的多隔室体系的方法，其中：

a)在第一步期间，通过暴露于超声波(超声处理)或暴露于有利地是混合或振动的机械刺激，将上式的透明质酸十二烷基衍生物Hy-Cx的水性溶液与无毒性的油进行混合来生产油包水型反相乳液，该无毒性的油构成混合物体积的约0.1％至99.9％，其中水性相与油相的体积比的范围为1∶10至1∶10000，有利地是大约1∶100；

b)在第二步期间，使悬浮在连续油相中的水滴接收透明质酸盐包衣，其中W/O相乳液与水相的体积比的范围为1∶10至1∶10000，有利地是大约1∶100；

c)最后，通过暴露于超声波(超声处理)或暴露于有利地是混合或振动的机械刺激来生产水包油包水(W/O/W)双重乳液体系；

其中，所采用的水相是基于疏水改性的多糖的水性溶液，具有2至12的范围内的pH值，0.1g/L至30g/L的浓度，以及0.001mol/dm³至3mol/dm³的范围内的离子强度；所述疏水改性的多糖选自包括以下各项的组：壳聚糖，寡壳聚糖，葡聚糖，角叉菜胶，直链淀粉，淀粉，羟丙基纤维素，普鲁兰糖和糖胺聚糖，以及特别是透明质酸、硫酸肝素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素的衍生物；有利地是透明质酸的衍生物；

并且，油相包含选自包括以下项的组中的油：油酸；棕榈酸异丙酯；脂肪酸；天然油，特别是亚麻子油、大豆油、摩洛哥坚果油；或它们的混合物的组；有利地是油酸；

尤其是，该方法在不使用任何小颗粒表面活性剂的情况下进行。

一种方法，其中进行脉冲超声处理，脉冲持续时间比两个连续脉冲之间的间隔持续时间的一半。

一种方法，其中包封的亲脂性化合物容纳在油芯中，并且包封的亲水性化合物容纳在纳米胶囊的水芯中。

一种方法，其中在多糖中的离子基团的含量不低于20mol％时，是有利的，并且在其超过60mol％时，是有利的(以每1个单体单元计算)。

一种方法，其中在第一步和第二步期间，在18℃至40℃的温度下持续进行超声处理15分钟至60分钟，有利地是在25℃至30℃的温度下，持续进行超声处理60分钟以获得反相乳液，包围持续进行超声处理30分钟以获得双重乳液。

如上所限定的多隔室体系用于输送亲脂性化合物和亲水性化合物的应用，其中亲脂性化合物可以是荧光染料、脂溶性维生素或疏水性药物；而亲水性化合物可以是荧光染料、水溶性维生素、蛋白质或亲水性药物，有利地是胰岛素。

所述发明的优点包括能够获得生物相容性且稳定的纳米制剂，该纳米制剂能够同时递送在双纳米胶囊的独立隔室的亲水性化合物和亲脂性化合物。这保护了包封的化合物免于降解、不合时宜地从载体中释放，以及过快地从体系例如血液循环中消除。这显著改善了所述体系的应用范围，其特征还在于制备简单且花费的成本较低。此外，载体体系的使用使得能够口服施用肽和其他活性物质并改善它们的生物利用度。

附图说明

在下面列出的实施例和附图中示出了本发明的目的：

图1-示出了实施例I中所述的反相乳液，该反相乳液通过将含有水和油酸的预乳液与透明质酸十二烷基衍生物的水-乙醇溶液(水∶醇的体积比为2∶3)混合而获得。箭头表示乳化期间产生的大气泡。

图2-示出了在生产实施例II中所述的反相乳液的过程中产生的气泡，该反相乳液通过将含有水和油酸的预乳液与透明质酸十二烷基衍生物的水-乙醇溶液(水∶醇的体积比为1∶2)混合而获得。

图3-示出了生产1天后(a)和生产5天后(b)的实施例III中所述的反相乳液，该反相乳液通过将含有水和油酸的预乳液与透明质酸十二烷基衍生物的水溶液混合而获得。

图4-示出了实施例III中所述的反相乳液中的分子尺寸分布(乳化当天的形态)，该反相乳液通过将含有水和油酸的预乳液与透明质酸十二烷基衍生物的水溶液混合而获得。

图5-示出了实施例III中所述的反相乳液中的分子尺寸分布(乳化后5天)，该反相乳液通过将含有水和油酸的预乳液与透明质酸十二烷基衍生物的水溶液混合而获得。

图6-示出了实施例IV中所述的反相乳液(W/O)的分子的低温冷冻透射电子显微镜图(cryo-TEM microphotograph)，该反相乳液通过将含有水和油酸的预乳液与透明质酸十二烷基衍生物的的水溶液混合而获得，其中透明质酸十二烷基衍生物的的水溶液含有钨酸钠(VI)。

图7-示出了实施例V中所述的双重乳液的分子尺寸分布(乳化当天的形态)，该双重乳液通过将0.4vol％的含有FITC标记的透明质酸十二烷基衍生物的反相乳液与RhBITC标记的透明质酸盐的水溶液混合而获得。

图8-示出了实施例V中所述的双重乳液的分子尺寸分布(乳化后7天的形态)，该双重乳液通过将0.4vol％的含有FITC标记的透明质酸十二烷基衍生物的反相乳液与RhBITC标记的透明质酸盐的水溶液混合而获得。

图9-示出了实施例VI中所述的双重乳液体系的在累积波段中(a)和在FITC波段(b)下观察的共聚焦显微镜图像(比例尺，5μm)，该双重乳液体系通过将0.4vol％的含有FITC标记的透明质酸十二烷基衍生物的反相乳液与RhBITC标记的透明质酸盐的水溶液混合而获得。

图10-示出了实施例VII中所述的双重乳液的分子的低温冷冻透射电子显微镜图，该双重乳液通过将0.4vol％的含有FITC标记的透明质酸十二烷基衍生物和溶解的钨酸钠(VI)的反相乳液与RhBITC标记的透明质酸盐的水溶液混合而获得。

图11-示出了在实施例VIII中所述的双重乳剂的分子尺寸分布，该双重乳液在内部水性相中含有钙黄绿素。

图12-示出了实施例VIII中所述的双重乳液体系的在累积波段/收集波段下观察的共聚焦显微镜图像，其中钙黄绿素和用于改性透明质酸盐的罗丹明的信号重叠(比例尺10μm)。

图13-示出了实施例IX中所述的双重乳液的分子尺寸分布，该双重乳液通过将0.1vol％的含有FITC标记的透明质酸十二烷基衍生物的反相乳液(水性相-油相体积比为1∶30)与RhBITC标记的透明质酸盐的水溶液混合而获得。

图14-示出了实施例IX中所述的双重乳液在累积波段(a)、FITC波段(b)和TRITC波段(c)下观察的共聚焦显微镜图像，该双重乳液通过将0.1vol％的含有FITC标记的透明质酸十二烷基衍生物的反相乳液(水性相-油相体积比为1∶30)与RhBITC标记的透明质酸盐的水溶液混合而获得(比例尺10μm)。

图15-示出了在实施例X中所述的双重乳剂在W/O/W体系生产出来后的11周时的分子尺寸分布。

图16-列出了在双重乳剂体系获得当天以及随后的7天、14天、21天、28天、43天、59天和79天时测量的实施例X中所述的W/O/W体系的ζ(Zeta)电位和标准偏差(SD)。

图17-示出了在3周(上侧图)和4周(下侧图)后，实施例X中所述的双重乳液体系的在累积波段下观察的共聚焦显微镜图像(比例尺5μm)。

图18-示出了实施例XI中所述的双重乳液的分子尺寸分布，该双重乳液在内部的水性相中含有钙黄绿素，并且在油相中含有尼罗红。

图19-示出了实施例XI中所述的双重乳液体系的用共聚焦显微镜在TRITC波段(a，尼罗红)、FITC波段(b，钙黄绿素)和累积波段(c)下观察获得的图像，该双重乳液体系在水性相中含有钙黄绿素，并且在油相中含有尼罗红(比例尺5μm)。

图20-示出了在按照实施例1的过程生产出双重乳液当天(a)、一周(b)和两周(c)后，实施例XII中所述的双重乳液的纳米胶囊尺寸分布。

图21-示出了在按照实施例1所述的过程生产双重乳液一周后，实施例XII中所述的乳液中少量油相流出到表面并被稀释的照片。

图22-示出了在按照实施例1中所述的步骤生产出双重乳液两周后，实施例XII中所述的乳液中有少量油相流出到表面并被稀释的照片。

图23-示出了在生产出的当天，实施例XII中所述的胶囊使用透射光模式下的测量(a)和使用TRITC滤光器(b)获得的共聚焦显微镜图像，即使用共聚焦显微镜收集的图像。

图24-示出了在按照实施例2中所述的过程生产该双重乳液当天(a)、一周(b)、两周(c)和三周(d)后，实施例XIII中所述的双重乳液的纳米胶囊尺寸分布。

图25-示出了在生产出的当天，实施例XIII中所述的胶囊在使用透射光模式下的测量(a，c)和使用TRITC滤光器(b，d)获得的共聚焦显微镜图像，即使用共聚焦显微镜收集的图像。

图26-示出了在实施例XIII中所述的胶囊在它们生产出来后的三周，使用透射光模式下的测量(a)和使用TRITC滤光器(b)获得的共聚焦显微镜图像，即使用共聚焦显微镜收集的图像。

图27-示出了在按照实施例3中所述的过程生产出双重乳液当天(a)和一周(b)后，实施例XIV中所述的双重乳液的纳米胶囊尺寸分布。

图28-示出了在生产出的当天，实施例XIV中所述的胶囊在使用透射光模式下的测量(a)和使用TRITC滤光器(b)获得的共聚焦显微镜图像，即使用共聚焦显微镜收集的图像。

图29-示出了在双重乳液生产出当天(a)和一周(b)后，实施例XV中所述的双重乳液的纳米胶囊尺寸分布。

图30-示出了在双重乳液生产出当天(a)和一周(b)后，实施例XVI中所述的双重乳液的纳米胶囊尺寸分布。

图31-示出了第1组和第2组(a)以及第3组、第4组和第5组(b)中，相对于相关对照组，以平均值计算的实施例XVII的葡萄糖水平的测量结果。

具体实施方式

通过以下非限制性实施例来说明本发明。

实施例I

制备油包水型反相乳液的方法。

为了生产反相乳液(W-O型)，使用透明质酸十二烷基衍生物的水-乙醇溶液。挥发性有机溶剂的存在是为了使聚合物链实现伸展构象(以产生反相乳液)。随后蒸发溶剂。

在生理盐水(浓度为大约7.5g/L)中制备透明质酸十二烷基衍生物(疏水性侧链取代度从4.5％开始)的溶液。然后将中性溶液乙醇化，得到体积比为2∶3的混合物。

同时，通过将油酸与氯化钠水溶液(c＝0.15mol/dm³)以100∶1的体积比混合来制备预乳液。将该体系在涡旋式振动器中振动10分钟，然后在超声清洗器中于室温下经受超声处理30分钟(脉冲模式，1s超声，2s间隔)。经超声处理后，产生了乳白色乳液。

将透明质酸十二烷基衍生物的水-乙醇溶液在5分钟内逐滴加入到预乳液中。将整个混合物在敞开的瓶中以脉冲模式经受超声处理30分钟，以蒸发乙醇。

使用动态光散射(DLS)测量的尺寸分布表明，该体系包含许多分子片段。无法测量指示体系稳定性的zeta电位(ζ)(高度不稳定的测量结果)。此外，瓶子中容纳有直径超过1mm的可见球状气泡(图1)

实施例II

降低水-乙醇溶液中的水性相含量后，制备油包水型反相乳液的方法。

如实施例I中所述来制备预乳液。其中逐渐加入透明质酸十二烷基衍生物的水-乙醇溶液，但是水性相与乙醇相的体积比为1∶2。

为了蒸发乙醇，使体系在较高温度(约34℃)下经受超声处理。

最初在油中可以看到白色的悬浮物。将体系引入用于DLS测量的比色皿中后，悬浮物转变为直径超过1mm的气泡(图2)。

在DLS设备中测量尺寸后，在比色皿中观察到2个大水滴。

ζ电位无法测量。

基于实施例I和II中给出的结果，可以得出这样的结论：乙醇对乳液的产生具有不利影响。在下一步中，从该体系中去除醇。

实施例III

从体系中去除醇后，制备油包水型反相乳液的方法。

通过将透明质酸十二烷基衍生物在生理盐水(c_NaCl＝0.15mol/dm³)中的溶液(c＝4.7g/L)与油酸以1∶100的体积比混合来制备油包水型反相乳液。如实施例I所述，使该体系经受振动和超声处理，并且超声处理持续进行1小时。

获得乳白色乳液，并且在乳化当天和五天后测量其稳定性。DLS测试表明初始体系具有高度稳定性(ζ＝-33±2l.7mV)。分子尺寸以窄分布为特征。五天后，表征分子尺寸的分布向较小的分子移动；此外，可以观察到另一个小的最大值。五天后，样品的浊度显著降低(图3、图4、图5)。目测观察与DLS数据相结合得出五天后分子含量减少的结论，这表明所获得的体系既包含稳定元素，也包含不稳定元素。从适用性的角度来看，这种情况是不利的，因为它会导致材料损失和产生组成不受控制的体系。由于上述原因，在下一阶段中，使反相乳液体系直接经受后续步骤，来生产双重乳液。

实施例IV

用低温冷冻透射电子显微技术进行反相乳液显像。

按照实施例III中所述的过程制备反相乳液，但是内部水性相含有钨酸钠(VI)，以在成像检查期间增强对比度。两天后，使用透射电子显微镜技术，并辅以低温冷冻检查装置来检查乳液。对获得的图像进行分析，证实存在直径为大约为250nm的球状分子(图6)。

实施例V

制备双重乳液的方法。

如实施例III中那样来制备反相乳液，但是使用浓度为2g/L的荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的透明质酸的十二烷基衍生物，并持续进行超声处理30分钟。

通过将构成混合物体积的0.4％的反相乳液与在生理盐水中的浓度为1g/L的异硫氰酸罗丹明(RhBITC)标记的透明质酸的十二烷基衍生物混合而获得。根据实施例I中所述的参数，使体系在涡旋式振动器经受振动10分钟，并在室温下经受超声处理30分钟。DLS测试中分子尺寸分布的分析表明存在直径为500nm至600nm的分子，而ζ电位测量证实了所获得的体系稳定性(ζ＝-44.6±3.33mV)。观察7天后，分子尺寸或ζ电位(ζ＝-44.6±3.08mV)均未显示出显著变化(图7、图8)。

实施例VI

用共聚焦显微镜进行双重乳液成像。

使用共聚焦显微，采用标记的多糖镜来可视化实施例V中获得的结构。由于其光谱特征，两种染料都可以用不同波长(488nm和561nm)的激光激发，并且可以在其他显微镜波段下观察到发射。结果表明，FITC没有被对应于RhB的激光激发(反之亦然)；在FITC波段下未观察到RhB信号，并且在对应于罗丹明发射的波段下未识别出FITC信号。

通过在第一W-O型乳液中采用含有FITC的衍生物，并在生产双重乳液的第二阶段中采用含有RhBITC的衍生物，可以使获得的结构可视化并证实它们的形态。

共聚焦显微镜(100×透镜，488nm和561nm激光)的图像证实了存在“层状的”护层-观察到来自所有波段的信号以及FITC的波段特征(图9)。

实施例VII

用低温冷冻透射电子显微镜进行双重乳液成像。

按照实施例V中所述的过程制备双重乳液，但是内部水性相含有钨酸钠(VI)，以在成像检查期间增强对比度。两天后，使用透射电子显微镜技术和低温冷冻设备检查样品。对获取的图像进行分析，证实了存在直径大约为600nm的球状分子(图10)。

实施例VIII

将亲水性染料包封在内部水性相中。

如实施例V中所述来制备双重乳液，但是通过将浓度4.5g/L的透明质酸十二烷基衍生物在生理盐水中的水溶液与钙黄绿素溶液(c_kalc＝2g/L)以3∶1的体积比混合来制备反相乳液。对基于DLS测量结果的分子尺寸进行的分析证实了，所获得的制剂是稳定的(ζ＝-32.5mV±6.58mV)，并且包含流体动力学直径为大约600nm的分子(图11)。这些发现表明该包封物质对胶体体系的物理化学性质没有影响。

共聚焦显微镜图像(在所有波段中观察)证实获得了纳米胶囊包纳米胶囊体系，这由所观察的分子内的在两个波段下均可见且重叠的信号来表明。

实施例IX

双重乳液组成的优化。

为了优化所获得的体系的尺寸和组成，如实施例VIII所述来制备反相乳液，但改变该反相乳液中的水性相与油相的体积比，使其中水性相与油相的体积比为30∶1。通过将反相乳液和浓度为1g/L的罗丹明异硫氰酸酯标记的透明质酸的十二烷基衍生物混合来获得双重乳液。混合物中反相乳液的含量等于0.1体积％。如实施例V中所述来进行超声处理。

所获得的体系的特征在于分子尺寸的分布窄(图13)，以及通过测量ζ电位(ζ＝-31.0mV±2.32mV)的值表明具有高稳定性。

通过共聚焦显微镜(100×透镜，488nm和561nm激光)观察，证实形成了纳米胶囊包纳米胶囊体系(图14)。

实施例X

双重乳液的长期稳定性。

在11周的时间内测试了使用透明质酸十二烷基衍生物制备的水包油包水双重乳液的稳定性。使用动态光散射技术和共聚焦显微镜在指定的时间点检查体系的参数。如实施例IX所述来生产胶囊。

所获得的体系的特征在于具有单峰的分子尺寸分布(图15)，以及通过Zeta电位值(ζ＝-37.2mV±1.4mV)测量的高的稳定性(图16)。在评估体系稳定性的测试期间，尺寸分布的最大值略微向较大分子移动。经过11周的观察，通过ζ电位测量所定义的体系的稳定性并未劣化。通过共聚焦显微镜观察该体系，证实形成了“纳米胶囊包纳米胶囊”体系(来自两个荧光波段的信号重叠)(图17)。

实施例XI

含溶解的荧光染料的双重乳液的制备和可视化。

如实施例IX所述，通过将油酸与透明质酸十二烷基衍生物在生理盐水中的溶液混合来制备反相乳液，其中在油相中溶解有尼罗红染料(c＝0.85g/L)，并且在水性相中溶解有钙黄绿素(c＝0.17g/L)。如实施例IX中所述来生产双重乳液。

所获得的分子的特征在于其流体力学直径与实施例X中形成的分子中的流体动力学直径近似(图18)。尺寸分布包括可见比例的直径为大约700nm的分子。

使用共聚焦显微镜进行可视化表明，形成了纳米胶囊包纳米胶囊体系(来自两个荧光波段的信号重叠)(图19)。

实施例XII

1)胰岛素溶液的制备

将21.66mg胰岛素(Sigma Aldrich)溶解于1ml 0.15M NaCl(加入4μl 3M HCl，pH～1.9)，即大约600Ul/ml(3.56mg＝100UI)*。

该过程产生了澄清的胰岛素溶液，其在4℃的温度下储存时保持透明的形式(两周观察)。

随后，加入染料，即中性红(在0.15M NaCl中，C＝1g/l)来制备胰岛素溶液(180μl胰岛素溶液+20μl染料溶液)。

没有观察在胰岛素溶液中加入染料带来不利影响。

2)胶囊的制备

a)乳液1：

根据本发明上文中的过程，按照以下配方来获得乳液1：用100μl的HyC12溶液(在0.15M NaCl中，C＝4.6g/l)和20μl的具有染料的胰岛素溶液来乳化3.6ml的油酸；该过程使用Vortex型振动器(10分钟)和超声波(脉冲模式，30分钟)来进行。

b)乳液2：

由6ml的HyC12溶液(在0.15M NaCl中，C＝1g/l)和12μl的乳液1来制成乳液2。使用Vortex振动器(10分钟)和超声波(30分钟，脉冲模式)来使混合物乳化。

获得乳白色乳液。

1ml的胶囊容纳0.01μl的胰岛素溶液，即每有1ml的胶囊有0.0061单位胰岛素。

3)特征：

所获得的W/O/W乳液由具有至多180nm的流体动力学直径的悬浮分子组成。通过高的ζ电位值表明了，它是高度稳定的。胶囊在4℃的温度下储存。一周后，观察到有少量油相流出到表面，并伴随有乳液被稀释。使用动态光散射(DLS)技术进行的测量表明，ζ电位的模块化值略微降低并且分子尺寸减小。结果列于表1和图20至图23中。

表1.W/O/W体系在乳液生产当天以及一周和两周后的流体动力学直径(体积平均值)和ζ电位的测量值总结。

实施例XIII

1)胰岛素溶液的制备。

通过另外的49.73mg胰岛素的溶液来使实施例1的胰岛素溶液变浓，并加入6μl盐酸(C＝3mol/dm³)来对其进行酸化以获得澄清溶液，然后使该澄清溶液在Vortex振动器中经受5分钟振动。

获得的胰岛素具有81.34mg/ml(2284.75UI)的浓度。

通过将30μl的HyCl2溶液(在0.15M NaCl中，C＝15g/l)与80μl的胰岛素溶液和10μl的染料(中性红，在0.15M NaCl中，C＝3.5mg/ml)混合来制备乳液1的第一组分。

乳液1：

使120μl的乳液1的第一组分和3.6ml的油酸的混合物在Vortex振动器经受10分钟振动，然后经受以脉冲模式的30分钟超声处理。

乳液2：

使20μl的乳液1和2ml的HyC12溶液(在0.15M NaCl中，C＝5mg/ml)的混合物在Vortex振动器中经受10分钟振动，然后经受以脉冲模式的30分钟超声处理。所获得的乳状、粘性且非常浓的乳液每1ml含0.49单位胰岛素。

特征：

所获得的胶囊具有由高的ζ电位值反映的良好稳定性的特征。所包封的染料也会影响这些高的值。胶囊在4℃的温度下储存。在一周和两周后，乳液保持其稳定性。一周后(及以后)，流体动力学直径、高分散指示剂和共聚焦显微镜的测量表明，形成了聚集体和较大的结构，并且没有证据表明样品单分散性。

为了测量的目的，将胶囊用0.15M NaCl溶液稀释(100×)。结果示于表2和图24至图26中。

表2.W/O/W体系在乳液生产当天以及一周、两周和三周后的流体动力学直径(体积平均值)和ζ电位的测量值总结。

实施例XIV

乳液1：按照实施例2中所述的过程来生产。

乳液2：

将10μl的乳液1和2ml的HyC12(C＝2.5mg/ml；0.15M NaCl)在Vortex振动器中经受10分钟振动，然后经受以脉冲模式的30分钟超声处理。

所获得的乳状且粘性的乳液每1ml含有0.245单位胰岛素。

特征：

所获得的胶囊具有由高的ζ电位值表明的良好稳定性的特征。所包封的染料也会影响这些高的值。胶囊在4℃的温度下储存。

一周后，乳液保持其稳定性。低PDI值反映了样品的单分散性，并且没有聚集倾向。

为了测量的目的，将胶囊用0.15M NaCl溶液稀释(1000×)。结果列于表3和图27至图28中。

表3.W/O/W体系在乳液生产当天和一周后的流体动力学直径(体积平均值)和ζ电位的测量值总结。

实施例XV

胰岛素溶液的制备：按照实施例2中所述的过程。

通过将60μl的HyC12溶液(在0.15M NaCl中，C＝7.5mg/ml)与50μl的胰岛素溶液和10μl的染料(中性红，在0.15M NaCl中，C＝3.5mg/ml)混合来制备乳液1的第一组分。

乳液1：

使120μl的乳液1的第一组分和3.6ml的油酸的混合物在Vortex振动器中经受10分钟振动10，然后经受以脉冲模式的30分钟超声处理。

乳液2：

使10μl的乳液1和2ml的HyC12溶液(在0.15M NaCl中，C＝2.5mg/ml)的混合物在Vortex振动器经受10分钟振动，然后经受以脉冲模式的30分钟超声处理。所获得的乳状、粘性的且非常浓的乳剂每1ml含0.154单位胰岛素。

特征：

所获得的胶囊具有由高的ζ电位值反映的良好稳定性的特征。所包封的染料也会影响这些高的值。胶囊在4℃的温度下储存。

一周后，乳液保持其稳定性。所获得的流体动力学直径分布表明，最初存在聚集体，其在一周后解聚。

为了测量的目的，将胶囊用0.15M NaCl溶液稀释(100×)。结果示于表4和图29中。

表4.W/O/W体系在乳液生产当天和一周后的流体动力学直径(体积平均值)和ζ电位的测量值总结。

实施例XVI

1)胰岛素溶液的制备。

通过加入94mg胰岛素使在实施例4中获得的胰岛素溶液变浓，并用4μl 3M的尿酸对其进行酸化以获得澄清溶液，随后使该澄清溶液在Vortex振动器中经受5分钟振动。

所获得的胰岛素溶液具有200mg/ml(5617.98UI)的浓度。

通过将20μl的HyC12溶液(C＝7.5mg/ml；0.15M NaCl)与100μl的胰岛素溶液混合来制备乳液1的第一组分。

乳液1：

使120μl的乳液1的第一组分和3.6ml的油酸的混合物在Vortex振动器中经受10分钟振动，然后经受以脉冲模式的30分钟超声处理。

乳液2：

将10μl的乳液1和1ml的HyC12溶液(在0.15M NaCl中，C＝5mg/ml)的混合物在Vortex振动器中经受20分钟振动，然后经受以脉冲模式的35分钟超声处理。

所获得的乳状、粘性且非常浓的乳液每1ml含1.5单位胰岛素。

特征：

所获得的胶囊具有由高的ζ电位值表明的良好稳定性的特征。胶囊在4℃的温度下储存。在一周后，乳液保持其稳定性。流体动力学直径尺寸的分布较窄。

为了测量的目的，将胶囊用0.15M NaCl溶液稀释(100×)。结果列于表5和图30中。

表5.W/O/W体系在乳液生产当天和一周后的流体动力学直径(体积平均值)和ζ电位的测量值总结。

*3.56mg＝100UI[

2011，"Drug Discovery and Evaluation:Methods mClinical Pharmacology",Editors:Vogel,H.Gerhard,Maas,Jochen,Gebauer,Alexander]

实施例XVII

诱发1型糖尿病

用硫喷妥钠(thiopental)(50mg/kg体重)来麻醉质量为180g至200g的一组30只的雄性Wistar大鼠；随后以60mg/kg体重的剂量经由尾静脉注射溶解在磷酸盐缓冲液中的链脲佐菌素(STZ)。注射溶液的最终体积总计为1ml/kg体重。链脲佐菌素注射后三天，测量血糖。发现每只动物均具有超过450mg％的血糖水平，这反映了胰腺中产生胰岛素的β细胞受损的事实。在此期间，动物可以无限制地获取饲料和水。

包封的胰岛素的活性的评估

在耐葡萄糖性测试前十二小时，将大鼠分为五组，每组六只动物(总共30只动物)，并且不再供应饲料。这些动物可以继续不受限制地获得水。实验分为以下几组中进行：

1、对照组：每1kg体重2g葡萄糖，经由胃管施用。

2、胰岛素组：每1kg体重7.5单位胰岛素和每1kg体重2g葡萄糖，经由胃管同时施用。

3、对照组：每1kg体重0.5g葡萄糖，经由胃管施用。

4、胰岛素组：施用每1kg体重11.25单位胰岛素，20分钟后再施用每1kg体重0.5g葡萄糖，经由胃管施用。

5、胰岛素组：每1kg体重11.25单位胰岛素和每1kg体重0.5g葡萄糖，经由胃管同时施用。

胰岛素以在按照实施例5中所述的过程获得的W/O/W体系中包封的形式施用。

在每组中，用以下时间点从尾静脉采集的血液样品来测量葡萄糖水平：0；15；30；45；60；75；90；105；120(以及135，在第1组和第2组中)。使用Bionime

GM100血糖仪进行葡萄糖测量。

葡萄糖水平测量的结果示于表6至表10并且以曲线图的形式示于图12中，其中曲线图中示出了第1组和第2组(图31a)以及第3组、第4组和第5组(图31b)相对于相关对照组的平均值。

表6.仅施用葡萄糖2g/kg的第1组的葡萄糖水平测量结果(以mg/dl表示)的列表。

Lp.＝编号

Czas[min]＝时间[分钟]

Waga[g]＝重量[g]

Styzenie glukozy[mg/dl]＝葡萄糖浓度[mg/dl]

表7.同时施用胰岛素(7.5u/kg)和葡萄糖(2g/kg)的第2组的葡萄糖水平测量结果的列表。

表8.仅施用葡萄糖0.5g/kg的第3组的葡萄糖水平测量结果的列表。

表9.施用胰岛素(11.25u/kg)，20分钟之后再施用葡萄糖(0.5g/kg)的第4组的葡萄糖水平测量结果的列表。

表10.同时施用胰岛素(11.25u/kg)和葡萄糖(0.5g/kg)的第5组的葡萄糖水平测量结果的列表。

基于这些测量，计算出葡萄糖曲线下方的表面积。计算每组的平均值，并将其与相关对照组进行比较，从而计算出相对于对照组的百分比比例，即计算出第2组相对于第一对照组1，并且第4组和第5组相对于第三对照组3的百分比比例(表11)。

表11.第2组、第4组和第5组(区域P2、P4、P5)参照相关对照组(P1和P3)的葡萄糖曲线下方的表面积测量的结果。

^a是指第1组至第5组的葡萄糖曲线下方的表面积。

最终结论：

1、研究结果表明，在链脲佐菌素诱发的1型糖尿病的动物中，包封的胰岛素对葡萄糖曲线产生了积极效果。

2.在较低葡萄糖剂量的情况下，所观察的效果更加明显，这表明需要增加制剂中的胰岛素单位数。

3.在施用葡萄糖前20分钟，施用包封的胰岛素将产生更有益的效果。

Claims (12)

1.一种用于同时递送亲水性化合物和亲脂性化合物的水包油包水双重乳液形式的纳米胶囊包纳米胶囊型的多隔室体系，其特征在于，所述多隔室体系包括：

a)用于输送亲脂性化合物的液态油芯，其容纳有选自包括以下项的组中的油：油酸；棕榈酸异丙酯；脂肪酸；天然提取物和油，诸如玉米油、亚麻籽油、大豆油、摩洛哥坚果油；或它们的混合物；有利地是油酸；

b)用于输送亲水性化合物的胶囊或多个胶囊，所述胶囊或多个胶囊具有水性芯，包埋在油芯中；

c)既用于具有油芯的胶囊又用于具有水芯的内部胶囊的稳定化外壳，其由选自包括以下项的组中的疏水改性的多糖组成：壳聚糖，寡壳聚糖，葡聚糖，角叉菜胶，淀粉糖，淀粉，羟丙基纤维素，普鲁兰糖和糖胺聚糖，透明质酸，硫酸肝素，硫酸角质素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸皮肤素的衍生物；有利地是透明质酸的衍生物；

d)外部胶囊，直径小于1μm，在水溶液中稳定；

e)活性物质。

2.根据权利要求1所述的体系，其中，疏水改性的多糖中的疏水性侧链取代度的范围为0.1％至40％。

3.根据权利要求1所述的体系，其中，用于具有油芯的胶囊和具有水芯的胶囊(内部胶囊)的所述稳定化外壳由具有下式的疏水改性的透明质酸钠Hy-Cx组成：

其中，x是在1至30范围内的整数，并且它限定了疏水性侧链中的碳原子总数，数m/(m+n)的比值的范围为0.001至0.4。

4.根据权利要求1所述的体系，其中，所输送的亲脂性化合物可以是荧光染料、脂溶性维生素或疏水性药物。

5.根据权利要求1所述的体系，其中，所输送的亲水性化合物可以是荧光染料、水溶性维生素、蛋白质或亲水性药物；有利地是胰岛素。

6.根据权利要求5所述的体系，其中，胰岛素的浓度为每1ml胶囊悬浮液中0.005至20.000个胰岛素单元。

7.一种生产如权利要求1所限定的水包油包水双重乳液形式的纳米胶囊包纳米胶囊型的多隔室体系的方法，其特征在于：

a)在第一步期间，通过暴露于超声波(超声处理)或暴露于有利地是混合或振动的机械刺激，将上式的透明质酸十二烷基衍生物Hy-Cx的水性溶液与无毒性的油进行混合来生产油包水(W/O)型反相乳液，所述无毒性的油构成混合物体积的约0.1％至99.9％，其中，水性相与油相的体积比的范围为1∶10至1∶10000，有利地是大约1∶100；

b)在第二步期间，使悬浮在连续油相中的水滴接收透明质酸盐包衣，其中，W/O相乳液与水性相的体积比的范围为1∶10至1∶10000，有利地是大约1∶100；

c)最后，通过暴露于超声波(超声处理)或暴露于有利地是混合或振动的机械刺激来生产水包油包水(W/O/W)双重乳液体系；

其中，所施加的水相是基于疏水改性的多糖的水性溶液，具有2至12的范围内的pH值，0.1g/L至30g/L的浓度，以及0.001mol/dm³至3mol/dm³的范围内的离子强度，所述疏水改性的多糖选自包括以下项的组：壳聚糖，寡壳聚糖，葡聚糖，角叉菜胶，淀粉糖，淀粉，羟丙基纤维素，普鲁兰糖和糖胺聚糖，以及特别透明质酸，硫酸肝素，硫酸角质素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸皮肤素的衍生物；有利地是透明质酸的衍生物；

并且，所述油相包含如下的油，所述油选自包括以下项的组：油酸；棕榈酸异丙酯；脂肪酸；天然油，特别是亚麻子油、大豆油、摩洛哥坚果油；或它们的混合物的组；有利地是油酸；

尤其是，所述方法在不使用任何小颗粒表面活性剂的情况下进行。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，进行脉冲超声处理，其中脉冲持续时间是两个连续脉冲之间的间隔持续时间的一半。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，包封的所述亲脂性化合物容纳在所述油芯中，并且包封的所述亲水性化合物容纳在纳米胶囊的水芯中。

10.根据权利要求7所述的方法，其中，其中在多糖中的离子基团的含量不低于20mol％时，是有利的；并且在多糖中的离子基团的含量超过60mol％时，是有利的(以每1个单体单元计算)。

11.根据权利要求7所述的方法，其中，在所述第一步和所述第二步期间，在18℃至40℃的温度下持续进行超声处理15分钟至60分钟，有利地在25℃至30℃的温度下，进行超声处理60分钟以获得反相乳液，进行超声处理30分钟以获得双重乳液。

12.根据权利要求1所述的多隔室体系用于输送亲脂性化合物和亲水性化合物的应用，其中，所述亲脂性化合物可以是荧光染料、脂溶性维生素或疏水性药物；而所述亲水性化合物可以是荧光染料、水溶性维生素、蛋白质或亲水性药物，有利地是胰岛素。

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