CN112877254A - 一株内生克什米尔小陌生菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株内生克什米尔小陌生菌及其应用，所述菌为克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）BQB‑B04，已于2021年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21796。所述植物内生克什米尔小陌生菌具有解磷解钾固氮的作用，可以在植物体内定殖，提高生物酶活性，对调节植物生长和发育具有重要的作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物内生克什米尔小陌生菌及其应用。
背景技术
植物内生细菌生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部, 并与植物建立了和谐联合关系。内生细菌能在植物体内长期定殖、传导，且不易受环境条件的影响，对植物生长发育、增强宿主抗性及提高植物修复能力等方面具有广泛的生物学作用，是非常难得的天然生物资源。
红树林是以红树植物为主体的潮滩湿地生态群落，生长在热带、亚热带近海海岸潮间带，长期受周期性海水浸淹。红树林具有防汛、防浪、防风暴、护堤的功能，在维护大气碳氧平衡、净化大气和水体环境等方面具有其独特的社会和经济价值。全球红树林主要分布在南北回归线之间，在我国主要分布于海南、广东、广西、福建、香港、澳门及台湾沿海。红树林特殊的生境决定了其丰富的微生物资源，蕴藏着不同于其他环境微生物来源的遗传资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一株植物内生解磷解钾固氮克什米尔小陌生菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株植物内生克什米尔小陌生菌，其分类命名为克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）BQB-B04，已于2021年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21796，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述克什米尔小陌生菌的菌落特征及菌体形态为：
将BQB-B04在NA平板上培养24h后形成菌落颜色为黄白色，无光泽，呈圆形、表面微凸起、不透明、边缘整齐，革兰氏染色阳性，无芽孢，无荚膜；菌落直径2-3mm。
所述内生克什米尔小陌生菌的生理生化特征：
BQB-B04 接触酶反应呈阴性，V．P测定呈阴性，MR测定呈阳性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产H2S试验试验阳性。
将所述内生解磷解钾固氮克什米尔小陌生菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明: BQB-B04与Advenella kashmirensis 同处于一个分支上，其16SrDNA序列与Advenella kashmirensis（KU043380.1）的相似度达98.52%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）。
本发明的优点在于：
所述植物内生克什米尔小陌生菌具有解磷解钾固氮的作用，可以在植物体内定殖，提高生物酶活性，对调节植物生长和发育具有重要的作用。
本发明所述克什米尔小陌生菌制成菌剂通过灌根方式接种蔬菜幼苗，可以明显促进植株生长，提高叶片叶绿素含量，提高过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，与对照相比，差异达显著水平。因此，本发明为将来开发微生物菌剂菌肥提供了良好的菌株资源。
附图说明
图1 BQB-B04处理后油菜叶片 SPAD值的变化。
图2 BQB-B04处理后油菜叶片 CAT 活性的变化。
图3 BQB-B04处理后油菜叶片POD活性的变化。
图4 BQB-B04处理后油菜叶片SOD 活性的变化。
图5 BQB-B04处理后对油菜生长的影响。
图6 BQB-B04处理后上海青叶片 SPAD值的变化 。
图7 BQB-B04处理后上海青叶片 CAT 活性的变化。
图8 BQB-B04处理后上海青叶片POD活性的变化。
图9 BQB-B04处理后上海青叶片SOD 活性的变化。
图10 BQB-B04处理后对上海青生长的影响。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进一步说明。
一株植物内生解磷解钾固氮克什米尔小陌生菌，其分类命名为克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）BQB-B04，已于2021年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21796。
实施例1 解磷解钾固氮克什米尔小陌生菌的筛选
（1）筛选过程：
通过梯度稀释法，从福建漳州、泉州、宁德红树植物中分离出319株分离物。通过三区划线法对分离到的内生细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转移到NA斜面上保存备用。通过平板解磷解钾固氮效果测定，初步筛选出32株具有较好解磷解钾固氮效果的内生菌株，最终筛选出一株具有良好解磷解钾固氮效果的内生细菌，标记为BQB-B04。
（2）菌落特征及菌落形态：
将BQB-B04在NA平板上培养24h后形成菌落颜色为黄白色，无光泽，呈圆形、表面微凸起、不透明、边缘整齐，革兰氏染色阳性，无芽孢，无荚膜；菌落直径2-3mm。
（3）生理生化特征：
BQB-B04 接触酶反应呈阴性，V．P测定呈阴性，MR测定呈阳性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产H2S试验试验阳性。
（4）解磷解钾固氮能力测定：
将分离得到的内生细菌菌株分别接种到事先配制好的有机磷培养基、无机磷培养基、钾细菌培养基以及Ashby无氮培养基平板上，每皿4个接菌点，重复３次。28℃恒温培养 5d。分别观察并记录菌株生长情况及分解圈大小，根据分解圈大小、透明圈直径／菌落直径（Ｄ/ｄ值）确定内生细菌的解磷解钾固氮活性。分解圈越大、Ｄ/ｄ值越大，表示解磷解钾固氮活性越强。
其中，有机磷培养基： 葡萄糖 10g，(NH4)2 SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，卵磷脂 0.2 g，CaCO3 5.0g，酵母膏 0.4 g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
无机磷培养基：葡萄糖 10g，(NH4)2 SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，MgSO4 0.3g，CaCO3 5.0g，Ca3(PO4) 2 5.0g，酵母膏 0.4 g，琼脂 20g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
钾细菌培养基：蔗糖10.0g，酵母膏 0.5 g ，(NH4)2SO4,1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0 g，钾长石粉 1g，琼脂 15g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
Ashby无氮培养基：蔗糖10.0g，酵母膏 0.5 g ，(NH4)2SO4,1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0 g，钾长石粉 1g，琼脂 15g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）。
通过测定，克什米尔小陌生菌BQB-B04解有机磷活性为“+++”，透明圈/菌落直径（D/d）为5.32±0.33，解无机磷活性为“++”，透明圈/菌落直径（D/d）为2.51±0.28，解钾活性为“++”，透明圈/菌落直径（D/d）为3.54±0.17。固氮活性为“+++”。
表1高效解磷解钾固氮菌株的初步筛选
注: D:透明圈直径 ， d:菌落直径 ，
“-”：无活性（分解圈＜10mm）；“+”：有活性（分解圈:10-15mm）；
“++”：较强活性（分解圈：16-20mm）；“+++”：很强活性（分解圈：＞20mm）；
将初筛中具有解磷解钾活性的菌株接种于NB培养基中，待菌悬液的浓度达到108cfu/ mL时，各取5mL菌悬液分别接种于100 mL有机磷液体培养基、无机磷液体培养基及钾细菌液体培养基中，每个处理重复3 次，同时设不接种为对照。28℃，160 r /min 培养7d后进行离心（４℃，10000 r/ min，15 min），取上清液采用钼锑抗比色法测定测定有效磷增量（扣除对照后的值），可溶性磷含量计算公式如下：P＝K×V/V1。式中，P为有效磷含量；Ｋ为标准曲线查得显色液的磷含量（mg/L）；V为显色时溶液定容的体积（mL）；V1为显色时吸取上清液的体积（mL）。用火焰光度法测定有效钾增量（扣除对照后的值）。
通过测定，克什米尔小陌生菌BQB-B04 从0.2g/L卵磷脂中释放出的可溶性磷为68.21 mg/L，是对照处理的40.36倍，差异显著（P＜0.05）；从5.0g/L磷酸三钙中释放出的可溶性磷为58.65 mg/L，是对照处理（0.82 mg/L）的71.52倍，差异显著（P＜0.05）。培养液中可溶性钾含量为27.5 mg/L，与对照差异显著。
表2 摇瓶法内生细菌解磷效果测定
（5）16S rDNA序列分析
16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示。将所测的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明: BQB-B04与Advenella kashmirensis 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Advenella kashmirensis（KU043380.1）的相似度达98.52%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）。
（6）内生定殖
将所述内生细菌菌株BQB-B04通过利福平标记的方法，获得稳定的利福平标记抗性突变体菌株。在含300μg/ml 利福平（Rif）的NB培养基中，28 ℃，180 r·min-1 条件下振荡培养 72 h，用无菌水稀释制成含1×108cfu/mL 的菌悬液。通过灌根法及叶腋注射法接种油菜幼苗，并于接种后3 d和7 d分别取植物幼苗根、茎、叶部组织分离突变体菌株。测定结果表明，通过灌根法及叶腋注射处理第3 d及第7 d两种接种处理方法在植物的根、茎、叶部组织中均能回收到突变菌株，而对照中未分离到细菌，表明内生克什米尔小陌生菌BQB-B04可以在植物体内定殖，并可以传导与繁殖。
表3 灌根和注射法接种促生菌株在油菜植株体内的定殖分离结果
注：+表示可分离到细菌菌落。
实施例2 油菜盆栽实验
将克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）BQB-B04在NA斜面上活化，挑取一环接入NA培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH7.0-7.2）中，于28℃、180 r·min-1 条件下振荡培养72 h，培养液用无菌水稀释制成含1×108 cfu/mL的菌悬液做接种用。灌根接种油菜幼苗（接种量为20mL/株），每处理 10 株，3 次重复，以清水为对照。接种处理15d测定叶片叶绿素含量，并采集油菜叶片各5-10片，并充分混合作为一个混合样，用于过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶(SOD)等指标的测定。
采用SPAD-502叶绿素快速测定仪（Minolta，Japan），选取10片植物叶片，分别在叶基、叶中、叶尖处测得SPAD值，求出每片叶的平均值，进行3个重复。用SPAD值表示叶片叶绿素相对值。
采用紫外分光光度法测定植物叶片过氧化氢酶（CAT）活性，参照愈创木酚法测定植物叶片过氧化物酶（POD）活性活性，参照氮蓝四唑(NBT)光还原法测定植物叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性。
BQB-B04对油菜叶片叶绿素含量的影响
从图1可以看出，经BQB-B04注射接种处理15d，内生细菌BQB-B04接种处理油菜叶片SPAD值与清水对照相比差异显著，BQB-B04处理后的油菜叶片叶绿素含量增加。因叶绿素在光能吸收、传递和转换中起着重要的作用，叶绿素含量的增加能够提高植物的光合作用速率，从而促进其生长。
BQB-B04对油菜叶片过氧化氢酶（CAT）活性的影响
由图2可以看出，BQB-B04处理后的植物叶片过氧化氢酶活性高于清水对照处理，与对照处理之间差异显著。过氧化氢酶（CAT）是植物体内重要的酶促防御系统，可以清除H2O2，是植物体内重要的抗氧化酶。
BQB-B04对油菜叶片过氧化物酶(POD)活性的影响
由图3 可以看出，BQB-B04接种处理15d时POD活性明显高于清水对照处理，差异显著。表明内生细菌注射接种植物后可以提高植物叶片过氧化物酶（POD）活性，从而促进植物生长。
BQB-B04对油菜叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
内生细菌BQB-B04处理15 d后，油菜叶片SOD活性明显高于清水对照处理，差异显著（图4）。表明接种促生菌株后可以提高植物叶片的超氧化物歧化酶（SOD）活性。
BQB-B04对油菜株高生长的影响
内生细菌BQB-B04处理后，可以促进油菜幼苗株高的生长，与清水对照相比，差异显著（图5），表明接种促生菌株后可以提高植物生长发育。
实施例3 上海青盆栽实验
将克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）BQB-B04在NA斜面上活化，挑取一环接入NA培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH7.0-7.2）中，于28℃、180 r·min-1 条件下振荡培养72 h，培养液用无菌水稀释制成含1×108 cfu/mL的菌悬液做接种用。灌根接种上海青幼苗（接种量为20mL/株），每处理 10 株，3 次重复，以清水为对照。接种处理15d测定叶片叶绿素含量，并采集上海青叶片各5-10片，并充分混合作为一个混合样，用于过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶(SOD)等指标的测定。
采用SPAD-502叶绿素快速测定仪（Minolta，Japan），选取10片植物叶片，分别在叶基、叶中、叶尖处测得SPAD值，求出每片叶的平均值，进行3个重复。用SPAD值表示叶片叶绿素相对值。
采用紫外分光光度法测定植物叶片过氧化氢酶（CAT）活性，参照愈创木酚法测定植物叶片过氧化物酶（POD）活性活性，参照氮蓝四唑(NBT)光还原法测定植物叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性。
BQB-B04对上海青叶片叶绿素含量的影响
从图6可以看出，经BQB-B04接种处理15d，内生细菌BQB-B04接种处理上海青叶片SPAD值与清水对照相比差异显著，BQB-B04处理后的上海青叶片叶绿素含量增加。因叶绿素在光能吸收、传递和转换中起着重要的作用，因此可以认为叶绿素含量的增加能够提高植物的光合作用速率，从而促进其生长。
BQB-B04对上海青叶片过氧化氢酶（CAT）活性的影响
由图7可以看出，BQB-B04处理后的植物叶片过氧化氢酶活性高于清水对照处理，与对照处理之间差异显著。过氧化氢酶（CAT）是植物体内重要的酶促防御系统，可以清除H2O2，是植物体内重要的抗氧化酶。
BQB-B04对上海青叶片过氧化物酶(POD)活性的影响
由图8可以看出，BQB-B04接种处理15d时POD活性明显高于清水对照处理，差异显著。表明内生细菌注射接种植物后可以提高植物叶片过氧化物酶（POD）活性，从而促进植物生长。
BQB-B04对上海青叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
内生细菌BQB-B04处理15 d后，上海青叶片SOD活性明显高于清水对照处理，差异显著（图9）。表明接种促生菌株后可以提高植物叶片的超氧化物歧化酶（SOD）活性。
BQB-B04对上海青株高生长的影响
内生细菌BQB-B04处理后，可以促进上海青幼苗株高的生长，与清水对照相比，差异显著（图10），表明接种促生菌株后可以提高植物生长发育。
实施例4 BQB-B04对草莓生长的作用效果
将克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）BQB-B04在NA斜面上活化，挑取一环接入NA培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH7.0-7.2）中，于28℃、180 r·min-1 条件下振荡培养72 h，培养液用无菌水稀释制成含1×108 cfu/mL的菌悬液做接种用。选取温室大棚内移栽1个月左右的草莓幼苗，施用克什米尔小陌生菌BQB-B04菌液灌根接种草莓幼苗（接种量为20mL/株），每处理 30 株，3 次重复，30天后再次灌根施用以上菌液。以清水处理的草莓为对照，60天后调查结果。试验结果表明，与清水对照组相比，接种克什米尔小陌生菌BQB-B04菌液处理的草莓长势强壮，叶片大而浓绿；花蕾、开花数量处理与对照偏少，新枝微多；坐果数明显高于对照，且坐果早而大，坐果数增幅为17.88%，草莓糖份提高了0.5，增幅为4.35%。
表4 BQB-B04对草莓生长的作用效果
实施例5 BQB-B04对黄瓜生长的作用效果
将克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）BQB-B04在NA斜面上活化，挑取一环接入NA培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH7.0-7.2）中，于28℃、180 r·min-1 条件下振荡培养72 h，培养液用无菌水稀释制成含1×108 cfu/mL的菌悬液做接种用。选取温室大棚内长势均匀，四叶一心的黄瓜秧苗各20m2，分别作为试验组与对照组，各组内黄瓜秧苗株数相同。将克什米尔小陌生菌BQB-B04菌液稀释30倍后喷施叶面，15天后灌根施用接种黄瓜秧苗（接种量为20mL/株），以清水处理作为对照。待开始收获时，连续15天统计黄瓜产量、发病率等。试验结果表明，与清水对照组相比，克什米尔小陌生菌BQB-B04菌液处理的黄瓜长势强壮，叶色浓绿；黄瓜瓜形均匀，产量明显高于对照，产量增幅12.62%；发病率降低78.38%。
表5 BQB-B04对黄瓜生长的作用效果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 闽江学院
<120> 一株内生克什米尔小陌生菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 886
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcggaggca cggggcgagc tcgcgagaag agtgagcctg gctcagagtt tgatcctggc 60
tcgagtttga tcgaggggtg agtttgtatc ggaacgtgcc cagtagcggg ggataactac 120
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tgacccgccc tggggggagt acggatcgca agatttaaaa aactca 886
Claims (5)
1.一株内生克什米尔小陌生菌，其特征在于：所述菌为克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）BQB-B04，已于2021年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.21796。
2.含权利要求1所述克什米尔小陌生菌的生物菌剂。
3.如权利要求1所述的克什米尔小陌生菌在解磷解钾固氮中的应用。
4.如权利要求1所述的克什米尔小陌生菌在提高生物酶活性中的应用。
5.如权利要求1所述的克什米尔小陌生菌在促进植物生长中的应用。
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