CN112843035B - 一种药物及用途和其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种药物，包括如下物质作为活性成分：3‑溴丙酮酸或其药学上可接受的盐和/或CPI‑613或其药学上可接受的盐。本发明还提供该药物在制备具有抗病毒活性的药物中的用途。本发明进一步提供一种3‑溴丙酮酸和CPI‑613药物联用的复合纳米颗粒剂，本发明还提供该药物联用的复合纳米颗粒剂的制备方法。该药物在单独使用时具有抗病毒活性，两药联合使用具有协同效应，联用时，其抗病毒活性可达到1+1＞2的技术效果；该药物联用用使用复合纳米颗粒剂剂型，药物相容性好，抗病毒活性高；该复合纳米颗粒的制备方法简单易操作，所得复合纳米颗粒剂的两个活性药物成分均匀地包载于PLGA纳米粒中。

Description

一种药物及用途和其制备方法
技术领域
本发明专利属于纳米药物技术领域，具体是指一种药物及用途和其制备方法。
背景技术
病毒及其衍生物对易感细胞的侵袭和免疫病理作用是导致正常细胞病变的主要原因。多年来，核苷类抗病毒药物的持续使用导致了耐药病毒株的出现，该类药物严重的毒副作用也限制了其临床应用。抗病毒药物的作用主要通过抑制病毒繁殖而实现，不能破坏病毒本身，否则也会对宿主细胞造成损伤，目前应用于临床的有效抗病毒药物的数量相对较少，这些都是此类药物发展缓慢的原因。
近年来，在防治病毒性疾病的药物研究方面虽然取得了一些进展，找到了治疗疽疹性角膜炎和预防甲型流行性感冒的药物，但寻找有效的抗病毒药物仍是当前的一项艰巨任务，还必需在理论和实践上继续深入探讨。
目前阻断细胞能量代谢的治疗研究已成为美欧和日本等国的研究热点，其中，3-溴丙酮酸是一种小分子量烷化剂，易溶于水，主要作用的靶蛋白有GADPH和HK-Ⅱ(己糖激酶(HK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)是糖酵解的关键酶)；3-溴丙酮酸对GADPH和HK-Ⅱ具有极强的亲和力，极低浓度条件下即可完全阻断GADPH和HK-Ⅱ活性。体内外研究结果均表明其具有极强的抑制代谢的能力；国外研究同时证实：3-溴丙酮酸对肿瘤干细胞也有杀伤作用，且能逆转肿瘤细胞对某些药物的多耐药性。
然而，3-溴丙酮酸由于其自身的结构性能导致其体内全身给药受首过效应影响较大，且在含水环境中半衰期较短。实验中我们也发现3-溴丙酮酸液体状态时不稳定，易分解，很容易失效。每次使用都必须新鲜配制。
另一方面，肿瘤细胞线粒体三羧酸循环代谢阻断剂CPI-613经过三年的研究后于2013年已进入临床，并且在II期临床实验尚未完成时被美国FDA特批为孤儿药，为广谱性抗肿瘤药，其适应症包括实体瘤和血液系统肿瘤，期药理机制为：CPI-613结构与维生素B1类似，进入细胞线粒体后磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)E1α，磷酸化后的PDH失活并阻断丙酮酸或脂肪代谢起源的乙酰辅酶A代谢，阻断其能量产生，CPI-613同时也能抑制酮戊二酸脱氢酶复合物(KGDH)，阻断谷氨酰胺回补途径――即阻断谷氨酰胺进入肿瘤细胞代谢产能。
然而，CPI-613呈脂溶性，易溶于有机溶剂，难溶于水，所以在使用过程中很难将其完全溶解，只能在有机溶剂中溶解后再进一步稀释用。
因此，有必要研究3-溴丙酮酸和CPI-613的新用途，改变3-溴丙酮酸和CPI-613的剂型和使用方式。
发明内容
随着纳米技术的开发与研究进展的不断提升，凭借着纳米粒子的小尺寸效应和表面效应，运用纳米技术治疗疾病，越来越受到人们的重视。其中研究最为广泛的为纳米粒子对肿瘤的治疗。尤其利用PLGA纳米颗粒作为运输药物的载体研究最为广泛。它具有良好生物相容性，在体内容易降解等优良特性。随后研究工作者们也渐渐将其应用于预防及治疗病毒感染方面的研究。例如，利用纳米药物来运载抗病毒药物，改善药物运输工具的耐受性。研究工作者们还发现某些纳米颗粒具有直接干扰和通过多价机制抑制病毒复制或直接阻断病毒装配过程；纳米粒子也被用于构建运载小干扰RNAs(siRNA)的非病毒递送系统，从而沉默在细胞系中的基因表达等。
基于背景技术的阐述，说明3-溴丙酮酸和CPI-613这两种药物均可以阻断肿瘤的细胞代谢，然而，迄今为止，还没有过将3-溴丙酮酸和CPI-613两种药物用于抗肿瘤以外的其他用途，也未将3-溴丙酮酸和CPI-613两种药物联合使用，来达到抗病毒效果的相关研究，更没有学者提出制备载3-溴丙酮酸和CPI-613药物纳米粒抗病毒的研究方案。
本研究将肿瘤葡萄酵解特异性能量阻滞剂3-溴丙酮酸、线粒体有氧氧化特异性阻断剂CPI-613和纳米递药系统相结合，制备出了一种新型复合纳米粒子，并探究其抗病毒特性。期望开发出一种创新型的抗病毒纳米平台，可能具有良好的创新性、广阔的科学研究和临床应用前景。
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，在本发明的第一方面，本发明提供一种药物，包括如下物质作为活性成分：
3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐和/或
CPI-613或其药学上可接受的盐。
在本发明的技术方案中，所述药物的剂型选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂。
在本发明的技术方案中，所述药物为纳米颗粒剂。
在本发明的技术方案中，3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐和CPI-613或其药学上可接受的盐联用，将所述活性成分共同配制或分开配制，用于配伍使用、同时使用或分开使用。
在本发明的技术方案中，所述药物联用为单剂量单位形式，包括4～16mg的3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐以及4～16mg的CPI-613或其药学上可接受的盐。
在本发明的第二方面，本发明提供一种上述的药物在制备具有抗病毒活性的药物中的用途。
在本发明的第三方面，本发明还提供上述药物(复合纳米颗粒剂)的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)：将脂溶性的药物CPI-613和PLGA共溶于二氯甲烷中，配置成油相溶液；
步骤2)：将水溶性药物3-溴丙酮酸溶解在水中，配置成水相溶液；
步骤3)：将步骤2)中水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤1)中的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
步骤4)：涡旋条件下，将步骤3)中超声后的第一乳浊液逐滴加入聚乙烯醇(PVA)水溶液中，然后冰浴超声，得到第二乳浊液；
步骤5)：将步骤4)中得到的第二乳浊液迅速倒入聚乙烯醇(PVA)水溶液中，15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
步骤6)：高速离心收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
步骤7)：将步骤6)得到的纳米粒子分散在海藻糖的水溶液中，-50～-80℃冻干，储存于-20℃冰箱中备用。
在本发明的技术方案中，所述步骤1)中，CPI-613与PLGA的质量比为(1～8):100。
在本发明的技术方案中，所述步骤2)中，3-BPA的浓度为(1～100)×10-3mg/μL，优选地，3-BPA的浓度为(25～30)×10-3mg/μL。
在本发明的技术方案中，所述步骤4)中，所述第一乳浊液在所述聚乙烯醇(PVA)水溶液中的终浓度为1～5(v/v)％。
在本发明的技术方案中，所述步骤4)中，超声的参数为超声振幅20～50％，每次5～20s，间隔1～10s，超声总时长为0.5～3min。
在本发明的技术方案中，所述步骤5)中，所述第二乳浊液在所述聚乙烯醇(PVA)水溶液中浓度为0.1～0.5(v/v)％。
在本发明的技术方案中，所述步骤6)中，离心速率为6000～15000g，离心时间为8～30min。
本发明所述的CPI-613为6，8-双(苄基硫代)辛酸；3-BPA为3-溴丙酮酸；CPI-613+3-BPA游离药物为CPI-613和3-BPA混合作为药物活性成分，CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒为CPI-613和3-BPA同时作为药物活性成分共负载的复合纳米颗粒。3-BPA单药纳米颗粒为仅负载3-BPA作为活性成分的PLGA纳米颗粒。CPI-613单药纳米颗粒为仅负载CPI-613作为活性成分的PLGA纳米颗粒。
本发明还提供一种CPI-613单药纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)：将PLGA和CPI-613共同溶于二氯甲烷中，得到油相溶液；
步骤2)：准备二次水溶液，得到水相溶液；
步骤3)：将步骤2)得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
步骤4)：涡旋条件下，将步骤3)得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
步骤5)：超声完毕后，将步骤4)得到的第二乳浊液迅速倒入聚乙烯醇水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
步骤6)：12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
步骤7)：最后将步骤6)得到的纳米粒子重新分散在海藻糖的水溶液中；-80～-50℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
本发明还提供一种3-BPA单药纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤:
步骤1)：准确称量100mg PLGA溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
步骤2)：准确称量8mg 3-溴丙酮酸加入150μL二次水溶液中，得到水相溶液；(载体/药物比例是100：8)
步骤3)：将步骤2)得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
步骤4)：涡旋条件下，将步骤3)得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5(w/v)％(5g聚乙烯醇/100mL水)聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
步骤5)：超声完毕后，将步骤4)得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
步骤6)：12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
步骤7)：最后将步骤6)得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-80～-50℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了一种药物，包含活性成分CPI-613和/或3-溴丙酮酸，两药均具有抗病毒活性，两药联合治疗具有协同效应，联用时，其抗病毒活性可达到1+1＞2的技术效果；
2、本发明提供一种CPI-613和3-溴丙酮酸联用的复合纳米颗粒，该药物联用用使用复合纳米颗粒剂剂型，药物相容性好，抗病毒活性高；
3、本发明提供一种CPI-613和3-溴丙酮酸复合纳米颗粒剂的制备方法，该方法简单易操作，所得复合纳米颗粒剂的两个活性药物成分均匀地包载于PLGA纳米粒中。
附图说明
图1为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的透射电镜图；
图2为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒中CPI-613的定量检测结果图；
图3为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒中3-BPA的定量检测结果图；
图4为游离药物CPI-613、游离药物3-BPA和CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的对293细胞的毒性测试结果图；
图5为游离药物CPI-613、游离药物3-BPA和CPI-613+3-BPA游离药物的抗病毒活性验证结果图；
图6为CPI-613单药纳米颗粒、3-BPA单药纳米颗粒、CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的抗病毒活性验证结果图；
图7为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的抗病毒浓度筛选结果图；
图8为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒和CPI-613+3-BPA游离药物的抗病毒活性比较结果示意图。
附图中，Free 3-BPA为游离3-BPA；Free CPI-613为游离CPI-613；Free 3-BPA+Free CPI-613为CPI-613+3-BPA游离药物；CPI NPs为CPI-613单药纳米颗粒；BPA NPs为3-BPA单药纳米颗粒；BCP NPs为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。Free 3-BPA为游离3-BPA；Free CPI-613为游离CPI-613；Free 3-BPA+Free CPI-613为CPI-613+3-BPA游离药物；CPI NPs为CPI-613单药纳米颗粒；BPA NPs为3-BPA单药纳米颗粒；BCP NPs为CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒。
实施例1：不同纳米颗粒的制备
(1)CPI-613和3-BPA共负载的复合PLGA纳米颗粒(CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒)的制备方法，包括以下步骤：
①准确称量100mg PLGA和4mg CPI-613共同溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
②准确称量4mg 3-溴丙酮酸加入150μL二次水溶液中，得到水相溶液；(载体/药物总比例是100：8，然后两种药物有不同比例)
③将步骤②得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
④涡旋条件下，将步骤③得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5(w/v)％的(5g聚乙烯醇/100mL水)聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
⑤超声完毕后，将步骤④得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
⑥12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
⑦最后将步骤⑥得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-50～-80℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
(2)负载CPI-613的PLGA纳米颗粒(CPI-613单药纳米颗粒)的制备方法，包括以下步骤:
①准确称量100mg PLGA和8mg CPI-613共同溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
②准备150μL二次水溶液，得到水相溶液；(载体/药物比例是100：8)
③将步骤②得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
④涡旋条件下，将步骤③得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5(w/v)％(5g聚乙烯醇/100mL水)聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
⑤超声完毕后，将步骤④得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
⑥12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
⑦最后将步骤⑥得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-50～-80℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
(3)负载3-BPA的PLGA纳米颗粒(3-BPA单药纳米颗粒)的制备方法，包括以下步骤:
①准确称量100mg PLGA溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
②准确称量8mg 3-溴丙酮酸加入150μL二次水溶液中，得到水相溶液；(载体/药物比例是100：8)
③将步骤②得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
④涡旋条件下，将步骤③得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5(w/v)％(5g聚乙烯醇/100mL水)聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
⑤超声完毕后，将步骤④得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
⑥12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
⑦最后将步骤⑥得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-50～-80℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
(4)PLGA空载体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
①准确称量100mg PLGA溶于2mL二氯甲烷中，得到油相溶液；
②准备150μL二次水溶液，得到水相溶液；
③将步骤②得到的水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤①得到的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
④涡旋条件下，将步骤③得到的超声后的第一乳浊液逐滴加入4mL 5％((w/v).5g聚乙烯醇/100mL水聚乙烯醇水溶液中，立即放入冰浴中进行超声，得到第二乳浊液；
⑤超声完毕后，将步骤④得到的第二乳浊液迅速倒入0.05(w/v)％聚乙烯醇(PVA)水溶液中；
15～35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
⑥12000rpm离心20min收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
⑦最后将步骤⑥得到的纳米粒子重新分散在1mL海藻糖(0.1g/mL；冻干保护剂)的水溶液中；-50～-80℃真空条件下将纳米粒子冻干后，存于-20℃冰箱中备用。
将上述(1)中合成得到的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的形貌通过透射电子显微镜观察。在分析之前，CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒经过真空喷铂处理。CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的透射电镜图如图1所示。从图1可以看出该复合纳米粒子形貌均一，大小约为50～150纳米之间。
为了进一步验证两个药物(CPI-613和3-BPA)是否包载到了PLGA纳米粒中，对复合纳米粒子中的CPI-613和3-BPA两种药物分别采取了高效液相定量法和丙酮酸试剂盒定量法进行检测。检测结果如图2所示，其中图2为CPI-613的高效液相测试结果，保留时间为9.287min的特征峰为CPI-613的特征峰，用外标法计算CPI-613的含量；图3为不同浓度下检测吸光值所得到的3-BPA的标曲，图中的值为扣除背景值后的值(我们将包裹CPI-613的PLGA纳米粒作为背景)。同时我们利用差减法测得的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒合成过程中其上清中3-BPA的吸光值为0.03467(扣除背景后)，在所得的标曲范围内，将该值代入标曲所得公式中，其对应上清中的3-BPA浓度为72.7μg/mL，并且通过差减法计算得出复合纳米粒中3-BPA的包封率为16.39％。从检测结果可以看出，两种药物均匀包载于PLGA纳米粒中。
实施例2：不同浓度游离CPI-613、不同浓度游离3-BPA、不同浓度CPI-613+3-BPA复合PLGA纳米颗粒对293细胞的MTT毒性实验
步骤1)：将293细胞接种于96孔板中，细胞浓度为每孔1×104个，培养过夜。
步骤2)：次日，吸出细胞上清液，用PBS溶液洗涤细胞三次。
步骤3)：实验组细胞每孔加入不同浓度(CPI-613的浓度分别为20μM，40μM，60μM，80μM，160μM)的复合纳米颗粒(按实施例1中(1)复合纳米颗粒制备方法制备复合纳米颗粒时，使用等量的CPI-613和3-溴丙酮酸)、不同浓度的游离CPI-613(20μM，40μM，60μM，80μM，160μM)、不同浓度游离3-BPA(20μM，40μM，60μM，80μM，160μM)，继续分别培养8、16h。
步骤4)：到达预设计时间点后，去除含药培养基，并用PBS溶液洗涤细胞三次。每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg/ml)。
步骤5)：继续培养4h后，去除培养基，每孔加入200μL DMSO溶液。将孔板放置于震荡箱中，150rpm低速震荡15min，使生成的紫色结晶完全溶解。
步骤6)：用多功能酶标仪测定各孔光学密度(OD)值。未经处理的细胞作为阴性对照，1％Triton X-100溶液(v/v)处理的细胞作为阳性对照，每组均设置5个生物学平行。
加入不同浓度的游离CPI-613，培养8h、16h的MTT测试结果如图4a所示，加入不同浓度的游离3-BPA，培养8h、16h的MTT测试结果如图4b所示，加入不同浓度的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒，培养8h的MTT测试结果如图4c所示，加入不同浓度的CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒，培养16h的MTT测试结果如图4d所示，从图中可以看出，CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒对293细胞没有明显的毒副作用，尤其在药物浓度小于80μM时，没有产生明显毒性。所以选用小于该浓度范围作为抗病毒的药物浓度。
实施例3：游离的CPI-613、游离的3-溴丙酮酸、CPI-613+3-溴丙酮酸游离药物的抗病毒活性验证
游离的CPI-613、游离的3-溴丙酮酸、CPI-613+3-溴丙酮酸游离药物的抗病毒活性验证，包括以下步骤：
步骤1)：将293细胞接种于24孔板中，培养过夜。
步骤2)：次日，吸出细胞上清液，用PBS溶液洗涤细胞三次。
步骤3)：配置病毒悬液：2μL含有荧光素酶报告基因的牛痘病毒(VACV)悬液加入到10毫升DMEM中。然后将配置好的病毒悬液加入到24孔板中，每孔400μL。培养箱中培养2h。
步骤4)：培养到设定时间点后，向孔板中分别加入游离的CPI-613(40μM)、游离的3-溴丙酮酸(40μM)、游离的CPI-613(40μM)+游离的3-溴丙酮酸(40μM)(分别含有等量的CPI-613：40μM、等量的3-溴丙酮酸：40μM)
步骤5)：继续培养至16h后，去除含药培养基，并用PBS溶液洗涤细胞三次。每孔加入50μL TAP裂解液。
步骤6)：细胞裂解后15000rpm，离心10min，收集上清，待测。
步骤7)：用多功能酶标仪测定各孔生物发光强度。
测试结果如图5所示，从图中可以看出，空白培养基DMEM没有抗病毒活性，两种游离药物在40μM浓度条件下均具有一定的抗病毒活性，并且当两种药物同时使用时抗病毒活性显著增强。
实施例4：空的PLGA载体(Blank PLGA NPs)、CPI-613单药纳米颗粒、3-溴丙酮酸单药纳米颗粒和CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒的抗病毒活性验证
空的PLGA载体(Blank PLGA NPs)、CPI-613单药纳米颗粒、3-溴丙酮酸单药纳米颗粒和CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒的抗病毒活性验证，包括以下步骤：
步骤1)：将293细胞接种于24孔板中，培养过夜。
步骤2)：次日，吸出细胞上清液，用PBS溶液洗涤细胞三次。
步骤3)：配置病毒悬液：2μL含有荧光素酶报告基因的牛痘病毒(VACV)悬液加入到10毫升DMEM中。然后将配置好的病毒悬液加入到24孔板中，每孔400μL。培养箱中培养2h。
步骤4)：培养到设定时间点后，向孔板中分别加入PLGA载体(Blank PLGA NPs)、CPI-613单药纳米颗粒(40μM)、3-溴丙酮酸单药纳米颗粒(40μM)和CPI-613+3-BPA复合纳米颗粒(CPI-613(40μM)和3-溴丙酮酸(40μM))(分别含有等量的CPI-613：40μM、等量的3-溴丙酮酸：40μM、PLGA的量与复合纳米颗粒中的PLGA含量相同，并且复合纳米粒子的总载药量为含40μM CPI-613时的量。)
步骤5)：继续培养至16h后，去除含药培养基，并用PBS溶液洗涤细胞三次。每孔加入50μL TAP裂解液。
步骤6)：细胞裂解后15000rpm，离心10min，收集上清，待测。
步骤7)：用多功能酶标仪测定各孔生物发光强度。
测试结果如图6所示，从图中可以看出，空的PLGA载体(DMEM)没有抗病毒活性，CPI-613单药纳米颗粒、3-溴丙酮酸单药纳米颗粒和CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒在40μM浓度条件下均具有较好的抗病毒活性，并且CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒的抗病毒活性明显优于两种单药纳米颗粒。
实施例5：CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒抗病毒活性的浓度筛选
基于CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒抗病毒活性的浓度筛选，包括以下步骤：
步骤1)：将293细胞接种于24孔板中，培养过夜。
步骤2)：次日，吸出细胞上清液，用PBS溶液洗涤细胞三次。
步骤3)：配置病毒悬液：2μL含有荧光素酶报告基因的牛痘病毒(VACV)悬液加入到10毫升DMEM中。然后将配置好的病毒悬液加入到24孔板中，每孔400μL。培养箱中培养2h。
步骤4)：培养到设定时间点后，向孔板中加入CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒(按实施例1中(1)CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒制备方法制备CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒时，使用等量的CPI-613和3-溴丙酮酸)，使CPI-613的终浓度达到不同的梯度浓度(5μM，10μM，20μM，40μM，80μM的CPI-613)
步骤5)：继续培养至16h后，去除含药培养基，并用PBS溶液洗涤细胞三次。每孔加入50μL TAP裂解液。
步骤6)：细胞裂解后15000rpm，离心10min，收集上清，待测。
步骤7)：用多功能酶标仪测定各孔生物发光强度。
测试结果如图7所示，从图中可以看出，CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒的抗病毒能力随着其药物浓度的增大而增大，并且当CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒中CPI-613的含量为20μM时，病毒的相对含量就减少了一半。说明CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒具有较强的抗病毒性能。
实施例6：CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒的抗病毒活性与CPI-613+3-溴丙酮酸游离药物的抗病毒活性比较试验(CPI-613浓度均为40μM；3-溴丙酮酸浓度均为40μM)
将实施例3中CPI-613(40μM)+3-溴丙酮酸(40μM)游离药物与实施例4中CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒(40μM)的抗病毒活性比较，结果如图8a所示，由图可以看出，CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒的抗病毒能力优于CPI-613+3-溴丙酮酸游离药物的抗病毒能力。其原因可能为，纳米颗粒可增强CPI-613、3-溴丙酮酸复合使用时的稳定性，使其相容性好，进而抗病毒活性更好。
实施例7：CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒的抗病毒活性与CPI-613+3-溴丙酮酸游离药物的抗病毒活性比较试验
CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒的抗病毒能力和CPI-613+3-溴丙酮酸游离药物的抗病毒性能比较，包括以下步骤：
步骤1)：将293细胞接种于24孔板中，培养过夜。
步骤2)：次日，吸出细胞上清液，用PBS溶液洗涤细胞三次。
步骤3)：配置病毒悬液：2μL含有荧光素酶报告基因的牛痘病毒(VACV)悬液加入到10毫升DMEM中。然后将配置好的病毒悬液加入到24孔板中，每孔400μL。培养箱中培养2h。
步骤4)：培养到设定时间点后，向孔板中分别加入CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒、游离的CPI-613+游离的3-溴丙酮酸(分别含有等量的CPI-613：20μM、等量的3-溴丙酮酸：20μM、复合纳米粒子的总载药量为含20μM CPI-613时的量。)
步骤5)：继续培养至16h后，去除含药培养基，并用PBS溶液洗涤细胞三次。每孔加入50μL TAP裂解液。
步骤6)：细胞裂解后15000rpm，离心10min，收集上清，待测。
步骤7)：用多功能酶标仪测定各孔生物发光强度。
测试结果如图8b所示，从图中也可以看出，CPI-613+3-溴丙酮酸复合纳米颗粒的抗病毒能力优于CPI-613+3-溴丙酮酸游离药物的抗病毒能力。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，所述药物包括如下物质作为活性成分：
3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐和/或
CPI-613或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，所述药物的剂型选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂。
3.根据权利要求1所述的药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，所述药物为纳米颗粒剂。
4.根据权利要求1所述的药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐和CPI-613或其药学上可接受的盐联用，将所述活性成分共同配制或分开配制，用于配伍使用、同时使用或分开使用。
5.根据权利要求4所述的药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，所述药物联用为单剂量单位形式，包括4~16mg的3-溴丙酮酸或其药学上可接受的盐以及
4~16mg的CPI-613或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1所述的药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，所述药物的制备方法包括如下步骤：
步骤1）：将脂溶性的药物CPI-613和PLGA共同溶于二氯甲烷中，配置成油相溶液；
步骤2）：将水溶性药物3-溴丙酮酸溶解在水中，配置成水相溶液；
步骤3）：将步骤2）中水相溶液在涡旋条件下逐滴加入到步骤1）中的油相溶液中，冰浴条件下进行超声，得到第一乳浊液；
步骤4）：涡旋条件下，将步骤3）中超声后的第一乳浊液逐滴加入聚乙烯醇（PVA）水溶液中，然后冰浴超声，得到第二乳浊液；
步骤5）：将步骤4）中得到的第二乳浊液迅速倒入聚乙烯醇（PVA）水溶液中，15~35℃条件下，加速搅拌使第二乳浊液中有机溶剂二氯甲烷蒸发；
步骤6）：高速离心收集制备得到的纳米粒子，并用去离子水洗涤三次；
步骤7）：将步骤6）得到的纳米粒子分散在海藻糖的水溶液中，-50~-80℃冻干，储存于-20℃冰箱中备用。
7.根据权利要求6所述的药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，所述步骤1）中，CPI-613与PLGA的质量比为(1~8):100。
8.根据权利要求6所述的药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，所述步骤2）中，水相溶液中，3-BPA的浓度为（1~100）×10-3mg/μL。
9.根据权利要求6所述的药物在制备具有抗牛痘病毒活性的药物中的用途，其特征在于，所述步骤4）中，所述第一乳浊液在所述聚乙烯醇（PVA）水溶液中的终浓度为1~5（v/v）%。
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