CN112851797B - 一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和用途，所述重组人III型胶原蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，通过与脯氨酸‑4‑羟化酶在宿主细胞中共表达，得到具有三级螺旋结构的重组人III型胶原蛋白，该蛋白具有更好的稳定性和功能性，用其制备的止血海绵具备优异的止血效果，并且有效解决了动物源性胶原蛋白传播病毒的风险。

Description

一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于优化编码基因技术领域，具体地涉及一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

胶原蛋白又称胶原，是一种结构蛋白，III型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成三股螺旋状。一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由Gly-x-y氨基酸序列重复而成。其中，x通常为脯氨酸，y通常为羟脯氨酸和羟赖氨酸，后两种氨基酸在其他蛋白质中很少见。羟脯氨酸通常由脯氨酸经脯氨酸羟化酶的作用形成。羟脯氨酸羟基参与链间的氢键键合，促进三螺旋结构的形成，提高胶原蛋白的稳定性和功能性。这种三肽重复序列对胶原蛋白的结构起着重要作用，特别是成纤维胶原的胶原域是由长而不中断的三股螺旋组成。

胶原蛋白的免疫原性低，具有促进组织修复、止血等功能，现已被广泛应用于食品、化妆品、生物医学材料、药品等领域。现阶段，胶原蛋白主要从动物组织中提取得到，然而来源于动物组织的材料都存在病毒感染的风险，如疯牛病等；同时，由于动物个体的差别导致胶原蛋白的批间稳定性很差。随着基因工程技术的发展，已经有研究采用基因工程手段来表达重组人III型胶原蛋白。

目前重组人III型胶原蛋白多采用小片段表达，这是因为其全长表达需要脯氨酸羟化酶的羟基化作用，而常用的大肠杆菌和酵母表达体系中都不含有脯氨酸羟化酶，因此重组表达得到的全长片段稳定性非常低，极易降解。

有鉴于此，本领域需要一种具备良好功能特性并能够重组表达的人III型胶原蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高效表达羟基化重组人III型胶原蛋白的方法，以及所述重组人III型胶原蛋白用于制备止血材料的应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明一方面提供一种重组人III型胶原蛋白片段，其以人III型胶原蛋白为基础，选择其中具有与细胞结合能力的片段进行拼接，得到重组人III型胶原蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明另一方面提供编码如上所述的重组人III型胶原蛋白片段的核酸片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供一种表达载体，包含如上所述的编码重组人III型胶原蛋白的核酸片段和编码脯氨酸-4-羟化酶的核酸片段。

优选的，所述编码脯氨酸-4-羟化酶的核酸片段具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

优选的，所述表达载体的制备步骤如下：

(1)基因设计和合成

根据如SEQ ID NO:3所示的重组人III型胶原蛋白片段的氨基酸序列和如SEQ IDNO:1所示的巨型病毒脯氨酸-4-羟化酶的氨基酸序列，反向设计编码核酸序列，并进行密码子优化，得到编码重组人III型胶原蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO:4和编码脯氨酸-4-羟化酶Hy726的核苷酸序列SEQ ID NO:2，然后进行全基因合成，得到编码所述重组人III型胶原蛋白片段的核酸片段1851和编码所述脯氨酸-4-羟化酶的核酸片段Hy726；

(2)表达载体的构建：

a)将所述核酸片段1851插入到pET30a+的酶切位点NdeI和XhoI之间并转化宿主菌，挑取阳性克隆，提取质粒，得到pET30a+-1851；

b)将所述核酸片段Hy726插入到pACYCDeut 1的酶切位点Nco I和BamH I之间并转化宿主菌，挑取阳性克隆，提取质粒，得到pACYCDeut 1-Hy726；

c)将pET30a+-1851和pACYCDeut 1-Hy726分别用Nde I和Xho I双酶切，回收载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X)和核酸片段1851(N-X)，并通过连接酶连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，得到表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1851。

本发明还提供一种宿主细胞，包含如上所述的表达载体。

优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供一种制备重组人III型胶原蛋白的方法，包括在培养基中培养如上所述的宿主细胞，诱导表达后进行蛋白纯化，获得重组人III型胶原蛋白。

本发明还提供一种利用如上所述的方法制备的重组人III型胶原蛋白。

本发明最后一方面提供如上所述的重组人III型胶原蛋白用于制备止血材料的用途。

优选的，所述止血材料为止血海绵。

更优选的，所述止血海绵通过下述方法制备：将所述重组人III型胶原蛋白用纯化水配制成0.2-20％(w/v)浓度的溶液，然后再加入EDC和NHS，在室温下反应4-24h后加入模具中，在-40℃至-80℃预冻，然后在-40℃保持1-4小时，真空干燥，将冷冻干燥的海绵在纯化水中清洗，然后再将海绵冻干，制备得到止血海绵。

本发明技术方案的有益效果在于：

(1)本发明选用人III型胶原蛋白中具有Gly-Pro-Pro(Gly-x-y)序列的片段进行拼接得到重组人III型胶原蛋白片段，然后通过在宿主细胞中共表达所述重组人III型胶原蛋白和脯氨酸-4-羟化酶，得到具有Gly-Pro-Hyp序列并且具备稳定的三级结构的重组人III型胶原蛋白，其中Gly-Pro-Hyp构象对GPVI-血小板相互作用是特异的，其是一种强效的血小板激动剂。经过实验验证，相对于市售医用胶原蛋白止血海绵，本发明的重组人III型胶原蛋白具有明显更优的止血性能，说明通过对人III型胶原蛋白中含Gly-Pro-Pro片段的选择性拼接以及利用脯氨酸-4-羟化酶进行羟基化修饰，重组人III型胶原蛋白的止血活性得到了显著提高。

(2)本发明的重组人III型胶原蛋白制备方法适于工业化大规模生产，并且制备出的产品没有动物来源的感染源，因此生物安全性更高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的具体实施方式，下面将对附图作简单介绍。

图1pACYCDeut 1-Hy726的双酶切电泳图，图中：1、Marker(15K)；2、pACYCDeut 1-Hy726双酶切产物；3、pACYCDeut 1-Hy726双酶切产物。

图2pACYCDuet 1-Hy726-1851的双酶切电泳图，图中：M、Marker(15K)；1、pACYCDuet 1-Hy726-1851质粒；2、pACYCDuet 1-Hy726-1851双酶切产物。

图3诱导表达之前和之后菌体的SDS-PAGE图，图中：M、Marker；1、诱导前菌体；2、诱导后菌体。

图4诱导表达之前和之后菌体的Western Blot图，图中：1、诱导前菌体；2、诱导后菌体。

图5羟基化和未羟基化重组人III型胶原蛋白在60℃放置4h后的SDS-PAGE图，图中：M、Marker；1、羟基化重组人III型胶原蛋白；2、未羟基化重组人III型胶原蛋白。

图6肝脏创面的组织病理学检查结果，图中包括样品组，上市产品对照组(1)，上市产品对照组(2)，纱布对照组(1)，纱布对照组(2)和纱布对照组(3)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。

实施例1基因设计和合成

(1)基因设计：

(a)脯氨酸-4-羟化酶

根据巨型病毒脯氨酸-4-羟化酶的氨基酸序列(MKTVTIITIIVVIIVVILIIMVLSKSCVSHFRNVGSLNSRDVNLKDDFSYANIDDPYNKPFVLNNLINPTKCQEIMQFANGKLFDSQVLSGTDKNIRNSQQMWISKNNPMVKPIFENICRQFNVPFDNAEDLQVVRYLPNQYYNEHHDSCCDSSKQCSEFIERGGQRILTVLIYLNNEFSDGHTYFPNLNQKFKPKTGDALVFYPLANNSNKCHPYSLHAGMPVTSGEKWIANLWFRERKFS，SEQ ID NO：1)，利用在线设计工具Jcat(http://www.jcat.de/)反向设计其编码核酸序列，并针对宿主大肠杆菌表达进行密码子优选，在设计过程中去除Nco I和BamH I酶切位点以有利于后期基因操作。经过上述优化，得到编码巨型病毒脯氨酸-4-羟化酶的核酸片段Hy726，其核苷酸序列如下所示：

ATGAAAACCGTTACCATCATCACCATCATCGTTGTTATCATCGTTGTTATCCTGATCATCATGGTTCTGTCTAAATCTTGCGTTTCTCACTTCCGTAACGTTGGTTCTCTGAACTCTCGTGACGTTAACCTGAAAGACGACTTCTCTTACGCTAACATCGACGACCCGTACAACAAACCGTTCGTTCTGAACAACCTGATCAACCCGACCAAATGCCAGGAAATCATGCAGTTCGCTAACGGTAAACTGTTCGACTCTCAGGTTCTGTCTGGTACCGACAAAAACATCCGTAACTCTCAGCAGATGTGGATCTCTAAAAACAACCCGATGGTTAAACCGATCTTCGAAAACATCTGCCGTCAGTTCAACGTTCCGTTCGACAACGCTGAAGACCTGCAGGTTGTTCGTTACCTGCCGAACCAGTACTACAACGAACACCACGACTCTTGCTGCGACTCTTCTAAACAGTGCTCTGAATTCATCGAACGTGGTGGTCAGCGTATCCTGACCGTTCTGATCTACCTGAACAACGAATTCTCTGACGGTCACACCTACTTCCCGAACCTGAACCAGAAATTCAAACCGAAAACCGGTGACGCTCTGGTTTTCTACCCGCTGGCTAACAACTCTAACAAATGCCACCCGTACTCTCTGCACGCTGGTATGCCGGTTACCTCTGGTGAAAAATGGATCGCTAACCTGTGGTTCCGTGAACGTAAATTCTCT(SEQ ID NO:2)。

该序列与原始基因序列(NCBI Reference Sequence:NM_000090.3)相比，大肠杆菌稀有密码子从野生型的49个降低到了0个，有利于在宿主菌大肠杆菌中高效表达该基因。

(b)重组人III型胶原蛋白片段

对人III型胶原蛋白中含有Gly-Pro-Pro的片段进行选择性拼接，得到重组人III型胶原蛋白片段，其C端包含组氨酸标签，以便于鉴定和纯化。所述重组人III型胶原蛋白片段的氨基酸序列如下所示：

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：3)。

针对宿主大肠杆菌表达，对该氨基酸序列进行密码子优化，得到编码所述重组人III型胶原蛋白片段的核酸片段1851，其核苷酸序列如下所示：

ATGTACGACTCTTACGACGTTAAATCTGGTGTTGCTGTTGGTGGTCTGGCTGGTTACCCGGGTCCGGCTGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTACCTCTGGTCACCCGGGTTCTCCGGGTTCTCCGGGTTACCAGGGTCCGCCGGGTGAACCGGGTCAGGCTGGTCCGTCTGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTAAAGACGGTGAATCTGGTCGTCCGGGTCGTCCGGGTGAACGTGGTCTGCCGGGTCCGCCGGGTATCAAAGGTCAGCCGGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTACCGCTGGTTTCCCGGGTTCTCCGGGTGCTAAAGGTGAAGTTGGTCCGGCTGGTTCTCCGGGTTCTAACGGTGCTCCGGGTCAGCGTGGTGAACCGGGTCCGCAGGGTCACGCTGGTGCTCAGGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTATCAACGGTTCTCCGGGTGGTAAAGGTGAAATGGGTCCGGCTGGTATCCCGGGTGCTCCGGGTCTGATGGGTGCTCGTGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTTCTCAGGGTGAATCTGGTCGTCCGGGTCCGCCGGGTCCGTCTGGTCCGCGTGGTCAGCCGGGTGTTATGGGTTTCCCGGGTCCGAAAGGTAACGACGGTGCTCCGGGTAAAAACGGTGAACGTGGTGGTCCGGGTGGTCCGGGTCCGCAGGGTCCGCCGGGTAAAAACGGTGAAACCGGTCCGCAGGGTCCGCCGGGTCCGACCGGTCCGGGTGGTGACAAAGGTGACACCGGTCCGCCGGGTCCGCAGGGTCTGCAGGGTCTGCCGGGTACCGGTGGTCCGCCGGGTGAAAACGGTAAACCGGGTGAACCGGGTCCGAAAGGTGACGCTGGTGCTCCGGGTGCTCCGGGTGGTAAAGGTGACGCTGGTGCTCCGGGTGAACGTGGTCCGCCGGGTCTGGCTGGTGCTCCGGGTCTGCGTGGTGGTGCTGGTCCGCCGGGTCCGGAAGGTGGTAAAGGTGCTGCTGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTGAAACCGGTCCGCCGGGTCCGGCTGGTTTCCCGGGTGCTCCGGGTCAGAACGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCTCCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGTTGCTGGTCCGCCGGGTGGTTCTGGTCCGGCTGGTCCGCCGGGTTCTCCGGGTGGTCCGGGTGCTGCTGGTTTCCCGGGTGCTCGTGGTCTGCCGGGTCCGCCGGGTTCTAACGGTAACCCGGGTCCGCCGGGTCCGTCTGGTTCTCCGGGTAAAGACGGTCCGCCGGGTCCGGCTGGTAACACCGGTGCTCCGGGTTCTCCGGGTGTTTCTGGTCCGAAAGGTGACGCTGGTCAGCCGGGTGAAAAAGGTTCTCCGGGTGCTCAGGGTCCGCCGGGTGCTCCGGGTCCGCTGGGTATCGCTGGTATCACCGGTGCTCGTGGTCTGGCTGGTCCGCCGGGTATGCCGGGTCCGCGTGGTTCTCCGGGTCCGCAGGGTGTTAAAGGTGAATCTGGTAAACCGGGTGCTAACGGTCTGTCTGGTGAACGTGGTCCGCCGGGTCCGCAGCGTGGTGACGGTCCGTCTGGTCCGCCGGGTAAAGACGGTACCTCTGGTCACCCGGGTCCGATCGGTCCGCCGGGTCCGCGTGGTAACCGTGGTGAACGTGGTTCTGAAGGTTCTCCGGGTCACCCGGGTCAGCCGGGTCCGCCGGGTCCGCCGGGTGCTCCGGGTCCGTGCTGCGGTGGTGTTGGTGCTGCTGCTATCGCTGGTATCGGTGGTGAAAAAGCTGGTGGTTTCGCTCCGTACTACCACCACCACCACCACCAC(SEQ ID NO：4)。

(2)基因合成：

根据SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示核酸序列，由金斯瑞生物科技股份有限公司分别合成编码脯氨酸-4-羟化酶的核酸片段Hy726和编码重组人III型胶原蛋白片段的核酸片段1851。

实施例2表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1851的构建

通过以下步骤构建表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1851

(1)质粒pET30a+-1851的构建

将实施例1获得的核酸片段1851(SEQ ID NO:4)使用NdeI和XhoI双酶切，酶切体系如下：核酸片段1851 5μL(2μg)，NdeI和XhoI酶各1μL，缓冲液5μL，灭菌双蒸水补足50μL，37℃保温4小时。采用相同的体系酶切质粒PET30a+。采用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切得到的核酸片段1851和质粒PET30a+线性片段，使用T4连接酶对所得片段进行连接反应，连接体系如下：T4DNA连接酶1μL，核酸片段1851 3μL，质粒PET30a+线性片段2μL，连接缓冲液1μL，灭菌双蒸水补足10μL。16℃保温4小时。将保温后的连接产物，通过热激方法转化到宿主菌E.coli DH5α中，涂布到卡那霉素抗性平板，37℃保温过夜。随机挑取阳性克隆，在LB液体培养基中培养，37℃，220rpm培养过夜。采用质粒快速提取试剂盒提取，得到质粒pET30a+-1851。测序结果表明质粒pET30a+-1851中核酸片段1851的序列正确。

(2)质粒pACYCDeut 1-Hy726的构建

对实施例1获得的核酸片段Hy726(SEQ ID NO:2)使用Nco I和BamH I双酶切。酶切体系如下：核酸片段Hy726 5μL(2μg)，Nco I和BamH I酶各1μL，缓冲液5μL，灭菌双蒸水补足50μL，37℃保温4小时。采用相同的体系酶切质粒pACYCDeut 1。采用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切得到的核酸片段Hy726和质粒pACYCDeut 1线性片段。使用T4连接酶对所得片段进行连接反应，连接体系如下：T4DNA连接酶1μL，核酸片段Hy726 3μL，质粒pACYCDeut 1线性片段2μL，连接缓冲液1μL，灭菌双蒸水补足10μL。16℃保温4小时。将保温后的连接产物，通过热激方法转化到宿主菌E.coli DH5α中，涂布到氯霉素抗性平板，37℃保温过夜。随机挑取2个阳性克隆，分别在LB液体培养基中培养，37℃，220rpm培养过夜。采用质粒快速提取试剂盒提取，得到质粒pACYCDeut 1-Hy726。以Nco I和BamH I双酶切鉴定，如图1所示，这两个质粒都是正确重组子，测序结果表明pACYCDeut 1-Hy726中核酸片段Hy726的序列正确。

(3)pACYCDuet 1-Hy726-1851的构建

将步骤(1)制备的质粒pET30a+-1851和步骤(2)制备的质粒pACYCDuet 1-Hy726均以Nde I和Xho I双酶切，分别回收质粒pACYCDuet 1-Hy726(N-X)线性片段和核酸片段1851(N-X)，并通过连接酶进行连接，将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂布到氯霉素抗性平板，37℃保温过夜。挑取菌落并提取质粒，以Nde I和Xho I双酶切鉴定，结果如图2所示，酶切后片段大小(约4.7k bp和1.8k bp)符合预期，说明重组质粒pACYCDuet 1-Hy726-1851构建成功。

实施例3表达菌株BL21(DE3)/pACYCDuet 1-Hy726-1851的构建

表达菌株的构建参照《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克等著)中记载的方法，具体步骤如下：挑取大肠杆菌BL21(DE3)单菌落到LB试管接种后在37℃振荡过夜培养；在含50ml LB的三角瓶中加入0.5ml的过夜培养液，37℃剧烈振荡培养约2小时使菌体长到对数前期；无菌条件下将细菌转移到用冰预冷的50ml聚丙烯管中，冰上放置10分钟；4℃，4000rpm离心，倒出上清，将管倒置，使残余液尽量流出；加入6ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl₂重悬沉淀，放置冰上30分钟；4℃，3000rpm离心，倒出上清，将管倒置，使残余液尽量流出；加入1.2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬沉淀(若要制备于-70℃保存备用的感受态细胞，则加入含有20％甘油的0.1mol/L CaCl₂悬浮菌体)，4℃放置5～24小时后，吸取200μl感受态细胞悬液，加入实施例2制备的重组质粒pACYCDuet 1-Hy726-1851(体积<10μl,DNA<50ng)，轻轻混匀，冰上放置30分钟；42℃水浴静止热激90秒，立即放入冰上冷却；加入500μl液体LB培养液，混匀，放入37℃摇床低速摇动复苏45分钟(也可加LB后直接放入37℃水浴复苏1小时，中间振荡管子使细胞悬浮)；吸取转化的细胞涂布在加有抗生素(氯霉素)的平板上，放于37℃培养箱中倒置培养，生长出的菌落即为表达菌株BL21(DE3)/pACYCDuet 1-Hy726-1851。

实施例4表达菌株BL21(DE3)/pACYCDuet 1-Hy726-1851的诱导表达

挑取实施例3制备的表达菌株BL21(DE3)/pACYCDuet 1-Hy726-1851的单菌落于含50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃ 200r/min培养过夜后成为活化种子，再以2％的接种量接种到M9培养基中，细菌培养瓶装液量为50mL/250mL，23℃，200r/min培养14小时，加入终浓度为0.05mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，继续培养12小时，离心收集菌体。

其中M9培养基的配制方法如下：

(1)配制1M的MgSO₄:MgSO₄·7H₂O 2.46g加双蒸水10mL溶解，高压灭菌备用；

(2)配制1M的CaCl₂:CaCl₂·6H₂O 2.191g加双蒸水10mL溶解，高压灭菌备用；

(3)配制5×M9盐溶液：Na₂PO₄·7H₂O 12.8g；KH₂PO₄ 3.0g；NaCl 0.5g；NH₄Cl 1.0g；加双蒸水200mL溶解，121度灭菌15分钟；

(4)配制20％的葡萄糖溶液：4g葡萄糖加双蒸水20mL溶解，0.22微米滤器过滤除菌；

(5)无菌操作配制M9培养基：5×M9盐溶液200mL；1M的MgSO₄ 2mL；20％的葡萄糖溶液20mL；1M的CaCl₂ 0.1mL；加灭菌双蒸水至1000mL。

实施例5 SDS-PAGE蛋白电泳检测

样品处理：收集实施例4制备的菌体，加入loading buffer混合均匀，沸水浴10min，自然冷却，备用。选用金斯瑞SurePAGE^TM预制胶(4-12％)上样，在140V电压下电泳45-55分钟直至溴酚蓝条带跑到凝胶底部。

考马斯亮蓝R-250使用微波炉染色：1)配制染色液：在40％乙醇和10％醋酸溶液中溶解终浓度为0.1％(W/V)的考马斯亮蓝R250。2)配制脱色液：将终浓度为10％(V/V)乙醇、7.5％(V/V)醋酸溶解在一起。3)电泳完成后，撬开胶板取出凝胶，然后放入装有100ml染色液的染色容器中。4)盖上容器盖子并放入微波炉中用高热档位加热8分钟。为了避免危险，请注意不要让溶液沸腾。5)从微波炉中取出染色容器，放在脱色摇床上常温轻摇5分钟。6)倒掉染色液并用去离子水小心清洗凝胶。7)倒掉去离子水，并加入100ml脱色液。8)盖上盖子，放入微波炉中用高热档位加热8分钟。9)倒掉脱色液，加入新的脱色液，重复步骤8。10)从微波炉中取出，放在脱色摇床上常温轻轻震荡至背景清晰。

实验结果如图3所示，显示诱导后重组人III型胶原蛋白得到表达，分子量与预期一致(约72kD)，并且表达量较高。

实施例6 Western Blot验证

采用与实施例5相同的方法分别进行诱导前菌体和诱导后菌体的SDS-PAGE凝胶电泳，并利用所述SDS-PAGE凝胶进行Western Blot验证。

Western Blot步骤如下：

(1)使用eBlot快速湿转仪来进行蛋白转膜：

1)用剪刀剪出与转膜用海绵大小相仿的滤纸1张和PVDF膜1张，在PVDF膜一角用铅笔标记。

2)用甲醇活化PVDF膜后，再用转移缓冲液将滤纸和PVDF膜浸泡。

3)向托盘中加入转移缓冲液，放入海绵、PVDF膜、滤纸和转膜夹。

4)转膜夹的黑色板上先铺一块转膜用海绵，再铺滤纸和SDS-PAGE凝胶。对齐后用玻璃棒赶净气泡。

5)用微量移液器取少量转移缓冲液放在SDS-PAGE凝胶后铺上PVDF膜，再铺滤纸和转膜用海绵。对齐后用玻璃棒赶净气泡。

6)将转膜夹夹紧固定后，黑面对黑面放入转膜固定装置中。

7)将转膜固定装置和装有冰块的冰盒放在转膜槽中。用转移缓冲液注满转移槽。

8)接通电源，一般恒压100V-110V，1小时左右；小分子量的可以适当缩短时间；或者恒压30V，4℃转膜过夜；或者恒流300mA，1小时左右。

(2)封闭及抗体孵育：

1)关闭电源，打开转膜夹将PVDF膜取出，用双蒸水冲洗。

2)将PVDF膜放在封闭液中，摇床上37℃封闭1小时。

3)弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤，用一抗(小鼠抗His Tag单克隆抗体)工作液孵育，摇床上37℃孵育1小时。

4)弃去一抗工作液，用PBST缓冲液洗涤，用二抗(HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体)工作液孵育，摇床上37℃孵育1小时。

5)弃去二抗工作液，用PBST缓冲液洗涤。摇床上洗膜4次，每次5分钟。

(3)显影曝光：

1)用平板纸吸去膜上残余液体，将PVDF膜平放。

2)用微量移液器取等体积的ECL试剂中的A液和B液放在EP管中恢复至室温。

3)混合后均匀地加到膜上，避光反应30-60秒。

4)弃去ECL混合液置于暗盒中曝光显影，曝光时间控制在30秒左右。

实验结果如图4所示，对应于诱导后菌体的泳道在蛋白免疫印迹杂交后显示条带，证明诱导后表达的蛋白为重组人III型胶原蛋白，表明其在大肠杆菌中成功表达。

实施例7重组人III型胶原蛋白纯化

使用BeaverBeads^TMHis-tag Protein Purification磁珠纯化试剂盒进行重组人III型胶原蛋白的纯化，具体步骤如下：

(1)样品处理：将实施例4制备的菌体用适量的Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1mM的PMSF)，重悬细胞，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在粗样品中加入适量核酸酶，冰浴30min，以降解核酸。

(2)磁珠预处理：(a)将海狸磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取5mL磁珠悬液于15mL离心管中，进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管。(b)加入5mL Binding Buffer到上述装有磁珠的离心管中，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮；进行磁性分离，移去上清液。重复洗涤2次。

(3)目标蛋白与磁珠结合：(a)将步骤(1)制备的样品用10mL Binding Buffer悬浮，加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15s。(b)将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合20～30min(如果需要，可以在2～8℃的低温环境下，旋转混合1h，防止目标蛋白降解)。(c)将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液至新的离心管中以备后续检测，从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。

(4)磁珠洗涤：(a)加入10mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测。重复此步骤1次。(b)加入10mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管(避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白)，磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。

(5)目标蛋白洗脱：加入2-10mL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，得到包含重组人III型胶原蛋白的溶液。

实施例8重组人III型胶原蛋白的稳定性比较

将实施例2制备的质粒pET30a+-1851按照实施例3的方法构建表达菌株BL21(DE3)/pET30a+-1851，按照实施例4的方法进行诱导表达，并按照实施例7的方法进行纯化，制备得到包含未羟基化重组人III型胶原蛋白的溶液。将相同浓度的所述包含未羟基化重组人III型胶原蛋白的溶液和实施例7制备的包含重组人III型胶原蛋白的溶液在60℃放置4h后，通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的稳定性，如图5所示，结果表明，未羟基化重组人III型胶原蛋白降解明显，而实施例7制备的羟基化重组人III型胶原蛋白未显示降解，说明其稳定性得到了显著提高。

实施例9止血海绵的制备

将实施例7制备的包含重组人III型胶原蛋白的溶液通过BCA法测定蛋白浓度，并用纯化水稀释到浓度为1％(w/v)，然后再加入40mM的EDC和20mM的NHS，在室温下反应24h后加入模具中，在-40℃预冻，并在-40℃保持1小时以上，然后真空干燥。将冷冻干燥的海绵在纯化水中清洗三次，然后再按上述方法将海绵冻干，制备得到止血海绵。

实施例10细胞毒性测定

依据《GB/T 16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验》，用体外细胞培养的方法对实施例9制备的止血海绵的毒理学风险进行评价，采用MTT法进行试验。止血海绵浸提液浸提比例参照《GB/T16886.12-2017医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品》表1标准表面积与浸提液体积中厚度大于1mm样品，浸提比例为1.25cm²/mL的比例来浸提，浸提介质为含10％血清的细胞培养基，浸提温度为(37±1)℃，浸提时间为(24±2)h。

实验分为样品组(实施例9制备的止血海绵的浸提液)、阳性对照组(ZDECPolyurethane Film的浸提液)、阴性对照组(High Density Polyethylene Film的浸提液)、介质对照组(含10％血清的细胞培养基，置于37±1℃，24±2h)四组。将L929细胞在各组所述的浸提液或细胞培养基中培养，在阴性对照组和阳性对照组符合要求的情况下，计算细胞相对增殖率。实验结果显示，与介质对照组比较，样品组中L929细胞的相对增殖率为135％，细胞毒性反应分级为0级，说明本发明的止血海绵不具有细胞毒性。

实施例11皮内反应测定

依据《GB/T 16886.10-2017医疗器械生物学评价第10部分:刺激与迟发超敏反应试验》，对实施例9制备的止血海绵进行皮内反应试验，以评价试验样品潜在的刺激反应。用0.9％氯化钠注射液和棉籽油两种极性不同的浸提介质对实施例9制备的止血海绵进行浸提，参照《GB/T16886.12-2017医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品》表1标准表面积与浸提液体积中厚度大于1mm样品，浸提比例为1.25cm²/mL，浸提温度为(37±1)℃，浸提时间为(72±2)h。

在家兔脊椎两侧皮内分别注射样品液(0.9％氯化钠注射液或棉籽油的止血海绵浸提液)及对照液(0.9％氯化钠注射液或棉籽油)，于注射后(24±2)h、(48±2)h、(72±2)h，对注射部位红斑和水肿进行评分，结果无红斑、无水肿，样品液和对照液的皮内反应平均记分之差为0，均不大于1，说明本发明的止血海绵不具有皮内刺激性。

实施例12迟发型超敏反应测定

依据《GB/T 16886.10-2017医疗器械生物学评价第10部分:刺激与迟发超敏反应试验》，对实施例9制备的止血海绵进行迟发型超敏反应最大剂量试验，以评价试验样品潜在的致敏危害。用0.9％氯化钠注射液和棉籽油两种极性不同的浸提介质对实施例9制备的止血海绵进行浸提，参照GB/T16886.12-2017《医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品》表1标准表面积与浸提液体积中厚度大于1mm样品，浸提比例为1.25cm²/mL，浸提温度为(37±1)℃，浸提时间为(72±2)h。

将样品液(0.9％氯化钠注射液或棉籽油的止血海绵浸提液)及对照液(0.9％氯化钠注射液或棉籽油)分别封闭固定于豚鼠背部以诱导皮肤致敏反应，诱导期结束后对豚鼠背部诱导部位进行激发，并观察实验结果。在整个实验过程中，施用样品液和对照液的动物均未见异常表现，激发后敷贴试验反应等级为0级，小于1级，说明本发明的止血海绵无皮肤致敏反应。

实施例13动物模型肝脏止血测定

(1)实验方法

将18只实验用小型猪(巴马香猪)分为3组(每组6只)，分别对应样品组(实施例9制备的止血海绵)，纱布对照组(医用纱布，购自南昌市爱益卫生材料有限公司)和上市产品对照组(医用胶原蛋白止血海绵)。将每只动物肝脏用手术刀划出长约2cm，深2～3mm的伤口(伤口部位在距肝脏边缘约3cm处)，建立肝脏出血模型，分别将各组的样品按压于伤口表面，进行止血有效性研究。

(2)评价指标

手术当日记录止血时间和出血量；术后8周采用安乐死方法处死动物，进行大体病理检查及肝脏创面的组织病理学检查。

(3)实验结果

(a)止血时间和出血量

实验结果见表1和表2。

表1样品组和上市产品对照组止血时间和出血量统计

表2样品组和纱布对照组止血时间和出血量统计

注：*表示有统计学差异(p＜0.05)

样品组在150s内均能有效止血，最大值为150s，最小值为60s；上市产品对照组止血时间最大值为420s，最小值为180s；纱布对照组止血时间最小值为360s，最大值超过10min。样品组的止血时间明显短于上市产品对照组和纱布对照组，存在显著的统计学差异(P＜0.05)。

样品组出血量最大值为6.119g，最小值为0.123g；上市产品对照组出血量最大值为16.065g，最小值为4.802g；纱布对照组出血量最大值28.192g，最小值为3.801g。样品组的出血量明显小于上市产品对照组和纱布对照组，存在显著的统计学差异(P＜0.05)。

根据上述止血时间和出血量的比较结果，本发明的止血海绵对肝脏的止血效果显著优于市售医用胶原蛋白止血海绵和医用纱布。

(b)大体病理检查和肝脏创面的组织病理学检查

实验期间所有动物无死亡，亦无异常反应。术后8周采用安乐死方法处死动物，进行大体病理检查和肝脏创面的组织病理学检查，如图6所示，在样品组、上市产品对照组动物和纱布对照组的动物大体观察中，腹腔内均未见积液、血块；样品组偶见轻微组织粘连，上市产品对照组和纱布对照组偶见肝脏组织与腹壁粘连，说明本发明的止血海绵具有良好的组织相容性。

实验例14动物模型股动脉和颈静脉止血测定

(1)实验方法

将18只实验用小型猪(巴马香猪)分为3组(每组6只)，分别对应样品组(实施例9制备的止血海绵)，纱布对照组(医用纱布，购自南昌市爱益卫生材料有限公司)和上市产品对照组(医用胶原蛋白止血海绵)。分别暴露股动脉和颈静脉，横切股动脉和颈静脉做一个长度为1cm的切口，用5-0缝合线缝合切口，均匀缝合4针，松开动脉夹让其自由出血2s，建立股动脉/颈静脉出血模型，分别将各组的样品按压于切口表面，进行止血有效性研究。

(2)评价指标

手术当日记录止血时间和出血量。

(3)实验结果

(a)股动脉止血测定结果

实验结果见表3和表4，其中样品组的止血时间明显短于上市产品对照组和纱布对照组，存在显著的统计学差异(P＜0.05)；样品组的出血量明显小于上市产品对照组和纱布对照组，存在显著的统计学差异(P＜0.05)。以上结果说明本发明的止血海绵对股动脉的止血效果显著优于市售医用胶原蛋白止血海绵和医用纱布。

表3样品组和上市产品对照组止血时间和出血量统计

表4样品组和纱布对照组止血时间和出血量统计

注：*表示有统计学差异(p＜0.05)

(b)颈静脉止血测定结果

实验结果见表5和表6，其中样品组的止血时间明显短于上市产品对照组和纱布对照组，存在显著的统计学差异(P＜0.05)；样品组的出血量明显小于上市产品对照组和纱布对照组，存在显著的统计学差异(P＜0.05)。以上结果说明本发明的止血海绵对颈静脉的止血效果显著优于市售医用胶原蛋白止血海绵和医用纱布。

表5样品组和上市产品对照组止血时间和出血量统计

注：*表示有统计学差异(p＜0.05)

表6样品组和纱布对照组止血时间和出血量统计

注：*表示有统计学差异(p＜0.05)

由上述实施例可以看出，利用本发明的重组人III型胶原蛋白制备的止血海绵的止血性能明显优于市售医用胶原蛋白止血海绵和医用纱布，同时对小型猪的大体解剖和组织病理学的检查表明所述止血海绵在动物体内的应用是安全的，没有过敏、感染、血肿、凝血障碍、伤口愈合时间延长、伤口裂开等并发症。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种重组人III型胶原蛋白片段，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种编码如权利要求1所述的重组人III型胶原蛋白片段的核酸片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸片段和编码脯氨酸-4-羟化酶的核酸片段。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述编码脯氨酸-4-羟化酶的核酸片段具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的制备步骤如下：

(1)基因设计和合成：

根据如SEQ ID NO:3所示的重组人III型胶原蛋白片段的氨基酸序列和如SEQ ID NO:1所示的巨型病毒脯氨酸-4-羟化酶的氨基酸序列，反向设计编码核酸序列，并进行密码子优化，得到编码重组人III型胶原蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO:4和编码脯氨酸-4-羟化酶的核苷酸序列SEQ ID NO:2，然后进行全基因合成，得到编码所述重组人III型胶原蛋白片段的核酸片段1851和编码所述脯氨酸-4-羟化酶的核酸片段Hy726；

(2)表达载体的构建：

a)将所述核酸片段1851插入到pET30a+的酶切位点NdeI和XhoI之间并转化宿主菌，挑取阳性克隆，提取质粒，得到pET30a+-1851；

b)将所述核酸片段Hy726插入到pACYCDeut 1的酶切位点Nco I和BamH I之间并转化宿主菌，挑取阳性克隆，提取质粒，得到pACYCDeut 1-Hy726；

c)将pET30a+-1851和pACYCDeut 1-Hy726分别用Nde I和Xho I双酶切，回收载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X)和核酸片段1851(N-X)，并通过连接酶连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，得到表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1851。

6.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求3-5中任一项所述的表达载体。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.一种制备重组人III型胶原蛋白的方法，其特征在于，在培养基中培养如权利要求6或7所述的宿主细胞，诱导表达后进行蛋白纯化，获得重组人III型胶原蛋白。

9.一种利用权利要求8所述的方法制备的重组人III型胶原蛋白。

10.如权利要求9所述的重组人III型胶原蛋白用于制备止血材料的用途。

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