CN112851617B - 一种牡丹花黄酮干粉的提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，摘取牡丹花瓣进行微波两次杀青，快速灭活牡丹花瓣中的酶，更多的保存了黄酮的抗氧化成分；同时除去牡丹花瓣内的部分水分，防止牡丹花瓣堆放时由于呼吸作用产生热量而腐化，同时微波杀青后的牡丹花瓣再清洗仅表面挂水而不吸水，缩短后续的干燥时间。低温干燥充分保护牡丹花瓣中的有效成分；采用微波预萃取牡丹花干粉水混合液，充分利用了微波对水分子的选择性作用，将溶于水的黄酮先一步萃取，超声的进一步萃取充分利用了超声的空化作用，迅速打开细胞壁，从而实现低温快速萃取，缩短了萃取时间，提高了萃取效率。
Description
技术领域
本发明属于生物与食品技术领域，具体涉及一种牡丹花黄酮干粉的提取方法。
背景技术
黄酮是一类化合物的总称，广泛存在自然界的植物和浆果中，总数大约有4千多种，其分子结构不尽相同。黄酮的功效也是多方面的，它是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，可以阻止细胞的退化、衰老，也可阻止癌症的发生；还可以改善血液循环，可以降低胆固醇，降低血糖等作用。
黄酮也是花的重要活性成分，‘丹凤’牡丹花在2013年被卫生部批准为新食品原料，以其为原料，使用水提和醇提得到的黄酮粉，可以直接用于食品(包括普通食品和保健食品)或者其他领域(比如化妆品)中的添加。中国科学院也曾采用化学测定，其测定结果表明，牡丹花瓣、花蕊和花粉中含有8种人体必需的氨基酸以及多种维生素、糖类和黄酮类物质，因此提取牡丹花黄酮，具有十分重要的意义。
目前市场上已有一些牡丹花黄酮的提取方法，提取过程复杂，提取时间长、效率低，提取过程中有益成分流失严重的现象。
发明内容
本发明的目的在于解决现有问题，提供一种操作简单，提取时间短，提取效率高的牡丹花黄酮干粉提取方法。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案，步骤如下：
步骤一、筛选：选用去除花萼和花蕊的牡丹花瓣。
步骤二、杀青：将牡丹花瓣进行微波杀青，微波杀青是短时间内升温至活性酶钝化的温度，从而灭活牡丹花瓣中的酶。因为有些酶是氧化酶，而在后续过程中氧化酶会破坏玫瑰花瓣中的黄酮化合物，减少黄酮等活性成分的有效传递。
步骤三、花粉干制：将杀青后的牡丹花瓣清洗后进行甩干，40-50℃低温热风干燥4-6h，低温热风干燥为风机循环送风，干燥均匀高效。然后粉碎至40目，得到牡丹花干粉(其总黄酮含量数值实际上为超声萃取物得率数值，8.79％-9.21％)。
步骤四、黄酮萃取：将牡丹花干粉和水混合并进行微波萃取得到微波萃取物，微波所产生的电磁场可加速被萃取组分的分子由固体内部向固液界面扩散的速率，加热均匀，热效率较高，而且无热惯性，过程易于控制，微波萃取物总黄酮得率为3.373％-4.23％。然后在冷却后的微波萃取物中加入无水乙醇并进行超声萃取得到超声萃取物；超声波对液体介质产生强烈空化效应、机械振动、扰动效应，加快物质分子运动频率和速度。
步骤五、过滤：将超声萃取物倒在放置有助滤剂的滤膜上，过滤或抽滤得到滤液，测定超声萃取物总黄酮得率为8.79％-9.21％。
步骤六、黄酮初提：将滤液浓缩干燥得到干燥提取物，加入乙醇溶液，同时升温至回流，保持温度，补加乙醇直至基本溶解，趁热过滤，滤液放置冷却，析出固体后过滤；将析出固体重复溶解、加热、过滤、冷却、过滤步骤得到初提物，总黄酮含量17.1-25.8％。
步骤七、黄酮精提：将初提物溶解至90％的乙醇中配置成浓度为1.5mg/ml的预提纯溶液，使用树脂提纯，使用90％的乙醇溶液进行3次洗脱纯化得到洗脱液，将洗脱液浓缩干燥，得到含黄酮65.5％-72.7％的牡丹花黄酮干粉。
进一步地，步骤(二)中，微波杀青为两次，分别为微波一次杀青和微波二次杀青；微波一次杀青功率为800-1000W，时间为15s；微波二次杀青功率为300-500W，时间为40s。
优选地，步骤(二)中，所述微波杀青为两次，分别为微波一次杀青和微波二次杀青；所述微波一次杀青功率为900W，时间为15s；所述微波二次杀青功率为400W，时间为40s。
进一步地，步骤(三)中，低温干燥温度为40-50℃，干燥时间为4-6h。
进一步地，步骤)(四)中，牡丹花干粉、水、无水乙醇比例为1:(10-20):(40-50)；其中牡丹花干粉以克计，水和无水乙醇以毫升计。
优选地，步骤(四)中牡丹花干粉、水、无水乙醇比例为1:15:45；其中牡丹花干粉以克计，水和无水乙醇以毫升计。
进一步地，步骤(四)中，萃取中的微波功率500-700W，微波萃取时间20-40s，超声功率200-300W，超声频率20KHz，超声萃取时间5min，超声萃取时保持温度50-60℃。
进一步地，步骤(五)中，助滤剂采用以下方法制得：将60目的柱层析硅胶和粒径21.8um的硅藻土按照质量比1:15研磨混合均匀，然后用70％乙醇溶液浸泡10h以上，100-120℃烘干制成。
进一步地，步骤(六)中，乙醇溶液的浓度为80％。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)牡丹花瓣经过两次微波杀青，首先，大功率快速升温至较高温度灭活大部分酶；然后，小功率相对长时间灭活剩余部分酶，更多的保存了黄酮的抗氧化成分；其次除去部分牡丹花瓣内部水分，防止牡丹花瓣堆放时由于呼吸作用产生热量而腐化，且清洗微波杀青后的牡丹花瓣时仅表面挂水而不吸水，缩短后续的干燥时间。
(2)清洗后的牡丹花瓣进行低温热风干燥不仅形状、色泽较好，而且相比高温热风干燥、真空冷冻干燥其黄酮含量最高，香气更加适宜。
(3)本申请充分利用了微波选择性好、加热均匀、热效率高的作用，快速萃取出溶于水的黄酮，同时利用微波无热惯性的特点，避免了后续加入乙醇的挥发；再进一步利用了超声的空化效应进行萃取，能迅速打开细胞壁，同时加快分子运动频率和速度，从而实现低温快速的萃取，缩短了萃取时间，提高了萃取效率。
(4)在本申请的提纯步骤中：
a.过滤阶段，采用本申请制备的助滤剂，第一，避免堵塞过滤时使用的滤膜或者滤纸，并有效实现“固液”分离，提高过滤效率；第二，对一些有机盐和无机盐类实现大部分的分离和去除；第三，对一些较大分子和极性与黄酮类差别较大的物质，实现部分分离和去除(阻滞在助滤剂形成的助滤层中)，总体而言，助滤剂的使用有效提高了过滤效果，并为之后的初提和精提提供了更高质量的“原料”。
b.初提时采用类“重结晶”的原理，初提的效率较高，操作更方便，非常适宜于工业生产牡丹花黄酮粗品，该粗品可根据不同产品的需求，进行其他产品的生产(比如直接添加)。
c.采用先初提的方式，一是可以间接生产初提物作为产品，二是对精提提供更优质的原料，提高精提的效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法具体包括如下步骤：
步骤一、筛选：采摘‘丹凤’牡丹花，除去花萼和花蕊，选取‘丹凤’牡丹花瓣备用。
步骤二、杀青：把筛选好的‘丹凤’牡丹花瓣均匀平铺在两层的盛物架上，平铺厚度为2-3cm，将铺好‘丹凤’牡丹花瓣的盛物架放入非旋转底盘式的微波炉内，设定微波功率900W，进行微波一次杀青15s；然后调整微波功率为400W，进行微波二次杀青40s，取出备用。
步骤三、花粉干制：将杀青后的‘丹凤’牡丹花瓣放入清水中清洗，然后将清洗后的‘丹凤’牡丹花瓣用软布包起来甩干，放入已经恒温50℃的热风烘箱内干燥5h，取出干燥好的‘丹凤’牡丹花瓣粉碎至过40目，得到‘丹凤’牡丹花干粉，水分含量3％为干燥目标。
步骤四、黄酮萃取：取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入150ml水，先进行微波萃取，微波功率600W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入450ml的无水乙醇，用频率20KHz功率250W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃。
步骤五、过滤：首先制作助滤剂，将60目的柱层析硅胶和粒径21.8um的硅藻土按照质量比1:15研磨混合均匀，然后用70％乙醇溶液浸泡10h以上，最后放入烘箱保持120℃烘干制成助滤剂。然后将助滤剂均匀的放置在0.45um的滤膜上，助滤剂放置厚度最少达到10cm，然后将超声萃取物倒在助滤剂上，进行过滤或者抽滤，得到滤液。滤液以芦丁为标准品，检测黄酮含量，得率为9.21％。
步骤六、黄酮初提：将滤液浓缩至干燥固体，在干燥固体中加入20ml80％乙醇溶液，同时加热升温至回流，保持回流状态温度，补加80％乙醇溶液至基本溶解，趁热过滤，滤液放置冷却，析出固体后过滤；将析出固体重复溶解、加热、过滤、冷却、过滤步骤得到初提物，其中总黄酮含量为25.8％。
步骤七、黄酮精提：将初提物溶解至90％的乙醇中配置成浓度为1.5mg/ml的预提纯溶液，用聚酰胺大孔树脂提纯，然后用90％的乙醇溶液进行3次洗脱纯化得到洗脱液，将洗脱液浓缩干燥，得到含黄酮72.7％的‘丹凤’牡丹花黄酮干粉。
实施例2
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(四)中，取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入100ml水，先进行微波萃取，微波功率600W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入450ml的无水乙醇，用频率20KHz功率250W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃,其余步骤与实施例1相同。
实施例3
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(四)中，取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入200ml水，先进行微波萃取，微波功率600W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入450ml的无水乙醇，用频率20KHz功率250W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃,其余步骤与实施例1相同。
实施例4
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(四)中，取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入100ml水，先进行微波萃取，微波功率600W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入400ml的无水乙醇，用频率20KHz功率250W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃,其余步骤与实施例1相同。
实施例5
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(四)中，取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入100ml水，先进行微波萃取，微波功率600W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入500ml的无水乙醇，用频率20KHz功率250W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃,其余步骤与实施例1相同。
为了比较步骤(四)中，牡丹花干粉、水、无水乙醇之间的比例关系，在不同比例时，我们对微波萃取物黄酮得率、超声萃取物黄酮得率、初提物总黄酮含量、牡丹花黄酮干粉黄酮含量进行对比评价。
表1牡丹花干粉、水、无水乙醇不同比例时对各项指标影响的比较
1、步骤(四)中有水提取和水醇溶液提取两个步骤，水和水醇溶液都是作为溶剂进行提取，由表1可知，在用量达到适宜量的时候，提取得率最大，在此基础上，减少用量，会降低得率，若继续增加用量，黄酮溶解达到极限，而其他物质的溶出增加，反而影响到黄酮的溶出，所以继续增加用量不仅不能增加得率，反而会降低，上述数据也符合该一般规律。
2、步骤(四)分为水提取和水醇溶液提取，是为了最大限度提高提取得率。但从步骤上，在调节水醇比的时候，存在一个适宜的中介比例点，该比例点的极性与牡丹花黄酮物质的极性接近，所以在该极性条件下，对黄酮的溶出更有利。因此，在极性低于或高于此比例点(1:15:45)的时候，黄酮的得率都会相应降低。
实施例6
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(二)中,设定微波功率900W，进行微波一次杀青15s；然后调整微波功率为300W，进行微波二次杀青40s，其余步骤与实施例1相同。
实施例7
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(二)中,设定微波功率900W，进行微波一次杀青15s；然后调整微波功率为500W，进行微波二次杀青40s，其余步骤与实施例1相同。
实施例8
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(二)中,设定微波功率800W，进行微波一次杀青15s；然后调整微波功率为400W，进行微波二次杀青40s，其余步骤与实施例1相同。
实施例9
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(二)中,设定微波功率1000W，进行微波一次杀青15s；然后调整微波功率为400W，进行微波二次杀青40s，其余步骤与实施例1相同。
为了比较步骤(二)中，微波杀青的功率的不同对牡丹花瓣杀青处理的影响，我们对杀青后牡丹花瓣的外观、失水率、干燥时间以及牡丹花黄酮干粉黄酮含量进行对比评价。
表2不同功率微波杀青对各项指标影响的比较
由表2可见：
第一次杀青采取大功率短时间，其作用为酶灭活为主，失水其次；第二次杀青采取较小功率较长时间，失水为主杀青为次，这样操作的好处是：在短时间内利用大功率把大部分氧化酶灭活，而且对黄酮等有益成分的损耗较小。实施例1的杀青效果最好，失水率不是最好，在小于900W的时候，灭活和杀青效果减小，最后牡丹花黄酮干粉黄酮含量降低；在大于900W的时候由于功率过大，部分黄酮活性物被破坏，导致黄酮的传递率下降，最后牡丹花黄酮干粉黄酮含量也降低，因此实施例1最后牡丹花黄酮干粉黄酮含量最高。第二次杀青对内是少量剩余未灭活的酶，对外主要的效果体现在失水率上，在相同的时间内，功率越大失水率越高，第一次杀青也有部分失水率的贡献，花瓣外观皱不皱跟失水率有关，失水率越高，变皱的程度提高。同时，失水率的高低，与之后低温热风干燥的处理时间相关，失水率越高，后续干燥时间越短。
实施例10
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(三)中采用高温热风干燥，条件为95℃，5h，其余步骤与实施例1相同。
实施例11
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(三)中采用真空冷冻干燥5h，其余步骤与实施例1相同。
为了比较步骤(三)中，不同干燥方式在相同的干燥时间下，对提取黄酮的影响，我们对干燥后的牡丹花干粉的水分含量、色泽、气味口感以及牡丹花黄酮干粉的黄酮含量进行对比评价。
表3不同烘干方式烘干对各项指标的影响比较
由表(3)可见：在相同的干燥时间条件下，相对于低温热风干燥：
1、高温热风干燥同时具有高温和风干的条件，干燥后的牡丹花干粉水分含量更低；但高温导致一部分黄酮类化合物的损失，和其他不耐高温的色素等活性物的氧化，从而对应的牡丹花黄酮干粉的黄酮含量较低，同时干燥后的牡丹花干粉明显泛黄。
2、真空冷冻干燥对不耐高温的黄酮类和其他活性物质的损失较少，传递效果较好，牡丹花干粉的颜色最浅；干燥后的牡丹花干粉水分含量较高，干燥效果属于三者中最差，牡丹花黄酮干粉的黄酮含量比低温热风干燥略低，但高于高温热风干燥。
3.从气味口感来看，高温热风干燥除了自身香气有所保留外，由于高温产生类“焦糊化”现象，产生了一种“焦香味”，使得香味变浓，香气不自然不协调。但是真空冷冻干燥水分含量较高，香味变淡，低温热风烘干香味自然，香气纯正。
综上所述，清洗后的‘丹凤’牡丹花瓣进行低温热风干燥不仅形状完好、色泽较好，香气清新自然，口感纯正，而且相比高温热风干燥、真空冷冻干燥，低温热风干燥设备成本最低，得到牡丹花黄酮干粉的黄酮含量最高。
实施例12
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(四)中，取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入150ml水，先进行微波萃取，微波功率500W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入450ml的无水乙醇，用频率20KHz功率250W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃，其余步骤与实施例1相同。
实施例13
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(四)中，取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入150ml水，先进行微波萃取，微波功率700W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入450ml的无水乙醇，用频率20KHz功率250W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃，其余步骤与实施例1相同。
实施例14
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(四)中，取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入150ml水，先进行微波萃取，微波功率600W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入450ml的无水乙醇，用频率20KHz功率200W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃，其余步骤与实施例1相同。
实施例15
一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，与实施例1的区别之处在于，步骤(四)中，取10g‘丹凤’牡丹花干粉，加入150ml水，先进行微波萃取，微波功率600W萃取30s得到微波萃取物；然后在冷却后的微波萃取物中加入450ml的无水乙醇，用频率20KHz功率300W的超声萃取5min得到超声萃取物，超声萃取过程保持萃取物温度55℃，其余步骤与实施例1相同。
为了比较步骤(四)中，微波和超声在不同功率下萃取对萃取结果的影响，我们对微波萃取物黄酮含量、超声萃取物黄酮含量进行对比评价。
表4不同功率下的微波萃取和超声萃取，对各阶段黄酮含量的影响比较
由表(4)可见，对于微波萃取过程，在功率小于600W时，对水相的加热效率减小，水温要降低，对黄酮的提取效率降低，因而微波萃取物的黄酮得率降低，所以实施例12较实施例1的微波萃取物黄酮得率降低；当微波功率大于600W时，水温升温幅度较大，黄酮以外的物质进一步溶出，从而影响了黄酮的溶出，实施例13较实施例1微波萃取物黄酮的含量略微降低。微波功率等于600W时微波萃取物黄酮的含量基本较高。
对于超声提取，在超声功率小于250W时，随着功率的减小，超声波破壁的效果降低，黄酮的溶出量相应减小，因此，实施例14超声萃取物黄酮得率比实施例1小。在功率超过250W时，黄酮以外的分子扩散速率大幅提高，影响了黄酮的扩散速率，导致得率的下降，因此，实施例15超声萃取物黄酮得率比实施例1小。
Claims (7)
1.一种牡丹花黄酮干粉的提取方法，其特征在于，所述的提取方法步骤如下：
步骤一、筛选：选用去除花萼和花蕊的牡丹花瓣；
步骤二、杀青：将牡丹花瓣进行微波杀青；所述微波杀青为两次，分别为微波一次杀青和微波二次杀青；微波一次杀青功率为800-1000W，时间为15s；微波二次杀青功率为300-500W，时间为40s；
步骤三、花粉干制：将微波杀青后的牡丹花瓣清洗后进行甩干、低温热风干燥，粉碎至40目，得到牡丹花干粉；所述低温热风干燥温度为40-50℃，干燥时间为4-6h；
步骤四、黄酮萃取：将牡丹花干粉和水混合并进行微波萃取得到微波萃取物，在冷却后的微波萃取物中加入无水乙醇并进行超声萃取得到超声萃取物；
步骤五、过滤：将超声萃取物倒在放置有助滤剂的滤膜上，过滤或抽滤得到滤液；
步骤六、黄酮初提：将滤液浓缩干燥得到干燥提取物，加入乙醇溶液，同时升温至回流，保持温度，补加乙醇直至基本溶解，趁热过滤，滤液放置冷却，析出固体后过滤；将析出固体重复溶解、加热、过滤、冷却、过滤步骤得到初提物；
步骤七、黄酮精提：将初提物溶解至90%的乙醇中配置成浓度为1.5mg/ml的预提纯溶液，使用树脂提纯，使用90%的乙醇溶液进行3次洗脱纯化得到洗脱液，将洗脱液浓缩干燥，得到牡丹花黄酮干粉。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（二）中，所述微波杀青为两次，分别为微波一次杀青和微波二次杀青；所述微波一次杀青功率为900W，时间为15s；所述微波二次杀青功率为400W，时间为40s。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤）（四）中，牡丹花干粉、水、无水乙醇比例为1:（10-20）:（40-50）；其中牡丹花干粉以克计，水和无水乙醇以毫升计。
4.如权利要求3所述提取方法，其特征在于，步骤（四）中牡丹花干粉、水、无水乙醇比例为1:15:45；其中牡丹花干粉以克计，水和无水乙醇以毫升计。
5.如权利要求3或4所述提取方法，其特征在于，步骤（四）所述萃取中的微波功率600W，微波萃取时间30s，超声功率250W，超声频率20KHz，超声萃取时间5min，超声萃取时保持温度55℃。
6.如权利要求1所述提取方法，其特征在于，步骤（五）所述助滤剂采用以下方法制得：将60目的柱层析硅胶和粒径21.8um的硅藻土按照质量比1:15研磨混合均匀，然后用70%乙醇溶液浸泡10h以上，100-120℃烘干制成。
7.如权利要求1所述提取方法，其特征在于，步骤（六）中，所述乙醇溶液的浓度为80%。
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