CN112852814B - 沉默GIPC1基因的siRNA、重组载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的PDZ家族成员—GIPC1(GAIP interacting protein,C‑terminus 1)蛋白的敲降序列，及其与SR‑B1相互作用。本申请还通过实验证实了GIPC1通过其蛋白的PDZ结构域与SR‑B1的胞内结构域结合。共转染GIPC1过表达载体能够显著提高细胞内SR‑B1的蛋白质含量，而利用敲降序列敲降GIPC1能够降低小鼠肝脏组织中SR‑B1的表达，及调节小鼠体内的脂质代谢，并且发现GIPC1蛋白的PDZ结构域和N端GH1结构域在SR‑B1蛋白的表达调控中均发挥重要作用。本申请丰富了SR‑B1的表达调控和胆固醇转运调节的分子机制，为高胆固醇血症等心血管疾病的治疗提供了一定的理论基础和潜在的干预靶点。

Description

沉默GIPC1基因的siRNA、重组载体及其应用
技术领域
本申请属于生物医药技术，特别是涉及一种沉默GIPC1基因的siRNA、重组载体及其应用。
背景技术
高密度脂蛋白特异性B类I型受体(Scanverger receptor class B type I,SR-B1)在胆固醇转运代谢中起着关键作用，它能够选择性地向细胞内摄入高密度脂蛋白胆固醇酯(High density lipoprotein cholesterol ester,HDL-CE)，从而通过影响“胆固醇逆转运(Reverse cholesterol transport,RCT)”途径清除血浆中胆固醇。SR-B1参与的RCT主要途径为：在胆固醇酯转移蛋白(Cholesterolestertransferprotein,CETP)作用下，高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)将从外周组织吸收的过量胆固醇转变为胆固醇酯(Cholesterol ester,CE)，接着由SR-B1介导肝脏及类固醇激素生成组织选择性地摄取CE，以胆汁或胆汁酸的形式排出体外，或由类固醇激素生成组织生成激素。因此，调控细胞中SR-B1的表达对于防止胆固醇在动脉壁上的沉积，并将胆固醇从血管壁转运入肝脏代谢具有重要的作用。
SR-B1在细胞内的表达通常受到转录及转录后等不同水平的调控。研究报道促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)等激素能够调控SR-B1的转录水平。PDZ蛋白家族成员能调控SR-B1的表达，其中PDZK1(PDZ domain containing 1)是最早发现能与SR-B1相互作用的PDZ家族蛋白，它能调控SR-B1的表达，影响SR-B1对HDL-CE的选择性摄入。本申请发现了一种新的PDZ家族成员—GIPC1(GAIP interacting protein,C-terminus 1)能与SR-B1相互作用，目前未见相关报道。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本申请提供了一种沉默GIPC1基因的siRNA、重组载体及其应用。
技术方案：本申请公开了一种沉默GIPC1基因的siRNA，其序列为：5’-GCAGTGTGATTGACCACATTC-3’。
本申请还公开了一种沉默GIPC1基因的siRNA的重组载体，其含有上述沉默GIPC1基因的siRNA。
所述沉默GIPC1基因的siRNA的重组载体的构建方法，根据GIPC1敲降序列，合成特异性DNA序列，95度退火互补成为带有BamH1和HandⅢ酶切位点粘性末端的DNA双链，连接到BamH1和HandⅢ酶切过的Psilencer3.0-H1载体上，构建获得敲降GIPC1的载体。
本申请还公开了所述沉默GIPC1基因的siRNA或重组载体在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
优选的，所述心血管疾病为高胆固醇血症。
进一步的，所述药物下调细胞内SR-B1的蛋白表达水平，下调细胞对CE的选择性摄入以及细胞中甘油三酯TG和脂滴的含量。
本申请通过质谱筛选了与SR-B1相互作用的潜在蛋白，发现了一种新的PDZ家族成员—GIPC1(GAIP interacting protein,C-terminus 1)能与SR-B1相互作用。并通过实验证实了GIPC1通过其蛋白的PDZ结构域与SR-B1的胞内结构域结合。共转染GIPC1能够显著提高细胞内SR-B1的蛋白质含量，并且发现GIPC1蛋白的PDZ结构域和N端GH1结构域在SR-B1蛋白的表达调控中均发挥重要作用。本申请中，发现蛋白酶体抑制剂MG132能抑制GIPC1对SR-B1蛋白表达的上调作用，并且发现GIPC1能够下调SR-B1的泛素化修饰水平。GIPC1在不同组织中均有一定的表达，在SR-B1高表达的组织中也有较高的表达。在高脂饮食肥胖小鼠和OBOB基因敲除肥胖小鼠的肝脏组织中，GIPC1的蛋白表达水平与SR-B1蛋白表达水平均下降。在小鼠肝脏细胞中分别过表达和干扰GIPC1，结果显示GIPC1能调控细胞内SR-B1的蛋白表达水平，进而影响细胞对CE的选择性摄入以及细胞中甘油三酯(TG)和脂滴的含量。这些结果表明GIPC1调控SR-B1的表达从而影响胆固醇的转运代谢。
有益效果：本申请发现了一种新的PDZ家族成员—GIPC1(GAIP interactingprotein,C-terminus 1)，其能够与SR-B1相互作用，丰富了SR-B1的表达调控和胆固醇转运调节的分子机制，为高胆固醇血症等心血管疾病的治疗提供了一定的理论基础和潜在的干预靶点。
附图说明
图1是Biotin标记的SR-B1的C端胞内蛋白结构域能与SR-B1相互结合结果；其中，A.银染检测实验组蛋白条带中GIPC1的位置，如箭头所示；B.采用Western Blot法验证，Pull-down产物中确实存在GIPC1；
图2是免疫共沉淀法验证SR-B1和GIPC1之间存在相互作用结果；A.细胞裂解液与Anti-Flag beads(M2beads)孵育，检测GIPC1-V5蛋白是否存在；B.细胞裂解液与Anti-V5和protein A+G beads孵育，检测Flag-SR-B1是否存在；
图3是GIPC1结构域示意图；将GIPC1分为GIPC1-1-225-V5、GIPC1-1-150-V5、GIPC1-126-333-V5、GIPC1-225-333-V5四种不同的截短体质粒；
图4是SR-B1与GIPC1不同结构域结合情况；A.C.D将细胞裂解液与M2beads孵育，采用免疫共沉淀法分别检测GIPC1-1-225-V5、GIPC1-1-150-V5、GIPC1-225-333-V5四种截短体质粒与SR-B1是否互相结合；B.将细胞裂解液与Anti-V5和protein A+G beads孵育，检测SR-B1与GIPC1-126-333蛋白是否存在相互作用；
图5是SR-B1不同结合区域示意图；
图6是GIPC1与SR-B1胞内结构域结合情况；A.B.C.D.E.将细胞裂解液与M2beads孵育，检测GIPC1-V5蛋白是否存在；
图7是GIPC1不同截短体质粒表达载体调节SR-B1蛋白水平的表达情况；A.检测过表达GIPC1-V5质粒表达载体对SR-B1蛋白水平的影响；B.检测GIPC1-225-333、GIPC1-1-150-V5、GIPC1-1-225-V5、GIPC1-126-333-V5等质粒表达载体对SR-B1蛋白水平的影响；
图8是Western Blot检测GIPC1对SR-B1各种截短体质粒蛋白表达水平的影响；A.检测GIPC1对SR-B1-1-1-504、SR-B1-1-1-474、SR-B1-1-1-464蛋白水平的影响；B.检测GIPC1对SR-B1-9-464、SR-B1-9-509蛋白水平的影响；
图9是CHX处理下，过表达GIPC1降低SR-B1的蛋白降解速率；A.用Western Blot法检测CHX处理下，不同时间点的SR-B1的蛋白；B.对A的统计分析图；
图10是GIPC1抑制SR-B1的泛素蛋白酶体途径降解；A.MG132处理下，Western Blot检测GIPC1对SR-B1蛋白表达水平的影响；B.IP检测SR-B1蛋白泛素水平的变化；
图11是GIPC1在各组织和细胞中的表达情况；A.NCBI查找GIPC1在各组织中的表达；B.Real-time PCR检测小鼠肝脏、肾上腺、卵巢等组织GIPC1的表达量；
图12是肥胖小鼠模型肝脏组织中SR-B1和GIPC1的表达情况；A.高脂喂食肥胖小鼠模型中SR-B1和GIPC1的表达情况；B.obob基因敲除肥胖小鼠模型中SR-B1和GIPC1表达情况；
图13是Hepa 1-6细胞中敲降GIPC1调节SR-B1表达；A.Western Blot检测过表达GIPC1对SR-B1蛋白表达水平的影响；B.Real-time PCR检测敲降GIPC1对SR-B1 mRNA水平的影响；
图14是Hepa 1-6细胞中敲降GIPC1影响SR-B1的功能；A.敲降GIPC1对细胞吸收HDL的影响；B.Image J对A进行分析，图中白色标尺表示20μm，统计3个视野(***P<0.001)；
图15是Hepa 1-6细胞中敲降GIPC1影响细胞中TG的含量；A.敲降GIPC1，细胞中TG的含量降低；B.绿色为BODIPY标记的脂滴；蓝色为DAPI标记的细胞核；白色标尺表示20μm；C.使用Image J对B图进行统计分析，统计3个视野(**P<0.01)；
图16是Hepa 1-6细胞中过表达GIPC1调节SR-B1的蛋白表达水平；WesternBlot检测过表达GIPC1对SR-B1蛋白表达水平的影响；
图17是Hepa 1-6细胞中过表达GIPC1影响SR-B1的功能；A.过表达GIPC1对细胞吸收HDL的影响，图中的白色标尺为20μm；B.用Image J对A图进行统计分析，两组均统计了3个视野(***P<0.001)；
图18是过表达GIPC1影响Hepa 1-6细胞中TG的含量；A.过表达GIPC1后，细胞中TG的含量；B.绿色为BODIPY标记的脂滴；蓝色为DAPI标记的细胞核；白色标尺表示20μm；C.使用Image J对B图进行统计分析，统计3个视野(**P<0.01)；
图19是敲降GIPC1的载体的构建；
图20是过表达GIPC1的载体的构建。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
敲降GIPC1的载体的构建：
ShGIPC1F5’:
GATCCGCAGTGTGATTGACCACATTCTTCAAGAGAGAATGTGGTCAATCACACTGCTTTTTTGGAAA
ShGIPC1-R5’：
AGCTTTTCCAAAAAAGCAGTGTGATTGACCACATTCTCTCTTGAAGAATGTGGTCAATCACACTGCG
通过网站：(https://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna.html)依次选择“Life Science”、“Advanced Genomics”、“CRISPR Technology&RNAi”、“siRNA”、“Predesigned siRNA”选项，对话框里输入GIPC1的ID名称得到多条GIPC1敲降序列，从中挑选出排名最高的三条序列，并合成特异性DNA序列，95度退火互补成为带有BamH1和HandⅢ酶切位点粘性末端的DNA双链，连接到BamH1和HandⅢ酶切过的Psilencer3.0-H1载体上，构建获得敲降GIPC1的载体。将构建完成的三个GIPC1-Psilencer3.0-H1敲降载体送到测序公司进行测序，确认序列无误后，转染到293细胞中做QPCR和westernblot实验，RNA水平和蛋白水平上验证GIPC1的敲降效率，从而选择出GIPC1敲降效率最高的一条序列。
特异性引物序列为：
5’-GATCCGCAGTGTGATTGACCACATTCTTCAAGAGAGAATGTGGTCAATCACACTGCTTTTTTGGAAA-3’-F；
5’-AGCTTTTCCAAAAAAGCAGTGTGATTGACCACATTCTCTCTTGAAGAATGTGGTCAATCACACTGCG-3’-R。
插入位点在BamH1和HandⅢ两个酶切位点之间。详见图19所示。
过表达GIPC1的载体的构建：
设计合成了特异性的引物，带有特定的酶切位点，通过PCR的方法扩增得到两端带有特定酶切序列的DNA片段，酶切后通过连接插入pcDNA6-v5质粒载体中，构建获得过表达GIPC1的载体。
特异引物序列为：5'-CGGCTAGCATGCCACTGGGACTGGGGCG-3'-F；5'-CCCTCGAGGTAGCGGCCAACCTTGG-3'-R
插入位点在Nhe I和Xho I两个限制性酶切点之间。详见图20所示。
1、实验材料、试剂和仪器
1.1主要的细胞系
Figure BDA0002939805130000051
1.2主要实验试剂
Figure BDA0002939805130000052
Figure BDA0002939805130000061
1.3主要仪器
Figure BDA0002939805130000062
1.4英文缩略词表
Figure BDA0002939805130000063
Figure BDA0002939805130000071
1.5相关抗体
Figure BDA0002939805130000072
1.6 PCR引物
Figure BDA0002939805130000073
Figure BDA0002939805130000081
2实验方法与步骤
2.1 Pull-down检测与SR-B1相互作用的蛋白
1)事先准备灭菌的1.5mL EP管放于冰上，在分析天平上分别秤取30mg小鼠肝脏组织放入EP管，立即加入500μL的IP裂解液(提前加入0.5μL的PMSF)，用剪刀剪碎，并用匀浆机研磨组织呈无明显块状组织匀浆，放在4℃预冷的离心机中，5000rpm，离心10min，缓慢吸取上清备用。
2)再取10μg的Biotin标记的SR-B1的C端肽段(即CT-45)加入EP管中，放在摇床上4℃孵育过夜，使两者充分结合。
3)第二天在混合物样品中加20μL的M-280Streptavidin磁珠，室温孵育1h。
4)将混合物样品放在4℃离心机中离心5min，离心转速为3000rpm，吸去上清留下磁珠后，加入1mL的PBS(提前加入0.5μL的PMSF并预冷)，然后放在4℃摇床上缓慢摇动5min，再放在磁力架上静置2min，吸去上清，依次重复3次，清洗磁珠。
5)吸干EP管中的PBS后，加40μL的2×Loading Buffer，在100℃沸水中煮5min，12000rpm，离心1min后，取上清放在-20℃保存备用。
2.2银染检测与SR-B1相互作用的蛋白
1)将上述样品跑电泳结束后，将SDS-PAGE胶取下来，立刻放入约100mL固定液(体积比为：乙醇：乙酸：水＝3:1:6)中，室温条件下在摇床上摇动1h，控制摇床速度为60-70rpm。
2)弃去上述固定液，将100mL 30％乙醇加入胶中，60-70rpm，室温摇动10min。
3)去掉上面乙醇，加入约200mL左右双蒸水，同样室温摇动10min，控制速度为60-70rpm。
4)弃掉上述步骤中的双蒸水，提前配置1×银染增敏液100mL，并加入其中，室温摇动2min，控制以上同样的速度。
5)弃掉上述步骤中的增敏液，加入200mL双蒸水，室温在摇床上以同样的速度摇动1min，重复此步骤一次。
6)弃掉上步骤中的水，加入100mL提前配置的1×银溶液，同样的速度摇动10min。
7)弃去银溶液，加入100mL双蒸水，清洗1min。
8)弃掉水，加入提前20min内配置的100mL银染显色液，同样的速度室温摇动，一直到胶显现出比较理想清楚的预期蛋白条带后，立即加入提前配置的1×银染终止液，室温以同样的速度摇动10min。
9)弃终止液，加入100mL双蒸水，清洗2-5min。
10)将上述凝胶割下质谱分析两组样品中的差异蛋白。
2.3质粒表达载体的构建
1)为构建本申请所需的质粒表达载体，我们从小鼠肝脏组织中提取总RNA，反转成cDNA，作为质粒表达载体构建的模板。
2)根据NCBI提供的空载质粒的相关信息，并在NEB cutter输入基因序列，选用合适的酶切位点，设计引物，最后利用NCBI上的Primer BLAST进行同源性分析，检测引物的特异性是否可靠。
3)目的基因序列PCR扩增
选择不同的质粒模板，使用上述步骤设计稀释过的引物进行PCR扩增，反应总体系为50μL，具体如下：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002939805130000101
配好体系，将样品放入PCR仪中进行扩增，具体的反应程序为：
Figure BDA0002939805130000102
PCR结束后，取2.5μL PCR产物加入2μL的5×Loading Buffer，混合均匀后跑凝胶电泳，确定产物条带位置正确与否。
4)目的基因PCR产物纯化
使用PCR扩增产物经Axygen的PCR清洁试剂盒纯化，步骤如下：
Figure BDA0002939805130000103
5)质粒载体的提取
前一天晚上在15mL的EP管中加入4mL的LB培养基(按照1:1000比例加入抗生素)，在EP管中按照1:100的比例接入空载质粒菌种，放入37℃恒温摇床中，控制转速220rpm，培养14h。第二天使用Axygen质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，提取的步骤如下：
Figure BDA0002939805130000104
Figure BDA0002939805130000111
6)目的基因和载体酶切
分别取纯化得到的目的基因和提取的质粒各3μg，分别进行双酶切，采用NEB的高效保真酶进行反应，条件为37℃，酶切5h。总体系为50μL，如下所示：
表2酶切反应体系
Figure BDA0002939805130000112
7)目的基因和载体酶切产物的胶回收
目的基因和载体酶切产物经凝胶电泳后，在紫外灯下割取相应大小位置的DNA条带，使用Axygen的胶回收试剂盒纯化，步骤如下：
Figure BDA0002939805130000113
Figure BDA0002939805130000121
8)目的基因和载体酶切产物的胶回收
将胶回收得到的目的基因和载体产物进行连接，连接的总体系为10μL，放入16℃金属浴中连接过夜，连接体系如下：
表3目的基因和载体连接体系
Figure BDA0002939805130000122
9)连接产物的转化
①从冰箱中取出DH5α感受态细胞，将连接产物加入到50μL感受态细胞悬液中，混合均匀后在冰上静置30min。
②将EP管放入42℃水浴锅中，水浴50s，立刻将离心管转移到冰中，静置2min。
③加入500μL的LB液体培养基，放置在37℃恒温摇床上培养1h，转速为220rpm。
④将菌液均匀涂在LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
10)菌落PCR的初步鉴定
①提前准备好1.5mL EP管，在管中加入500μL带有抗生素的LB培养基。
②用枪头挑取单个菌落并在培养基中轻轻沾一下，放置于37℃恒温摇床上培养4h。
③使用目的基因PCR的反应条件和程序进行鉴定。
④选取目的条带位置大小一致的菌液送去测序做进一步鉴定。
2.4细胞培养
1)细胞复苏：在超净台中取10cm培养皿，并加入9mL(10％FBS+1％双抗)的培养基，将细胞从液氮罐中取出，立即放于37℃水浴锅中，等细胞解冻后，将细胞转移至培养皿中，摇晃均匀后放入37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱内培养。
2)细胞传代培养：当细胞密度达到80％左右时，用移液枪弃去皿内培养液，并缓慢沿着培养皿壁加入2mL PBS(需提前预热到37℃)清洗皿内残余培养液两次，缓慢沿壁加入2mL 0.25％胰酶(含0.02％EDTA-Free Acid)，当观察到细胞变圆后，用移液枪吸去胰酶，并立即加入2mL培养基终止消化，用移液枪轻轻将吹匀细胞。将混匀的细胞平均分到两个10cm培养皿中，并缓慢加入培养基至终体积为10mL左右。
3)细胞冻存：当细胞密度达到80％左右时，吸去旧培养液，用PBS洗去培养基，在培养皿加入2mL 0.25％胰酶(含0.02％EDTA-Free Acid)，当细胞变圆时，吸去胰酶，并立刻加入2mL新鲜培养基，用移液器轻轻吹匀细胞，并将细胞转移到15mL离心管内，1000rpm，离心2min，弃去上清，立即加入提前配置好的细胞冻存液(冻存液各项溶剂的体积比为DMEM：FBS：DMSO＝6:3:1)，吹悬细胞，将细胞加到冻存管中，然后放入细胞冻存盒内，并立即将冻存盒转移到-80℃冰箱，第二天可取出细胞并放入液氮罐内长久保存。
2.5细胞脂质体转染
1)前一天在12孔板内接种2×105个细胞使细胞密度第二天能达到70％左右。
2)弃掉板内培养基，换为800μL新鲜的无FBS无双抗的培养基，放入培养箱内对细胞进行饥饿处理。
3)取两个1.5mL离心管，在每个离心管中分别加入100μL Opti-MEM，在其中一个管内加入4μL脂质体，在另外一个管内加入1.6μg质粒，轻轻弹离心管4-5次，混合物静置5min，将质粒和Opti-MEM混合物缓慢加入到脂质体和Opti-MEM混合物中，用手轻轻弹管壁4-5次，使其混匀，静置20min。
4)在每孔加入100μL混合液，放入培养箱中培养6h后换成含10％FBS和1％双抗的培养基，继续培养48h后收样。
2.6免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)验证两蛋白之间存在相互作用
1)在6孔板中转染GIPC1-V5和Flag-SR-B1两种质粒，以Flag-vector和GIPC1-V5作为对照组，培养48h后取出细胞，并用PBS清洗细胞，吸干PBS后，重复两次。在板内加入200μLIP裂解液(按照1:1000分别加入1×PMSF和1×Cocktail)，放在4℃摇床上缓慢裂解4h。
2)将细胞裂解液收集于1.5mL EP管中，放入4℃预冷的离心机中，5000rpm，离心10min，缓慢吸取上清转移至新的1.5mL EP管中。
3)分别取出10μL的上清将其设置为Input对照，剩余的分别加入8μL的Flag-M2beads放入4℃摇床上缓慢摇动过夜。
4)第二天将样品放入4℃离心机中离心5min，离心转速为3000rpm，避免离心力过大，破坏蛋白间的相互作用。小心吸去上清留下磁珠，两组分别加入预冷的1mL的PBS(提前按照1:1000加入PMSF)，然后放在4℃摇床上缓慢摇动5min，再放入4℃离心机中离心5min，离心转速为3000rpm，吸去上清，依次重复3次，清洗磁珠。
5)小心吸去EP管中的PBS，避免吸走磁珠，再分别加40μL的2×Loading Buffer，在input样品组中加入10μL的6×Loading Buffer，放入100℃水中煮5min后，12000rpm，离心1min，去掉磁珠取上清后放在-20℃保存备用。
2.7细胞蛋白质提取
1)用12孔板接种转染细胞，转染48h后，可提取细胞内总蛋白进行下一步实验。
2)吸去板内培养基，并用PBS缓慢清洗板内残余的培养基，然后吸净孔内的PBS，加入配好的含1％SDS的RIPA裂解液(按照1:1000分别加入1×PMSF)，每个孔内加入100μL裂解液，室温静置裂解5min。
3)用细胞刮刮净细胞，并将细胞裂解液转移入1.5mL离心管内，小心地加入20μL 6×Loading Buffer，用超声破碎仪超声破碎5s，以打断DNA片段，放入提前预冷的4℃离心机中，12000rpm，离心1min，小心地吸取上清液转移到新的1.5mL离心管内，放入沸水中煮5min，立即放在冰上静置2min，放入-20℃保存备用。
2.8蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测细胞蛋白质相对表达量
1)SDS-PAGE凝胶的制备
各取干净的厚薄玻璃板一块，将它们底端对齐放入架子中，先将配置好的分离胶缓缓加到两个玻璃板之间，约5mL距离梳子下边缘1cm处停止。立刻缓慢地在分离胶上面加入1mL左右的无水乙醇，避免用力过大冲击胶面。室温静置30min左右，待下层分离胶凝好后，将胶架及玻璃板倒置以控干上层的无水乙醇，将配置好的浓缩胶迅速加到两玻璃板之间，加至于玻璃板上边缘平齐，赶走气泡后小心地插入梳子，等待上层浓缩胶凝固即可。以下为分离胶和浓缩胶的配方：
表4分离胶和浓缩胶的配方
Figure BDA0002939805130000141
2)垂直电泳
将配好的胶板放置于垂直电泳槽内，在电泳槽内加入配置好的1×Runningbuffer，将准备好的蛋白样品依次加入点样孔内，每孔约上10μg蛋白样品，Marker组加样3μL，正确合上槽盖，接通电源，调整电压至80V。当蛋白Marker进入浓缩胶开始分离后，可调电压至120V，根据不同蛋白大小调整电泳时间。
3)转膜
等电泳结束后，将胶板取出，剪合适大小的PVDF膜，放入甲醇中激活数秒。在三明治架子的黑色面依次放入海绵和4-5层滤纸，并赶走气泡，把胶小心地取出来放在滤纸上，并将膜覆盖在胶上，再依次加4-5层滤纸和海绵，并赶走气泡，然后小心地合上夹子，放入电泳槽中，最后将预冷的20％甲醇的Trans buffer加到转移电泳槽中，合上盖子，接通电源后，将电流调至350mA，设置90min倒计时结束即可。
4)封闭
将膜取出，用丽春红染膜2min，可看到清晰的蛋白位置大小，即可按照需要蛋白大小剪膜，用PBS将丽春红洗掉色，将膜放入提前配制好的封闭液(5％的脱脂奶粉)中，室温在摇床上缓慢摇动使其封闭1.5h。
5)孵育一抗
封闭结束后，将膜取出，并用PBS清洗干净，放入孵育盒中，注意使其蛋白面朝上，并加入对应一抗(抗体用PBS稀释，比例参照说明书)，放入4℃摇床中孵育过夜。
6)孵育二抗
第二天，将一抗回收，用PBST(PBS+0.1％Tween 20)洗膜，放在摇床上清洗15min，重复3次。按照1:10000的比例稀释二抗，二抗抗性应与一抗抗性一致，放在摇床上室温孵育1.5h。孵育结束后弃去二抗，依然用PBST洗膜，每次清洗15min，重复3次。
7)显色
将洗好的膜吸干水后正面朝上放入扫描仪器中，均匀滴上ECL显影液，调整合适的曝光时间并保存图片即可。
2.9细胞总RNA的提取
用6孔板接种转染细胞，转染48h后，可提取细胞内总RNA并进行下一步实验。
1)取出6孔板，用PBS清洗两遍后并用移液枪吸干净水分，每孔加入500μL Trizol裂解细胞，放置于冰上裂解30min，将细胞裂解液移入无RNase的1.5mL离心管内。
2)在EP管内加入100μL氯仿，用振荡器涡旋震荡混匀后，冰上静置10min，将EP管转移至预冷的4℃离心机中，12000rpm，离心15min。可观察到管内液体分为三层，将最上层液体转移入新的无RNase的1.5mL EP管中。
3)在管内加250μL异丙醇，缓慢颠倒混匀后，放置于冰上静置10min后，将EP管转移至预冷的4℃离心机中，12000rpm，离心10min。弃去上清，底部白色沉淀即为RNA。
4)在管内加入500μL 75％乙醇溶液(使用DEPC水配制)，用手弹起底部沉淀，用预冷的4℃离心机离心10min，转速为7500rpm，弃去上清后，重复清洗一次。
5)将白色沉淀室温干燥10min，加入20-30μL DEPC水，溶解RNA。测定RNA的浓度及纯度，立即放入-80℃保存。
2.10荧光定量PCR(Real-time PCR)
将提取的总RNA逆转录成cDNA，体系如下表所示：
表5逆转录反应体系
Figure BDA0002939805130000161
配好体系，使用PCR仪进行扩增，具体反应程序为：
37℃ 15min
85℃ 5s
4℃ ∞
逆转录后，将其保存在-20℃中备用。
2.11实时定量PCR检测细胞mRNA的相对表达量
1)引物的设计
本申请所需要的PCR引物，根据Genbank上记载的SR-B1、GIPC1和36B4基因的全序列，IDT(Integrated DNA Technologies)设计引物，在NCBI上的Primer Blast进行同源性分析，确定引物的特异性。
2)荧光定量PCR
采用荧光定量PCR方法检测SR-B1的mRNA的表达水平，以36B4为内参，使用诺唯赞公司的
Figure BDA0002939805130000162
Ex TaqTM试剂盒，PCR反应体系如表2.6所示。
表6荧光定量PCR反应体系
Figure BDA0002939805130000171
实时荧光定量PCR反应程序如下：
Figure BDA0002939805130000172
荧光定量PCR所测得不同处理组的CT值与内参基因36B4的CT值相比较，计算该基因的相对表达量，将所得结果进行差异显著性分析。
2.12荧光检测细胞吸收HDL-CE的相对含量
1)在24孔板接种细胞后，分别在细胞中转染过表达与敲降GIPC1的质粒后，弃去细胞中的培养基后，用PBS清洗培养平板，然后加入含有DiL-DHL的培养基(终浓度为10μg/mL)，培养基中FBS应该更换为无脂的血清。
2)37℃培养箱中，培养5h，PBS清洗24孔板，最后在每个孔内加500μL的PBS，在荧光显微镜下拍照。
2.13细胞脂滴观察
1)在12孔培养板中加玻片后，接种Hepa 1-6细胞制成细胞爬片，第二天分别在细胞中转染过表达和敲降GIPC1的质粒；48h后，弃除上层培养液后，缓缓加入PBS并放在摇床上清洗细胞，每次5min，重复清洗2次。
2)每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定液，室温固定20min。
3)弃掉固定液，PBS清洗细胞，重复3次，每次5min。
4)每孔中加入1μL的BODIPY(浓度为1μg/mL)，在避光条件下37℃孵育20min。
5)每孔加入1mL PBS清洗细胞，每次10min。
6)每孔中加入1μL的DAPI(浓度为1μg/mL)，室温下避光染色10min。
7)加入PBS清洗细胞，重复3次，每次清洗10min，取出玻片，控干水分后，在玻片上加抗荧光淬灭封片，将正面朝下放在淬灭剂上封片，在显微镜下观察脂滴，并拍照保存。
2.14细胞TG含量检测
1)在12孔培养板中接种Hepa 1-6细胞，第二天分别在细胞中转染过表达和敲降GIPC1的质粒。
2)转染48h后，将细胞用胰酶消化后，1000rpm，离心10min。
3)弃去上清后，将细胞用PBS清洗，1000rpm，离心10min，重复2次。
4)在沉淀中加入100μL PBS进行匀浆，每次超声3～5s，间隔30s后，重复3次，制备好的匀浆液备用。
5)使用南京建成的TG测试盒进行反应，并在510nm波长下测量各孔的OD值。
2.15数据处理与统计
1)Western Blot图片使用Photoshop处理。
2)荧光图片采用Photoshop和Image J处理图片。
3)Real-time PCR和细胞TG含量等数据使用Excel和GraphPad Prism两个软件进行分析。数据处理采用Mean±Standard Deviation(SD)表示；两样本之间差异采用两样本均数的t检验检测，P<0.05指示差异具有显著性，以*来表示；用P<0.01表示差异极其显著，用**来表示。
3、实验结果
3.1GIPC1与SR-B1存在相互作用
寻找能与SR-B1相互结合的蛋白：将Biotin标记的SR-B1的C端胞内结构域多肽(CT-45)与小鼠肝脏组织细胞裂解液孵育，之后通过M-280Streptavindin纯化，将蛋白样品银染检测，之后采用质谱分析法检测与SR-B1发生潜在作用的蛋白。结果如图1所示，其中，图1A是银染检测实验组蛋白条带中GIPC1的位置，如箭头所示，除了能检测到已经报道的PDZ家族的经典蛋白—PDZK1之外，还有另外一个新的PDZ家族成员—GIPC1蛋白。图1B是利用GIPC1特异性抗体通过Western Blot法验证，Pull-down产物中确实存在GIPC1。
为了进一步验证GIPC1与SR-B1存在相互作用，分别构建pcDNA6-V5-hisA-GIPC1与PFLAG-CMV-SR-B1两个质粒表达载体，并将它们共同转染到CHO-K1细胞中，对照组设置PFLAG-CMV-4空载质粒和GIPC1-V5质粒共转细胞，48h后用IP裂解液裂解细胞4h，使用Anti-Flag(M2Agarose beads)和免疫共沉淀方法来验证之前的实验结果，与对照组相比，实验组证明了SRB1与GIPC1之间存在相互作用(图2A)。在反向免疫共沉淀的实验中，实验组为Anti-V5和protein A+G beads，对照组设置IgG和protein A+G beads，与IgG组相比，实验组验证了这两种蛋白存在上述相互作用关系(图2B)。
3.2SR-B1与GIPC1的PDZ结构域结合
为了研究GIPC1不同区域与SR-B1相互作用的情况，将GIPC1按照不同的结构域分成不同的截短体质粒，其中包含有GH1结构域和PDZ结构域的GIPC1-1-225-V5质粒表达载体；由于仅包含GH1结构域的GIPC1-1-125-V5蛋白不能在细胞中表达，构建了GIPC1-1-150-V5质粒表达载体；有包含PDZ结构域和GH2结构域的GIPC1-126-333-V5质粒表达载体；还有仅包含C端GH2结构域的GIPC1-1-150-V5质粒表达载体(图3)。
在CHO-K1细胞中分别共同转染GIPC1-1-225-V5和Flag-SR-B1质粒，对照组均设置PFLAG-CMV-4空载和GIPC1-V5共同转染细胞，48h后用IP裂解液裂解细胞4h，采用免疫共沉淀法检测SR-B1与不同截短体的结合情况。与对照组相比，实验组证明了SR-B1能与GIPC1-1-225-V5相互作用，也即SR-B1能与GIPC1蛋白的GH1结构域和PDZ结构域互相结合(图4A)。在CHO-K1细胞中过表达GIPC1-126-333-V5和Flag-SR-B1，使用anti-V5和protein A+Gbeads免疫共沉淀的方法检测，与IgG组相比，实验组Western Blot检测到SR-B1蛋白的存在，也证明了SR-B1能与GIPC1C端的GH2和中部PDZ结构域相互作用(图4B)。
为了进一步验证GIPC1的N端GH1结构域和GH2结构域在两者相互结合中的作用，分别将仅有N端和C端截短体质粒(GIPC1-1-150-V5)与Flag-SR-B1共转在CHO-K1细胞中。在仅存在N端的情况下，与对照组相比，实验组中同样未检测GIPC1-1-150-V5蛋白的存在，证明了在仅有GIPC1的N端GH1结构域情况下，SR-B1不能与其相互作用(图4C)。当同时过表达GIPC1的C端GH2结构域(GIPC1-225-333-V5)与Flag-SR-B1的情况下，同样未检测到SR-B1与GIPC1-225-333截短体质粒蛋白结合，证明SR-B1不能与GIPC1的C端GH2结构域相互作用(图4D)。
综上，GIPC1主要通过其蛋白中部PDZ结构域与SR-B1结合。
3.3GIPC1与SR-B1的胞内结构域相互作用
为了研究GIPC1不同区域与SR-B1相互作用的情况，根据SR-B1的结构将其分成不同的截短体质粒，构建SR-B1不同的C端截短体质粒，分别包括Flag-SR-B1-1-504、Flag-SR-B1-1-474、Flag-SR-B1-1-464等质粒表达载体；又构建了SR-B1的N端缺失质粒表达载体，即为Flag-SR-B1-9-509以及Flag-SR-B1-9-464用于后续的实验的研究(图5为其各个截短体质粒的示意图)。
构建SR-B1的C端不同的胞内结构域，研究其与GIPC1相互作用情况。在CHO-K1细胞中分别共转染Flag-SR-B1-1-504、Flag-SR-B1-1-474、Flag-SR-B1-1-464和GIPC1-V5等质粒，对照组均为pFLAG-CMV-4空载和GIPC1-V5质粒，48h后用IP裂解液裂解细胞，采用免疫共沉淀法检测GIPC1与SR-B1不同截短体的结合情况。与对照组相比，实验组证明了GIPC1能分别与SR-B1-1-504、SR-B1-1-474、SR-B1-1-464相互结合，证明了它们之间存在相互作用(图6A、B、C)。
检测SR-B1的N端缺失载体SR-B1-9-509和GIPC1之间是否存在相互作用，在CHO-K1中同时过表达这两种质粒时，将细胞裂解液与M2beads孵育后，同样检测到GIPC1的存在，这证明SR-B1的N端缺失质粒也能与GIPC1相互结合(图6D)。
将SR-B1的N端和C端缺失载体质粒(即SR-B1-9-464)与GIPC1-V5质粒共同表达在CHO-K1细胞中，并未检测到GIPC1蛋白的存在(图6E)，这说明SR-B1和GIPC1的结合区域是在胞内结构域，也就是只要SR-B1的N端和C端胞内结构域的任何一部分存在的情况下，均能与GIPC1相互作用。
3.4GIPC1调节SR-B1的蛋白表达水平
检测GIPC1中部的PDZ结构域是否会影响SR-B1的蛋白表达水平，在HEK293细胞中分别过表达GIPC1-V5、GIPC1-1-225-V5、GIPC1-1-150-V5、GIPC1-126-333-V5、GIPC1-225-333和Flag-SR-B1等质粒，采用Western Blot法检测SR-B1的蛋白相对表达水平。当在HEK293细胞中过表达GIPC1后，SR-B1的蛋白水平被上调，而GIPC1-1-225也能上调SR-B1的蛋白表达水平(图7A)。但是当过表达GIPC1-126-333时，却不能上调SR-B1的蛋白表达水平(图7B)，提示GIPC1上调SR-BI的蛋白表达水平是通过GIPC1的N端GH1结构域和中部的PDZ结构域共同作用得以实现。
为了检测GIPC1是否可以调节SR-B1的不同区域的蛋白水平，在HEK293细胞中分别表达Flag-SR-B1-1-504、Flag-SR-B1-1-474、Flag-SR-B1-1-464与GIPC1-V5等质粒，Western Blot检测SR-B1的不同区域蛋白的相对表达水平。在HEK293细胞中过表达GIPC1后，均能上调SR-B1不同的C端截短体质粒的蛋白水平。过表达GIPC1也能上调SR-B1的N端缺失载体质粒的蛋白水平，但是却不能上调SR-B1N端和C端胞内全部缺失载体的蛋白表达水平(图8)，也即证明GIPC1主要通过与SR-B1的N端和C端胞内结构域相互结合来上调SR-B1的蛋白表达水平。
3.5GIPC1抑制SR-B1的泛素蛋白酶体途径降解
为了寻找GIPC1上调SR-B1蛋白水平的可能原因，在HEK293细胞中同时过表达GIPC1-V5和Flag-SR-B1，对照组设置LACZ和Flag-SR-B1，两组均加入终浓度为20ng/mL的蛋白质合成抑制剂—亚胺环己酮(CHX)，分别处理细胞0h、3h、6h、9h、12h，收样后使用WesternBlot法检测SR-B1的蛋白表达水平。细胞加入CHX处理后，在0-6h区间内，过表达GIPC1组与对照组相比，SR-B1蛋白表达减少速率明显降低。在CHX处理6-12h后，过表达GIPC1和对照组均不再明显减少其蛋白表达量(图9)。
通过CHX处理细胞的实验，证实了GIPC1能抑制CHX对SR-B1蛋白表达量的影响。在HEK293细胞中同时过表达GIPC1-V5和Flag-SR-B1，对照组设置LACZ和Flag-SR-B1，两组均加入终浓度为20μM的MG132处理细胞10h，收样后用Western Blot法检测SR-B1的蛋白表达水平。与对照组相比，加入MG132后，明显抑制了GIPC1上调SR-B1蛋白水平的程度(图10A)。为了进一步确定GIPC1在SR-B1泛素化降解途径中的作用，在HEK293细胞中分别过表达GIPC1，以LACZ作为对照组，两组分别用终浓度为20μM的MG132处理细胞10h，用IP裂解液裂解细胞与M2beads孵育，再用Western Blot检测SR-B1的泛素化水平，未加MG132的对照组和实验组几乎未检测到其泛素化水平，加入MG132后，过表达GIPC1组与对照组相比，其泛素化水平受到了抑制(图10B)，说明GIPC1能抑制SR-B1的蛋白酶体途径降解进而稳定SR-B1的表达。
3.6GIPC1在不同组织和细胞中的表达水平
由于SR-B1主要表达在肝脏、肾脏等组织和细胞中，NCBI上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10755)的GIPC1的组织表达图显示GIPC1在各个组织中均有不同程度的表达，GIPC1在结肠、食管、肾、唾液腺和脾中有较高的表达，在肝脏、肾上腺、卵巢中也有一定的表达量(图11A)。检测GIPC1在SR-B1高表达的组织和细胞中表达量，结果发现GIPC1在这些组织和细胞中均有较高的表达量，(图11B)，提示GIPC1与SR-B1可能存在一定的联系。
3.7肥胖小鼠模型肝脏组织中SR-B1和GIPC1的表达情况
前期研究发现，在高脂饮食诱导的肥胖小鼠和obob基因敲除肥胖小鼠模型的肝脏组织中，SR-B1的蛋白表达水平被下调。为了进一步找出SR-B1和GIPC1之间的联系，通过Western Blot的方法验证不同肥胖小鼠模型中SR-B1和GIPC1的表达情况。相比普通组，高脂饮食肥胖小鼠肝脏组织SR-B1的蛋白水平下降，这与前期研究一致。同时，GIPC1的蛋白表达量呈减少的趋势(图12A)。在obob基因敲除的肥胖小鼠模型中，其肝脏组织中SR-B1和GIPC1的蛋白表达量也减少(图12B)。这证明GIPC1和内源性SR-B1存在一定的联系。
3.8GIPC1调节内源性SR-B1的表达和胆固醇的转运
为了研究GIPC1对于内源性SR-B1调节的情况，我们在小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6细胞中敲降GIPC1，48h后收集细胞，分别提取总蛋白和总RNA，再利用Western Blot法和qPCR法检测其对SR-B1的蛋白和mRNA表达水平的影响。当在细胞中敲降GIPC1后，SR-B1的蛋白水平被明显下调(图13A)。而SR-B1的mRNA水平也会随着GIPC1的敲降而被显著下调(图13B)。
SR-B1能选择性摄入高密度脂蛋白胆固醇，敲降GIPC1的表达后，SR-B1的蛋白表达被下调，可能会影响细胞对于高密度脂蛋白胆固醇酯的选择性摄入。在Hepa 1-6分别转染LACZ作为对照组，敲降GIPC1作为实验组，转染42h后，采用DiL标记的HDL处理两组细胞，在荧光显微镜下检测SR-B1的摄入HDL水平。当在Hepa 1-6细胞中敲降GIPC1后，SR-B1摄入HDL-CE水平明显低于对照组(图14A)。敲降GIPC1，SR-B1对HDL-CE的摄入量被下调了几乎2倍(图14B)。这说明敲降GIPC1确实能下调肝细胞内SR-B1蛋白的表达水平，并且明显下调了细胞吸收HDL-CE的水平。
同时采用细胞TG试剂盒和免疫荧光技术检测了不同处理组细胞中TG的含量。敲降GIPC1后，细胞中TG含量减少了几乎3倍(15A)。免疫荧光图中，绿色为BODIPY标记的TG，蓝色的为DAPI染的细胞核，可以观察到细胞中被BODIPY标记的TG明显减少(图15B、C)。
此外，为进一步证实GIPC1对SR-B1的作用，在Hepa 1-6细胞中过表达GIPC1质粒，采用Western Blot法检测过表达GIPC1后对SR-B1的蛋白表达水平的影响。当在细胞中过表达GIPC1后，SR-B1的蛋白水平也会被上调(图16)
为了探究上调GIPC1的表达对SR-B1的蛋白和对其功能的影响，在实验组过表达GIPC1，与对照组相比，SR-B1摄入HDL-CE的水平同样被上调(图17A)。统计分析图显示敲降GIPC1对SR-B1摄入HDL-CE的影响几乎2倍以(图17B)。这说明过表达GIPC1会上调Hepa 1-6中SR-B1的蛋白表达水平，并且增加了细胞摄入HDL-CE的水平。
在Hepa 1-6细胞中过表达GIPC1，使用南京建成的TG试剂盒检测细胞中TG的含量，结果显示细胞中TG含量明显被上调(18A)。同时，细胞中被BODIPY标记的TG增加。这说明GIPC1不仅能影响细胞吸收HDL-CE的水平，还能影响细胞中TG的含量(图18B、C)。

Claims (2)

1.沉默GIPC1基因的siRNA或含有沉默GIPC1基因的siRNA的重组载体在制备治疗心血管疾病的药物中的应用，其特征在于，所述沉默GIPC1基因的siRNA的序列为：5’-GCAGTGTGATTGACCACATTC-3’，所述心血管疾病为高胆固醇血症。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物下调细胞内SR-B1的蛋白表达水平，下调细胞对胆固醇酯CE的选择性摄入以及细胞中甘油三酯TG和脂滴的含量。
CN202110173850.1A 2021-02-09 2021-02-09 沉默GIPC1基因的siRNA、重组载体及其应用 Active CN112852814B (zh)

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