CN112852688A - 一种沙雷氏菌le及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物筛选技术领域。本发明提供了一种沙雷氏菌LE及其应用，所述沙雷氏菌LE拉丁文为Serratiaquinivorans。本申请的沙雷氏菌LE能够溶解无机磷，将难溶性无机磷转化为植物可以利用的可溶性磷，提高植物对土壤磷的利用。因此，在农业生产中可以通过这些解磷细菌来提高作物的磷利用效率，从而减少对化学磷肥的依赖，实现磷肥高效和环境友好的农业绿色发展。

Description

一种沙雷氏菌LE及其应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选技术领域，尤其涉及一种沙雷氏菌LE及其应用。
背景技术
菌体直杆状，直径0.5～0.8μm，长0.9～2.0μm，端圆。符合肠杆菌科的一般描述。通常周生鞭毛运动。兼性厌氧。菌落大多数不透明，有些虹彩；白色、粉红或红色。几乎所有的菌株能在10～36℃、pH 5～9、含有0％～4％(w/v)的NaCl中生长。接触酶反应强阳性，发酵D-葡萄糖和其他糖类产酸，有的产气。发酵并利用麦芽糖、甘露醇和海藻糖作为惟一碳源。
沙雷氏菌对人体有害，以防治的研究为主，到目前为止还未见报道将沙雷氏菌用于溶解无机磷方面的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沙雷氏菌LE及其应用，将难溶性无机磷转化为植物可以利用的可溶性磷，提高植物对土壤磷的利用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株沙雷氏菌LE，所述沙雷氏菌LE拉丁文为Serratiaquinivorans。
本发明还提供了一株沙雷氏菌LE在溶解无机磷方面的应用。
作为优选，所述无机磷为磷酸三钙。
本发明还提供了一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，包含如下步骤：
(1)将沙雷氏菌LE接种于LB液体培养基，震荡培养18～22h；
(2)震荡培养后的培养基离心，沉淀即为沙雷氏菌LE菌体；
(3)清洗沙雷氏菌LE菌体，定容，得稀释液；
(4)取稀释液和无机磷液体培养基混合，震荡培养10～14h，离心，测定上清液中速效磷的含量。
作为优选，所述步骤(1)和步骤(4)中的震荡培养条件为36～38℃、160～200r/min。
作为优选，所述步骤(2)中的震荡培养后的培养基OD值为0.55～0.65。
作为优选，所述步骤(2)中的离心的条件为4000～6000r/min离心2～4min。
作为优选，所述步骤(3)中洗清、定容时采用0.8～0.9％NaCl溶液。
作为优选，所述步骤(4)中稀释液的使用量为1～2mL。
作为优选，所述步骤(4)中离心的条件为10000～14000r/min离心1～3min。
本发明提供了一种沙雷氏菌LE及其应用，所述沙雷氏菌LE拉丁文为Serratiaquinivorans。本申请的沙雷氏菌LE能够溶解无机磷，将难溶性无机磷转化为植物可以利用的可溶性磷，提高植物对土壤磷的利用。因此，在农业生产中可以通过这些解磷细菌来提高作物的磷利用效率，从而减少对化学磷肥的依赖，实现磷肥高效和环境友好的农业绿色发展。
附图说明
图1为沙雷氏菌LE在无机磷培养基上形成的溶磷圈；
图2为沙雷氏菌LE的基因组完成图。
具体实施方式
本发明提供了一株沙雷氏菌LE，所述沙雷氏菌LE拉丁文为Serratiaquinivorans。
本发明还提供了一株沙雷氏菌LE在溶解无机磷方面的应用。
在本发明中，所述无机磷优选为磷酸三钙。
本发明还提供了一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，包含如下步骤：
(1)将1mL，107cfu/mL的沙雷氏菌LE接种于LB液体培养基，震荡培养18～22h；
(2)震荡培养后的培养基离心，沉淀即为沙雷氏菌LE菌体；
(3)清洗沙雷氏菌LE菌体，定容，得稀释液；
(4)取稀释液和无机磷液体培养基混合，震荡培养10～14h，离心，测定上清液中速效磷的含量。
在本发明中，所述步骤(1)和步骤(4)中的震荡培养的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃。
在本发明中，所述步骤(1)和步骤(4)中的震荡培养的转速优选为160～200r/min，进一步优选为180r/min。
在本发明中，所述步骤(2)中的震荡培养后的培养基OD值优选为0.55～0.65，进一步优选为0.6。
在本发明中，所述步骤(2)中的离心的转速优选为4000～6000r/min，进一步优选为5000r/min。
在本发明中，所述步骤(2)中的离心的时间优选为2～4min，进一步优选为3min。
在本发明中，所述步骤(3)中洗清、定容时优选采用0.8～0.9％NaCl溶液，进一步优选为0.85％NaCl溶液。
在本发明中，所述步骤(3)中洗清次数优选为1～5次，进一步优选为3次。
在本发明中，所述步骤(3)中定容时优选定容至10～20mL，进一步优选为15mL。
在本发明中，所述步骤(4)中稀释液的使用量优选为1～2mL，进一步优选为1.5mL。
在本发明中，所述步骤(4)中离心的转速优选为10000～14000r/min，进一步优选为12000r/min。
本发明中，所述步骤(4)中离心的时间优选为1～3min，进一步优选为2min。
本发明中，所述步骤(4)中测定上清液中速效磷的含量时上清液的使用量优选为0.5～1.5mL，进一步优选为1mL。
本发明中，所述步骤(4)中测定上清液中速效磷的含量时优选采用钼锑抗比色法。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1根际土壤的采集
在河南省新乡市红旗区洪门镇原堤村试验田采集小麦根际土壤，采用五点取样法，去除表层可见的动植物残体，深挖到20cm，将根系和土壤一同装入无菌袋中，放于4℃冰盒内并带回实验室。到实验室后将根系取出，轻轻抖掉附于根上的土壤，然后用毛刷将附着在根系上的土壤刷下并作为根际土壤，最后将五个样点的根际土壤混匀并过筛(1mm)，采用四分法收集约100g的根际土壤放入样品采集袋中，置于4℃冰箱中保存。
实施例2培养基选择
以国际植物研究所磷酸盐生长培养基(NBRIP)作为选择性无机磷培养基。
实施例3解磷细菌的分离和纯化
采用选择性无机磷培养基和平板稀释法对小麦根际土壤中的解磷细菌进行分离筛选。具体操作如下：在超净工作台中称取新鲜土壤样品5g于无菌离心管中，用无菌水定容至50mL，振荡20min，然后按10倍梯度依次进行稀释，用移液枪吸取10-6～10-4三个稀释度样品各0.1mL，均匀涂布于无机磷固体培养基上，每个梯度重复三次，最后在28℃恒温箱中倒置培养并观察平板中菌落生长状况及透明圈的产生情况。
用接种环挑取具有溶磷圈且未发生重叠的菌落，在新的无机磷固体培养基上按照Z字形划线纯化，28℃恒温箱中倒置培养，直至得到纯菌株，然后置于4℃冰箱中保存。
实施例4菌株鉴定
(1)细菌基因组DNA的提取
采用AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒(Axygen，USA)提取细菌的基因组DNA，具体步骤按照操作说明进行。
(2)细菌基因组PCR扩增
利用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)对基因组DNA进行扩增。
(3)PCR产物的纯化
PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体步骤按照操作说明进行。
(4)序列测定
取各个样品纯化后的PCR产物，在上海派森诺生物科技股份有限公司使用ABI3730-XL测序仪进行双向测序。
(5)序列分析
所得序列用ChromasPro软件截去无效序列后，利用BioEdit软件对双端有效序列进行拼接，然后将有效序列在NCBI数据库中利用Blast程序，与NCBI数据库中的参考序列进行比对，获得与待测菌株序列相似性最大的菌株信息，即为鉴定结果。
实施例5菌株解磷能力的分析
(1)溶磷圈的测定
将分离纯化得到的菌株分别点接于无机磷固体培养基上，置于28℃恒温箱中倒置培养3d，观察溶磷圈产生情况，并选取两个或多个互相垂直的方向分别测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)，根据D/d比值对各菌株的解磷能力进行初步判断。
(2)解磷能力的定量分析
将筛选得到的菌株接种于LB液体培养中，于37℃、180r/min振荡培养20h，测量菌液的OD值，使其OD值＝0.6，然后在5000r/min下离心3min，弃上清液后，用0.85％的NaCl溶液清洗菌体三次，再用0.85％的NaCl溶液定容至15mL，充分摇匀后用移液枪从中吸取1mL加到无机磷液体培养基中，每个菌株重复三次，于37℃、180r/min振荡培养12h，随后摇匀并用移液枪吸取1.5mL菌液于无菌的1.5mL离心管中，12000r/min离心2min，吸取1mL上清液作为待测液，采用钼锑抗比色法测定培养液中速效磷的含量。
实施例6菌株全基因组测序和生物信息学分析
利用Qiagen试剂盒提取高质量的菌体DNA，构建1D文库，利用Oxford NanoporeTechnology测序仪GridION对DNA进行单分子测序，获得原始测序数据。随后将得到的原始数据进行basecalling之后，进行生物信息分析。
结果：解无机磷菌株LE的基本信息及其解磷能力见表1
(1)细菌的鉴定结果
利用平板稀释法和16S rDNA测定技术，得到1株解无机磷菌株，编号为LE，通过与NCBI数据库中的参考序列进行比对，发现其为Serratia quinivorans。
(2)菌株解磷能力的定性分析
溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)的比值(D/d)可作为初步判断解磷细菌相对解磷能力的一个指标。对不同菌株的溶磷圈直径和菌落直径进行测量，并计算两者比值，结果显示溶解磷酸三钙的菌株LE的D/d比值为2.0。同样，根据菌株的溶磷圈也可以直观的观察出其溶磷能力的强弱。
(3)菌株解磷能力的定量分析
根据培养液中速效磷含量的多少，可以判断菌株的解磷能力。解磷菌株LE从磷酸三钙中活化出来的速效磷含量为34.10mg/L，对磷酸三钙的活化率达到30.25％。
表1
Figure BDA0003022808410000061
(4)解磷菌株基因组完成图
将基因组测序深度(258.96X)、GC分布(55.43％)、tRNA(87个)、rRNA(22个)、CDS(4900个)和基因岛(1个)进行整合，绘制核基因组圈图，如图2所示。
由以上实施例可知，本发明提供了一种沙雷氏菌LE及其应用，所述沙雷氏菌LE拉丁文为Serratia quinivorans。本申请的沙雷氏菌LE能够溶解无机磷，将难溶性无机磷转化为植物可以利用的可溶性磷，提高植物对土壤磷的利用。因此，在农业生产中可以通过这些解磷细菌来提高作物的磷利用效率，从而减少对化学磷肥的依赖，实现磷肥高效和环境友好的农业绿色发展。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株沙雷氏菌LE，其特征在于，所述沙雷氏菌LE拉丁文为Serratia quinivorans。
2.权利要求1所述的一株沙雷氏菌LE在溶解无机磷方面的应用。
3.根据权利要求2所述的一株沙雷氏菌LE在溶解无机磷方面的应用，其特征在于，所述无机磷为磷酸三钙。
4.权利要求1所述的一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)将沙雷氏菌LE接种于LB液体培养基，震荡培养18～22h；
(2)震荡培养后的培养基离心，沉淀即为沙雷氏菌LE菌体；
(3)清洗沙雷氏菌LE菌体，定容，得稀释液；
(4)取稀释液和无机磷液体培养基混合，震荡培养10～14h，离心，测定上清液中速效磷的含量。
5.根据权利要求4所述的一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(4)中的震荡培养条件为36～38℃、160～200r/min。
6.根据权利要求4所述的一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中的震荡培养后的培养基OD值为0.55～0.65。
7.根据权利要求6所述的一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中的离心的条件为4000～6000r/min离心2～4min。
8.根据权利要求4所述的一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中洗清、定容时采用0.8～0.9％NaCl溶液。
9.根据权利要求8所述的一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(4)中稀释液的使用量为1～2mL。
10.根据权利要求4～9任意一株沙雷氏菌LE的解磷能力的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(4)中离心的条件为10000～14000r/min离心1～3min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102876599A (zh) * 2012-09-06 2013-01-16 南京林业大学 一种粘质沙雷氏菌及其在促进中国枫香生长中的应用
CN112625981A (zh) * 2021-01-21 2021-04-09 华南农业大学 一株黏质沙雷氏菌及其应用

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