CN112840026A - 抑制tigit基因表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于降低TIGIT mRNA和蛋白表达的化合物、组合物和方法。该方法可用于治疗、预防或改善TIGIT相关疾病、紊乱和病况。

Description

抑制TIGIT基因表达的组合物和方法
相关申请
本申请主张于2018年10月18日提交的美国专利临时申请No.62/747,261的优先权。上述申请中的所有内容都以引用的方式并入本文。
背景技术
具有Ig和ITIM功能域的T细胞免疫受体(TIGIT，也称为VSIG9，WUCAM和VSTM3)是免疫检查点受体，已知可以负调控T细胞功能1。TIGIT表达在一些T细胞和自然杀伤(NK)细胞上1并且其能结合树突状细胞和巨噬细胞上的脊髓灰质炎病毒受体(PVR/CD155)1。
TIGIT和PVR的相互作用能负调控T细胞和NK细胞功能1。阻断TIGIT和PVR/CD155的相互作用能逆转其对NK细胞的细胞毒性的抑制效应2。在艾滋病(HIV)患者中，因为TIGIT具有使T细胞耗竭的能力，TIGIT表达与疾病进展相互关联3。用单克隆抗体阻断TIGIT和PD-1(程序性死亡蛋白-1)能恢复HIV特异性CD8+T细胞反应3。
TIGIT表达与其它免疫检查点如TIL上的PD-1高度关联。TIGIT表达谱直接关联免疫抑制表型。在临床前设置中，小鼠模型中的TIGIT敲除小鼠表现出肿瘤负荷减少和存活延长4。此外，同时阻断黑色素瘤患者的TIGIT和PD-1导致肿瘤抗原特异性CD8+T细胞增殖和CD8+肿瘤浸润性T细胞(TIL)5。
此外，TIGIT还能与T细胞共刺激分子CD226竞争性地结合CD1556。数据还发现TIGIT能阻碍CD226的二聚化，消除CD226的共刺激活性6。总之，在疾病设定如癌症、病毒感染和炎性疾病/病况中，抑制TIGIT可以提供恢复T细胞活性的治疗益处。
发明内容
一些实施方式提供用于治疗的反义化合物、组合物和方法。在一些实施方式中，用于治疗的组合物和方法包括：给有需要的个体施用具有Ig和ITIM功能域的T细胞免疫受体(TIGIT；也称为VSIG9、WUCAM和VSTM3)特异性抑制剂。在一些实施方式中，所述TIGIT特异性抑制剂是核酸。在一些实施方式中，所述核酸是如本文所述的靶向TIGIT的反义化合物。在一些实施方式中，所述化合物、组合物和方法有助于预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善TIGIT相关疾病、紊乱和病况。在一些实施方式中，所述疾病、紊乱和病况是癌症；炎性疾病例如但不限于系统性红斑狼疮、系统性硬化症、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩病、非酒精性脂肪性肝炎和败血症；病毒感染如艾滋病(HIV)、乙型肝炎或丙型肝炎。
本文提供了用于抑制TIGIT mRNA和/或蛋白表达的化合物、组合物和方法。本文还提供了用于诊断、治疗和/或预防疾病和/或病况的方法，所述疾病和/或病况对抑制TIGITmRNA和/或蛋白表达有反应。
在一些实施方式中，TIGIT特异性抑制剂是包括12至30个连接的核苷酸的合成的寡核苷酸化合物，具有与SEQ ID NO：1的相等长度部分互补的至少12个连续核碱基。在一些实施方式中，所述化合物的核苷酸间键(internucleotide linkage)包括硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，超过一半但少于全部的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，所有的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，硫代磷酸酯键合可以是Rp和Sp对映体的混合物，或它们可以被制造成立构规整或基本立构规整的Rp或Sp形式的任意一个。
在一些实施方式中，化合物的核碱基不进一步修饰(即，碱基或糖部分无修饰)。在这方面，反义寡核苷酸的核苷酸包括天然存在的核碱基和糖。
在一些实施方式中，TIGIT特异性抑制剂是包括12至30个连接的核苷酸的合成的寡核苷酸化合物，其中所述化合物的碱基序列与SEQ ID NO：1的相等长度部分至少80％互补。在一些实施方式中，所述化合物的核苷酸间键包括硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，超过一半但少于全部的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，所有的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，所述硫代磷酸酯键合可以是Rp和Sp对映体的混合物，或它们可以被制造成立构规整或基本立构规整的Rp或Sp形式的任意一个。在一些实施方式中，所述化合物的核碱基不进一步修饰(即，碱基或糖部分无修饰)。在这方面，反义寡核苷酸的核苷酸包括天然存在的核碱基和糖。
在一些实施方式中，TIGIT特异性抑制剂是包括12至30个连接的核苷酸的合成的寡核苷酸化合物，其中所述化合物的碱基序列与SEQ ID NO：1的核碱基121-780、841-1440、1650-2160或2700-2800的相等长度部分至少80％互补。在一些实施方式中，所述化合物的核苷酸间键包括硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，超过一半但少于全部的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，所有的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，所述硫代磷酸酯键合可以是Rp和Sp对映体的混合物，或它们可以被制造成立构规整或基本立构规整的Rp或Sp形式的任意一个。在一些实施方式中，所述化合物的核碱基不进一步修饰(即，碱基或糖部分无修饰)。在这方面，反义寡核苷酸的核苷酸包括天然存在的核碱基和糖。
一些实施方式提供组合物，所述组合物包含本文所述的化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂。
在一些实施方式中，本发明提供了一种抑制TIGIT mRNA或蛋白表达的方法。在一些实施方式中，所述方法包括：使细胞与本文所述的至少一种反义化合物或组合物接触。在一些实施方式中，所述方法包括：施用本文所述的至少一种反义化合物或组合物。
在一些实施方式中，TIGIT表达的抑制发生在细胞或组织。在一些实施方式中，所述抑制发生在动物的细胞或组织。在一些实施方式中，所述动物是人。在一些实施方式中，所述抑制是TIGIT mRNA水平的降低。在一些实施方式中，所述抑制是TIGIT蛋白水平的降低。在一些实施方式中，TIGIT mRNA和蛋白水平均降低。
在一些实施方式中，本发明提供了用于治疗有需要的个体的疾病、紊乱或病况的方法，所述疾病、紊乱或病况与TIGIT表达和/或活性相关。在一些实施方式中，所述方法包括施用本文所述的至少一种反义化合物或组合物。
附图说明
图1说明了TIGIT反义同系物(analog)对小鼠CT26.CL25细胞系的效应。
图2A和图2B说明了TIGIT反义物剂量依赖性地抑制体内肿瘤的生长。
图3说明了TIGIT反义物增加肿瘤浸润CD3+T细胞。
图4A至图4C说明了TIGIT反义物的抗肿瘤作用依赖NK和CD8+T细胞。
图5说明了ASO的局部注射不需要寡核苷酸的化学修饰。
图6A和图6B说明了TIGIT反义物与抗PD-1抗体联合治疗协同地抑制肿瘤生长。
具体实施方式
应当理解，以上的一般性描述和以下的具体实施方式均仅是示例性和解释性的，并不构成对本公开的限制。在此，除非另有明确说明，单数的使用包括复数。除非另有说明，本文所使用的“或”指的是“和/或”。进一步，术语“包括”以及其他形式(例如“包括(三单形式)”和“包含(过去式及过去分词)”)的使用并不构成限制。
本文使用的任何部分标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或部分文件，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和条约，出于任何目的通过引用将其全部内容明确并入本申请。
除非本文中提供了明确的定义，否则本文中与分析化学、合成有机化学和医药化学有关的术语、步骤和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术可用于化学合成和化学分析。某些技术和步骤能在以下文件中找到：例如“反义物研究中的碳水化合物修饰”，Sangvi和Cook编辑，美国化学协会，华盛顿，1994；“雷明顿药物科学”，Mack出版公司，Easton，Pa.，第21版，2005；和“反义药物技术、原理、策略与应用”，Stanley T.Crooke编辑，CRC出版社，Boca Raton，Fla；和Sambrook等，“分子克隆，实验室手册”，第二版，冷泉港实验室出版社，1989(出于任何目的通过引用将它们并入本文)。在允许的情况下，本公开全文中引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物以及其他数据均通过引用整体并入本文。
除非另有说明，否则以下术语具有以下含义：
本文所使用的"核苷"是指包含核碱基部分和糖部分的化合物。核苷包括但不限于：天然存在的核苷(如在DNA和RNA中发现的)和修饰的核苷。核苷可与磷酸部分连接。
术语“3”，当直接使用时，通常指的是多核苷酸或寡核苷酸中距同一多核苷酸或寡核苷酸中另一个区或位置3’的区域或位置(朝向核苷酸的3’端)。术语“3′端”通常指的是组成的寡核苷酸的核苷酸的3’末端。
术语“5”，当直接使用时，通常指的是多核苷酸或寡核苷酸中距同一多核苷酸或寡核苷酸中另一个区域或位置5’的区域或位置(朝向核苷酸的5’端)。术语“5’端”通常指的是组成的寡核苷酸的核苷酸的5’末端。
本文所使用的“化学修饰”指的是化合物与天然存在的对应物相比的化学差异。寡核苷酸的化学修饰包括核苷修饰，包括糖部分修饰和核碱基修饰和核苷间键修饰。对于寡核苷酸，化学修饰不包括仅核碱基序列不同。
本文所使用的“糖部分”指的是核苷天然存在的糖部分或修饰的糖部分。本文所使用的“天然存在的糖部分”指的是天然存在的RNA中发现的呋核亚硝脲或天然存在的DNA中发现的脱氧呋核亚硝脲。本文所使用的“修饰的糖部分”指的是取代的糖部分或糖替代物(sugar surrogate)。
本文所使用的"核酸"指的是由单体的核苷酸组成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸(ssDNA)、双链核酸(dsDNA)、小干扰核糖核酸(siRNA)和微小RNA(miRNA)。
本文所使用的“核苷酸”指的是进一步包括磷酸连接基团的核苷。本文所使用的“连接的核苷"可以通过磷酸键连接，也可以不通过磷酸键连接，因此包括但不限于“连接的核苷酸”。本文所使用的“连接的核苷”是指以连续序列连接的核苷(即，在连接的对象之间没有额外的核苷)。
本文所使用的“核碱基”指的是一组原子，它们可以与糖部分连接以产生能够掺入寡核苷酸的核苷，并且它们能够与另一个寡核苷酸或核酸的天然存在的互补核碱基键合。核碱基可以是天然存在的或可以是修饰的。本文所使用的“核碱基序列”指的是连续核碱基的顺序，与任何糖、键合或核碱基修饰无关。
本文所使用的术语“未修饰的核碱基”或“天然存在的核碱基”指RNA或DNA的天然存在的杂环核碱基：嘌呤碱基：腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基：胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基C)和尿嘧啶(U)。
本文所使用的“修饰的核碱基”指不是天然存在的核碱基的任何核碱基。
本文所使用的“修饰的核苷”指的是与天然存在的RNA或DNA核苷相比包括至少一个化学修饰的核苷。修饰的核苷包括修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。
本文所使用的“寡核苷酸”指包括多个连接的核苷的化合物。在一些实施方式中，寡核苷酸包括一个或多个未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)。在一些实施方式中，寡核苷酸只包括未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)。在一些实施方式中，寡核苷酸包括一个或多个修饰的核苷。
本文所使用的“修饰的寡核苷酸”指的是寡核苷酸包括至少一个修饰的核苷和/或至少一个修饰的核苷间键(internucleoside linkage)。
本文所使用的“核苷间键”指的是寡核苷酸中连续核苷之间的共价键。本文所使用的“天然存在的核苷间键”指的是3’至5’磷酸二酯键。本文所使用的“修饰的核苷间键”指的是除天然存在的核苷间键以外的任何核苷间键。
本文所使用的“反义化合物”指的是包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成的化合物，所述寡核苷酸的至少一部分与能够与其杂交的目的核酸互补，从而产生至少一种反义活性。
本文所使用的“反义活性”指的是反义化合物杂交至它的目的核酸所引起的任何可检测到的和/或可测量的变化。在一些实施方式中，反义活性包括调节目的核酸转录产物(如mRNA)的量和活性。在一些实施方式中，反义活性包括调节前体mRNA的剪接。
本文所使用的“基于RNase H的反义化合物”指的是一种反义化合物，所述反义化合物的至少一些反义活归因于反义化合物杂交至目的核酸和随后RNase H裂解目的核酸。
本文所使用的“基于RISC的反义化合物”指的是一种反义化合物，所述反义化合物的至少一些反义活性归因于RNA诱导沉默复合体(RISC)。
本文所使用的“表达”指的是基因最终产生蛋白的过程。表达包括但不限于：转录、转录后修饰(如剪接、聚腺苷酸化、5’加帽)和翻译。
本文所使用的“目的核酸”指的是反义化合物将与之杂交以产生所需反义活性的核酸分子。反义寡核苷酸与其目的核酸具有足够的互补性，使得可以在生理条件下进行杂交。
本文所使用的针对核碱基的“核碱基互补”或“互补”指的是核碱基能够与另一个核碱基进行碱基配对。例如，DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在一些实施方式中，互补的核碱基指的是反义化合物的核碱基能够与其目的核酸的核碱基进行碱基配对。例如，如果在反义化合物的某个位置的核碱基能够与在目的核酸的某个位置的核碱基形成氢键，那么则认为在该寡核苷酸与目的核酸之间的氢键位置的那个核碱基对是互补的。具有某些修饰的核碱基可以保持与对应的核碱基配对的能力，因此仍然具有核碱基互补性。
本文所使用的针对核碱基的“非互补”指的是一对核碱基彼此不形成氢键。
本文所使用的针对寡聚化合物的“互补”(如，连接的核苷、寡核苷酸或核酸)指的是该寡聚化合物或其区域通过核碱基互补与另一种寡聚化合物或其区域杂交的能力。互补寡聚化合物不需要在每个核苷上都具有核碱基互补性。而是可以容忍一些错配。在一些实施方式中，互补寡聚化合物或区域的70％核碱基是互补的(70％互补)。在一些实施方式中，互补寡聚化合物或区域是80％互补的。在一些实施方式中，互补寡聚化合物或区域是90％互补的。在一些实施方式中，互补寡聚化合物或区域是95％互补的。在一些实施方式中，互补寡聚化合物或区域是100％互补的。
本文所使用的“错配”指的是当第一个和第二个寡聚化合物对整齐时，第一个寡聚化合物的核碱基不能与第二个寡聚化合物的相应位置配对。第一个和第二个寡聚化合物的任何一个或两者可以是寡核苷酸。
本文所使用的“杂交”指的是互补寡聚化合物的配对(如反义化合物和它的目的核酸)。虽然不限于特定机制，但最常见的配对机制涉及氢键结合，互补核碱基之间的氢键可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。
本文所使用的“特异性杂交”指的是寡聚化合物与一个核酸位点杂交的亲和力大于与另一核酸位点杂交的能力。
本文所使用的针对寡核苷酸或其部分的“完全互补”指的是寡核苷酸或其部分的每个核碱基能够与互补的核酸或其连续部分的核碱基配对。因此，完全互补区域的任一条链中均不包含错配或未杂交的核碱基。
本文所使用的“互补百分率”指的是寡聚化合物与目的核酸的相等长度部分互补的核碱基百分率。互补百分率的计算是将寡聚化合物与目的核酸中相应位置的核碱基互补的核碱基数量除以寡聚化合物的总长度。
本文所使用的“同一性百分率”指的是将第一个核酸中与第二个核酸中相应位置的核碱基类型相同(与化学修饰无关)的核碱基数量除以第一个核酸的核碱基总数量。
本文所使用的“药学上可接受的载体或稀释剂”指的是适合施用于动物的任何物质。在一些实施方式中，药学上可接受的载体或稀释剂是无菌盐水。在一些实施方式中，这种无菌盐水是药用级盐水。
术语“线性合成”通常指的是合成从寡核苷酸一端开始并线性发展至另一端。线性合成允许将(在掺入的长度、碱基成分和/或化学修饰方面)相同或不同的单体单元掺入到寡核苷酸中。
本文所使用的“约”指的是在数值的+/-10％之内。例如，如果记载“标记可以增加约50％”，则暗示标记可以增加45％至55％。
本文所使用的“伴随施用(administered concomitantly)”指的是以任何方式共同施用两种药剂，两者的药理作用在患者体内同时表现出来。伴随给药不要求两种药剂以单一药物组合物、相同的剂型或通过相同的给药途径施用。两种药剂的作用不必同时表现出来。效果仅需重叠一段时间，而不必范围相同。
本文所使用的“施用”或“给药”指的是给个体提供药剂，包括但不限于：医务人员施用和自我施用。向个体施用药剂可以是连续的、慢性的、短暂的或间歇的。给药可以是肠胃外的或非肠胃外的。
本文所使用的“药剂”指的是当给动物施用时可以提供治疗益处的活性物质。“第一药剂”指的是本发明的治疗性化合物。例如，第一药剂可以是靶向TIGIT的反义寡核苷酸。“第二药剂”指的是本发明的第二种治疗性化合物(如靶向TIGIT的第二种反义寡核苷酸)和/或非TIGIT治疗性化合物。
本文所使用的“有效量”或“治疗有效量”指的是足以使需要药剂的个体实现所需生理学结果的活性药剂的量。有效量在个体之间会有所不同，取决于待治疗个体的健康状况或身体状况、待治疗个体的分类学类别、组合物的配方、对个体医疗条件的评估以及其他相关因素。
本文所使用的“个体”或“受试者”或“动物”指的是选择进行治疗或疗法的人类或非人类动物。本文所使用的“有需要的个体”指的是选择需要这种治疗或疗法的人类或非人类动物。
本文所使用的“抑制表达或活性”指的是降低或阻断RNA或蛋白的表达或活性，并不一定表示完全消除表达或活性。
本文所使用的“药剂”指的是当给个体施用时提供治疗益处的物质。例如，在一些实施方式中，靶向TIGIT的反义寡核苷酸是药剂。本文所使用的“药物组合物”或“组合物”指的是适于给个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含一种或多种活性药剂和药物载体(如无菌水溶液)。
本文所使用的“区域”或“目的区域”定义为目标核酸中具有至少一种可识别的结构、功能或特征的部分。例如，目的区域可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子连接处、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其它定义的核酸区。TIGIT的结构定义区域可以通过序列数据库如NCBI中的登录号获得，并且这些信息通过引用并入本文。在一些实施方式中，目的区域可能包含从目的区域内一个目的片段的5’目的位点至目的区域内另一个目的片段的3’目的位点的序列。
本文所使用的“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指的是施用本文所述的化合物以改变或改善疾病、紊乱，或病况。
“部分”指的是核酸的指定数量的连续核碱基(即连接的核碱基)。在一些实施方式中，部分是目标核酸的指定数量的连续核碱基。在一些实施方式中，部分是反义化合物的指定数量的连续核碱基。
一些实施方式提供了用于降低TIGIT mRNA和蛋白表达的化合物和方法。在一些实施方式中，所述化合物是用于治疗、预防或改善TIGIT相关疾病的TIGIT特异性抑制剂。在一些实施方式中。所述化合物是靶向TIGIT的反义寡核苷酸。
在一些实施方式中，提供了靶向人TIGIT核酸的反义化合物。在一些实施方式中，人TIGIT核酸是GENBANK登录号NM_173799.3所示的序列(以SEQ ID NO：1并入本文)。
1 cgtcctatct gcagtcggct actttcagtg gcagaagagg ccacatctgc ttcctgtagg
61 ccctctgggc agaagcatgc gctggtgtct cctcctgatc tgggcccagg ggctgaggca
121 ggctcccctc gcctcaggaa tgatgacagg cacaatagaa acaacgggga acatttctgc
181 agagaaaggt ggctctatca tcttacaatg tcacctctcc tccaccacgg cacaagtgac
241 ccaggtcaac tgggagcagc aggaccagct tctggccatt tgtaatgctg acttggggtg
301 gcacatctcc ccatccttca aggatcgagt ggccccaggt cccggcctgg gcctcaccct
361 ccagtcgctg accgtgaacg atacagggga gtacttctgc atctatcaca cctaccctga
421 tgggacgtac actgggagaa tcttcctgga ggtcctagaa agctcagtgg ctgagcacgg
481 tgccaggttc cagattccat tgcttggagc catggccgcg acgctggtgg tcatctgcac
541 agcagtcatc gtggtggtcg cgttgactag aaagaagaaa gccctcagaa tccattctgt
601 ggaaggtgac ctcaggagaa aatcagctgg acaggaggaa tggagcccca gtgctccctc
661 acccccagga agctgtgtcc aggcagaagc tgcacctgct gggctctgtg gagagcagcg
721 gggagaggac tgtgccgagc tgcatgacta cttcaatgtc ctgagttaca gaagcctggg
781 taactgcagc ttcttcacag agactggtta gcaaccagag gcatcttctg gaagatacac
841 ttttgtcttt gctattatag atgaatatat aagcagctgt actctccatc agtgctgcgt
901 gtgtgtgtgt gtgtgtatgt gtgtgtgtgt tcagttgagt gaataaatgt catcctcttc
961 tccatcttca tttccttggc cttttcgttc tattccattt tgcattatgg caggcctagg
1021 gtgagtaacg tggatcttga tcataaatgc aaaattaaaa aatatcttgacctggtttta
1081 aatctggcag tttgagcaga tcctatgtct ctgagagaca cattcctcataatggccagc
1141 attttgggct acaaggtttt gtggttgatg atgaggatgg catgactgcagagccatcct
1201 catctcattt tttcacgtca ttttcagtaa ctttcactca ttcaaaggcaggttataagt
1261 aagtcctggt agcagcctct atggggagat ttgagagtga ctaaatcttggtatctgccc
1321 tcaagaactt acagttaaat ggggagacaa tgttgtcatg aaaaggtattatagtaagga
1381 gagaaggaga catacacagg ccttcaggaa gagacgacag tttggggtgaggtagttggc
1441 ataggcttat ctgtgatgaa gtggcctggg agcaccaagg ggatgttgaggctagtctgg
1501 gaggagcagg agttttgtct agggaacttg taggaaattc ttggagctgaaagtcccaca
1561 aagaaggccc tggcaccaag ggagtcagca aacttcagat tttattctctgggcaggcat
1621 ttcaagtttc cttttgctgt gacatactca tccattagac agcctgatacaggcctgtag
1681 cctcttccgg ccgtgtgtgc tggggaagcc ccaggaaacg cacatgcccacacagggagc
1741 caagtcgtag catttgggcc ttgatctacc ttttctgcat caatacactcttgagccttt
1801 gaaaaaagaa cgtttcccac taaaaagaaa atgtggattt ttaaaatagggactcttcct
1861 aggggaaaaa ggggggctgg gagtgataga gggtttaaaa aataaacaccttcaaactaa
1921 cttcttcgaa cccttttatt cactccctga cgactttgtg ctggggttggggtaactgaa
1981 ccgcttattt ctgtttaatt gcattcaggc tggatcttag aagacttttatccttccacc
2041 atctctctca gaggaatgag cggggaggtt ggatttactg gtgactgattttctttcatg
2101 ggccaaggaa ctgaaagaga atgtgaagca aggttgtgtc ttgcgcatggttaaaaataa
2161 agcattgtcc tgcttcctaa gacttagact ggggttgaca attgttttagcaacaagaca
2221 attcaactat ttctcctagg atttttatta ttattatttt ttcacttttctaccaaatgg
2281 gttacatagg aagaatgaac tgaaatctgt ccagagctcc aagtcctttggaagaaagat
2341 tagatgaacg taaaaatgtt gttgtttgct gtggcagttt acagcatttttcttgcaaaa
2401 ttagtgcaaa tctgttggaa atagaacaca attcacaaat tggaagtgaactaaaatgta
2461 atgacgaaaa gggagtagtg ttttgatttg gaggaggtgt atattcggcagaggttggac
2521 tgagagttgg gtgttattta acataattat ggtaattggg aaacatttataaacactatt
2581 gggatggtga taaaatacaa aagggcctat agatgttaga aatgggtcaggttactgaaa
2641 tgggattcaa tttgaaaaaa atttttttaa atagaactca ctgaactagattctcctctg
2701 agaaccagag aagaccattt catagttgga ttcctggaga catgcgctatccaccacgta
2761 gccactttcc acatgtggcc atcaaccact taagatgggg ttagtttaaatcaagatgtg
2821 ctgttataat tggtataagc ataaaatcac actagattct ggagatttaatatgaataat
2881 aagaatacta tttcagtagt tttggtatat tgtgtgtcaa aaatgataatattttggatg
2941 tattgggtga aataaaatat taacattaaa aaaaaaaa(SEQ ID NO：1)
在一些实施方式中，提供了靶向小鼠TIGIT核酸的反义化合物。在一些实施方式中，所述小鼠TIGIT核酸是GENBANK登录号EU675311.1所示的序列(以SEQ ID NO：52并入本文)。
1 gccagtttca gttggaggag aggccacatc cactttgctg taggcctctg gttagaagca
61 tgcatggctg gctgctcctg gtctgggtcc aggggctgat acaggctgcc ttcctcgcta
121 caggagccac agcaggcacg atagatacaa agaggaacat ctctgcagag gaaggtggct
181 ctgtcatctt acagtgtcac ttctcctctg acacagctga agtgacccaa gtcgactgga
241 agcagcagga ccagcttctg gccatttata gtgttgacct ggggtggcat gtcgcttcag
301 tcttcagtga tcgggtggtc ccaggcccca gcctaggcct caccttccag tctctgacaa
361 tgaatgacac gggagagtac ttctgtacct atcatacgta tcctggtggg atttacaagg
421 ggagaatatt cctgaaggtc caagaaagct cagtggctca gttccagact gccccgcttg
481 gaggaaccat ggctgctgtg ctgggactca tttgcttaat ggtcacagga gtgactgtac
541 tggctagaaa gaagtctatt agaatgcatt ctatagaaag tggccttggg agaacagaag
601 cggagccaca ggaatggaac ctgaggagtc tctcatcccc tggaagccct gtccagacac
661 aaactgcccc tgctggtccc tgtggagagc aggcagaaga tgactatgct gacccacagg
721 aatactttaa tgtcctgagc tacagaagcc tagagagctt cattgctgta tcgaagactg
781 gctaacgaca gctctctatc cctctcccta tgtctctctc tctgtctctc tctgtctctc
841 tctgtctctg tctctgtctc tgtctctctc tctctctctc tctctctctc tgtgtgtgtg
901 tgtgtgtatg tgtgtataca tcattaatgt tcattaacac taactgcata tggtggagga
961 ccaggaaata aaagtttgtg ttgctaataa aattaagtgc taactt(SEQ ID NO：52)
一些实施方式提供了靶向TIGIT的化合物，其中所述化合物包括12至30个连接的核苷。在一些实施方式中，所述化合物由15至30、18至24、19至22、13至25、14至25或15至25个连接的核苷组成。在一些实施方式中，所述化合物包括至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或30个连接的核苷。在一些实施方式中，所述化合物由20个连接的核苷组成。在一些实施方式中，所述化合物由22个连接的核苷组成。
一些实施方式提供了靶向TIGIT的化合物，其中所述化合物由12至30个连接的核苷组成，并且，所述化合物的核碱基序列包括SEQ ID NO：1的任何核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21或22个连续核碱基。在一些实施方式中，所述化合物的核碱基序列包括SEQ IDNO：1的任一核碱基序列的至少12个连续核碱基。
一些实施方式提供了靶向TIGIT的化合物，其中所述化合物包括至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21或22个连续核碱基，所述核碱基与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：27-51中任一个的相等长度部分互补。
一些实施方式提供了靶向TIGIT片段的化合物，其中所述化合物包括至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21或22个连续核碱基，所述核碱基与表1所示的任何目的片段的相等长度部分互补。在该表中，“起始位点”指的是目的片段的最5’核苷酸，“终止位点”指的是目的片段的最3’核苷酸。目的片段的范围可以从表中列出的每个序列的起始位点到终止位点。或者，目标片段的范围可以从一个序列的起始位点开始，到另一序列的终止位点结束。例如，如表1所示，目的片段的范围可以为151-172，即SEQ ID NO：27的起始位点到终止位点。在另一个实例中，如表1所示，目的片段的范围可以是319-440，即SEQ ID NO：29的起始位点到SEQ IDNO：32的终止位点。
一些实施方式提供了靶向TIGIT的化合物，其中所述化合物的碱基序列与SEQ IDNO：1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。一些实施方式提供了靶向TIGIT的化合物，其中所述化合物的碱基序列与如表1所示的任何目的片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基121-300、301-600、601-780、900-1250、1251-1440或1920-2400区域内的任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基100至300、150至250、175至225、180至220、50至250、100至250、150至350、150至300、300至500、350至450、375至425、385至425、250至450、300至450、300至550、350至550或350至500、300至800、500至800、550至750、800至1150、900至1250、1150至1400、1200至1350、1225至1325、1240-1300、1050至1350、1100至1350、1200至1450、1200至1400、1400至1700、1650至1800、1650至2160、1650至2200、1600至1900、1900至2200、1900至2400、2160至2500、2300至2600、2700至2800或2500至2978区域内的任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基100至300、150至250、175至225、180至220、50至250、100至250、150至350或150至300区域内的任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基300至500、350至450、375至425、385至425、250至450、300至450、300至550、350至550、或350至500、300至800、500至800、550至750、800至1150、900至1250区域内的任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基1150至1400、1200至1350、1225至1325、1240至1300、1050至1350、1100至1350、1200至1450、1200至1400区域内的任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基1400至1700、1650至1800、1650至2160、1650至2200、1600至1900、1900至2200、1900至2400、2160至2500、2300至2600、2700至2800或2500至2978区域内的任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基300至800区域内的任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基300至450区域内的任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基300至550区域内任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基900至1250区域内任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基1600至1900区域内任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基1650至2200区域内任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基1650至2160区域内任意位置。
在一些实施方式中，基因沉默化合物靶向SEQ ID NO：1的核碱基1900至2200区域内任意位置。
在这些实施方式中，还包括靶向指定区域内的SEQ ID NO：1区域(即指定区域内的子区域)的基因沉默化合物。
一些实施方式提供了靶向TIGIT的化合物，其中所述化合物由12至30个连接的核苷组成，并且，所述化合物的核碱基序列包括SEQ ID NO：2-26的任意核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21或22个连续核碱基。在一些实施方式中，所述化合物的核碱基序列包括SEQID NO：2-26中任一个核碱基序列的至少12个连续核碱基。在一些实施方式中，所述化合物由SEQ ID NO：2-26中的任何一个组成。
一些实施方式提供了如本文所述的靶向TIGIT的反义化合物，其中所述化合物是单链。
一些实施方式提供了如本文所述的靶向TIGIT的反义化合物，其中所述寡核苷酸是未修饰的。
一些实施方式提供了如本文所述的靶向TIGIT的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个修饰的核苷间键。在一些实施方式中，所述修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方式中，修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，超过一半但少于全部的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，所有的核苷酸间键是硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，硫代磷酸酯键可以是Rp和Sp对映体的混合物，或它们可以被制造成立构规整或基本立构规整的Rp或Sp形式的任意一个。
一些实施方式提供了如本文所述的靶向TIGIT的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个修饰核苷酸间键，并且其中寡核苷酸的核苷酸包括天然存在的核碱基和糖。
一些实施方式提供了如本文所述的靶向TIGIT的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个修饰的核苷酸间键，并且其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸包括修饰的核碱基、修饰的糖或它们的组合。
在一些实施方式中，修饰的核碱基选自：通用碱基、疏水碱基、混杂碱基(promiscuous base)、扩径碱基(size-expanded base)和氟化碱基，如本文所定义。5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶，以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶(6-azo uracil)、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟代甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步修饰的核碱基包括：三环嘧啶，如苯恶嗪胞苷([5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G型夹(G-clamp)，如取代的吩恶嗪胞苷(如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶基[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶基[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶基-2-酮)。修饰的核碱基也可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。在一些实施方式中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方式中，修饰的糖是双环糖。在一些实施方式中，修饰的糖包括2'-O-甲氧基乙基、约束的乙基(constrained ethyl)、3'-氟代-HNA或4'-(CH2)n-O-2'桥，其中n是1或2。
一些实施方式提供了一种化合物，所述化合物包含靶向TIGIT的修饰的寡核苷酸，其中，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且所述修饰的寡核苷酸包括：(a)由连接的脱氧核苷组成的缺口片段；(b)由连接的核苷组成的5’侧翼片段；(c)由连接的核苷组成的3’侧翼片段；并且，缺口片段位于5’侧翼片段和3’侧翼片段之间，每个侧翼片段的每个核苷包含修饰的糖。
一些实施方式提供了一种化合物，所述化合物包含靶向TIGIT的修饰的寡核苷酸，其中，所述修饰的寡核苷酸由22个连接的核苷组成，并且所述修饰的寡核苷酸包括：(a)由12个连接的脱氧核苷组成的缺口片段；(b)由5个连接的核苷组成的5’侧翼片段；(c)由5个连接的核苷组成的3’侧翼片段；并且，缺口片段位于5’侧翼片段和3’侧翼片段之间，每个侧翼片段的每个核苷包含2'-O-甲氧基乙基糖，至少一个核苷间键是硫代磷酸酯键，每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
一些实施方式提供一种化合物，所述化合物包含靶向TIGIT的修饰的寡核苷酸，其中，所述修饰的寡核苷酸由22个连接的核苷组成，并且，所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列包括SEQ ID NO：2-26中任何一个的至少8个连续核碱基，所述修饰的寡核苷酸包括：(a)由12个连接的脱氧核苷组成的缺口片段；(b)由5个连接的核苷组成的5'侧翼片段；(c)由5个连接的核苷组成的3’侧翼片段；并且，缺口片段位于5’侧翼片段和3’侧翼片段之间，每个侧翼片段的每个核苷包含2'-O-甲氧基乙基糖，至少一个核苷间键是硫代磷酸酯键，每个胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在一些实施方式中，目的核酸是RNA。在一些实施方式中，目的核酸是非编码RNA。在一些实施方式中，目的核酸编码蛋白。在一些实施方式中，目的核酸选自mRNA、前体mRNA、微小RNA、非编码RNA，包括小非编码RNA和启动子导向RNA。
在一些实施方式中，本发明提供的反义寡核苷酸具有与目的核酸互补的序列。这些反义化合物能与目的核酸杂交，产生至少一种反义活性。在一些实施方式中，反义化合物特异性地杂交至一个或多个目的核酸。在一些实施方式中，特异性杂交反义化合物的核碱基序列包括这样的区域：所述区域与目的核酸充分互补(使得可以杂交并产生反义活性)且对任何非目的序列的互补性不足(从而避免或减少了在需要特异性杂交的情况下(例如在用于体内或治疗的生理条件下，以及在体外试验的情况下进行试验的条件下)与非目的核酸序列的非特异性杂交)。在一些实施方式中，寡核苷酸在目的分子和非目的分子之间具有选择性，即使目的分子和非目的分子都包括目的序列。在这样的实施方式中，选择性可以来自于一个核酸分子的目的区域相对于另一个的相对可及性。
在一些实施方式中，本公开提供了反义化合物，所述反义化合物包括在寡核苷酸的整个长度上与目的核酸完全互补的寡核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸与目的核酸99％互补。在一些实施方式中，寡核苷酸与目的核酸95％互补。在一些实施方式中，这些寡核苷酸与目的核酸90％互补。
在一些实施方式中，这些寡核苷酸与目的核酸85％互补。在一些实施方式中，这些寡核苷酸与目的核酸80％互补。在一些实施方式中，反义化合物包括与目的核酸完全互补的区域并且与目的核酸在寡核苷酸的整个长度上80％互补。在这些实施方式中，完全互补区的长度是6至14个核碱基。
在一些实施方式中，寡核苷酸包括杂交区和终止区。在这些实施方式中，杂交区由12-30个连接的核苷组成，并且与目的核酸完全互补。在一些实施方式中，杂交区相对于目的核酸包括1个错配。在一些实施方式中，杂交区相对于目的核酸包括2个错配。在一些实施方式中，杂交区相对于目的核酸包括3个错配。在一些实施方式中，终止区由1-4个终止核苷组成。在一些实施方式中，终止核苷位于3'末端。在一些实施方式中，一个或多个终止核苷与目的核酸不互补。
反义机制包括任何涉及寡核苷酸与目的核酸的杂交的机制，其中所述杂交导致生物效应。在一些实施方式中，这种杂交会导致目的核酸降解或占用，并伴随细胞机制的抑制或刺激，所述细胞机制涉及例如目的核酸的翻译、转录或剪接。
一种涉及目的RNA降解的反义机制是RNase H介导的反义。RNase H是细胞的核酸内切酶，其切割RNA:DNA双链体的RNA链。本领域中已知，“类DNA”的单链反义化合物会引起哺乳动物细胞的RNase H活性。因此，RNaseH的激活导致RNA目的物的裂解，从而大大提高了类DNA寡核苷酸介导的基因表达抑制的效率。
本发明的合成的反义化合物可以通过本领域公认的方法制备，如可以手动或通过自动合成仪进行的氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学反应。本发明的合成的反义化合物也可以以多种方式修饰而不损害它们与mRNA杂交的能力。
在一些实施方式中，本发明的基于寡核苷酸的化合物通过线性合成方法合成。
合成的另一种方式是“平行合成”，其中合成从中央连接部分向外进行。如美国专利5,912,332所述，固相支持物附着的连接物可用于平行合成。或者，可以使用通用固体支持物(例如磷酸盐附着的可控孔玻璃)。
在通过线性合成或平行合成方案进行的合成结束时，如果掺入修饰的核苷，则本发明的基于寡核苷酸的化合物可以方便地用浓氨溶液脱保护或按照亚磷酰胺供应商的说明进行脱保护。基于寡核苷酸的化合物产物优选通过反相HPLC纯化、去三苯甲基、脱盐和渗析。
在一些实施方式中，根据本发明的反义化合物的寡核苷酸选自表1所示的寡核苷酸的非限制性列表。除非另有说明，否则目的序列和反义寡核苷酸相对于SEQ ID NO：1所示的人TIGIT核酸序列。表1所示的寡核苷酸具有硫代磷酸酯(PS)键，但也可以包括磷酸二酯键。本领域技术人员将会认识到，可以包括基于磷酸二酯或非磷酸二酯部分的其它键。
表1
Figure BDA0003019885170000171
Figure BDA0003019885170000181
一些实施方式提供了一种组合物，其包含如本文所述的反义寡核苷酸化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。一些实施方式提供了一种组合物，其包含如本文所述的两种或多种化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。所述两种或多种化合物可以与TIGIT的相同目的区域和/或片段或不同目的区域和/或片段互补。
在一些实施方式中，本发明提供一种组合物，其包含本发明的化合物和第二药剂，所述第二药剂包括但不限于：一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒性药物、化学治疗药物(传统化学疗法和现代靶向疗法)、放射线、激酶抑制剂、过敏原、抗生素、激动剂、拮抗剂、反义寡核苷酸、核糖酶、RNAi分子、siRNA分子、miRNA分子、核酸适配体、蛋白、基因疗法载体、DNA疫苗、佐剂、共刺激分子或它们的组合。
一些实施方式提供了组合物和方法，所述方法包括给动物施用本文所述的反义化合物或组合物。在一些实施方式中，施用所述反义化合物预防、治疗、改善或减慢癌症、炎性疾病和病毒感染的进展，所述癌症例如黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、小细胞或非小细胞肺癌、肝细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、食管鳞状细胞癌、梅克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、微卫星不稳定性高癌(microsatellite instability high cancer)或膀胱尿路上皮癌，所述炎性疾病例如系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和败血症，所述病毒感染例如HIV、乙型肝炎或丙型肝炎。
一些实施方式提供了如本文所述的反义化合物、组合物和方法用于治疗TIGIT相关的疾病、紊乱或病况。在一些实施方式中，TIGIT水平在动物体内升高。在一些实施方式中，靶向TIGIT的所述化合物用于治疗、预防、减慢进展或改善疾病、紊乱或病况。在一些实施方式中，用于治疗的所述组合物和方法包括给有需要的个体施用TIGIT特异性抑制剂。
一些实施方式提供降低TIGIT水平的组合物和方法。一些实施方式提供降低动物的TIGIT mRNA或蛋白表达的组合物和方法，包括给所述动物施用本文所述的反义化合物或组合物以降低动物的TIGIT mRNA或蛋白表达。
在一些实施方式中，提供了治疗疾病或紊乱的方法，其中，降低TIGIT的表达有助于所述疾病或紊乱的治疗，包括给动物施用本文所述的化合物或组合物以降低动物的TIGIT mRNA或蛋白表达。在一些实施方式中，所述动物是人。
一些实施方式提供了用于在有需要的受试者中预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善TIGIT相关疾病、紊乱和病况的组合物和方法。在一些实施方式中，这些疾病、紊乱和病况包括癌症、炎性疾病和病毒感染。某些此类癌症包括但不限于：黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、小细胞和非小细胞肺癌、肝细胞癌、胃食管癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、食管鳞状细胞癌、梅克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、微卫星不稳定性高癌或尿路上皮膀胱和尿路和肾细胞癌。一些实施方式提供了用于预防、治疗、延迟、减慢进展和/或改善癌症的组合物和方法。
在一些实施方式中，TIGIT表达的调节发生在细胞、组织和器官。在一些实施方式中，所述调节发生在动物的细胞、组织或器官。在一些实施方式中，所述调节是TIGIT mRNA水平的降低。在一些实施方式中，所述调节是TIGIT蛋白水平的降低。在一些实施方式中，TIGIT mRNA和蛋白水平均降低。这种降低可以以时间依赖或剂量依赖的方式发生。
在一些实施方式中，所述受试者或动物是人。
在本发明的任何方法中，本发明的化合物单独施用或与其他药剂联合施用，可以通过任何合适的途径施用，包括但不限于：肌内、肠胃外、粘膜、口服、舌下、瘤内、透皮、局部、吸入、鞘内、鼻内、气雾剂、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴剂或以滴眼剂或漱口剂形式。在本发明的任何方法中，本发明的化合物单独施用或与其它药剂联合施用，可以直接施用至组织和器官，例如但不限于：膀胱、肝、肺、肾或肺。在一些实施方式中，本发明的化合物通过肌内给药单独施用或与其它药剂联合施用。在一些实施方式中，本发明的基因沉默化合物通过黏膜给药单独施用或与其它药剂联合施用。在一些实施方式中，本发明的基因沉默化合物通过口服给药单独施用或与其它药剂联合施用。在一些实施方式中，本发明的基因沉默化合物通过瘤内给药单独施用或与其它药剂联合施用。
在一些实施方式中，反义化合物经肠胃外给药。在进一步的实施方式中，所述肠胃外给药是皮下给药。
在一些实施方式中，反义化合物或组合物与第二药剂或疗法共同施用。在一些实施方式中，反义化合物或组合物与第二药剂伴随(concomitantly)施用。
在一些实施方式中，第二药剂包括但不限于：一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒性药物、化学治疗药物(传统化学疗法和现代靶向疗法)、激酶抑制剂、过敏原、抗生素、激动剂、拮抗剂、反义寡核苷酸、核糖酶、RNAi分子、siRNA分子、miRNA分子、核酸适配体、肽、靶向治疗剂、蛋白、基因疗法载体、DNA疫苗、佐剂、共刺激分子或它们的组合。药剂或疗法可以共同施用或伴随施用。药剂或疗法可以依次施用或随后施用。
一些实施方式提供了靶向TIGIT的反义化合物用于降低动物的TIGIT水平的用途。一些实施方式提供了靶向TIGIT的反义化合物用于治疗、预防或改善TIGIT相关的疾病、紊乱或病况的用途。
一些实施方式提供了靶向TIGIT的反义化合物在制备用于降低动物TIGIT水平的药物中的用途。一些实施方式提供了反义化合物在制备药物中的用途，该药物用于治疗、预防或改善TIGIT相关的疾病、紊乱或病况。
本发明的化合物的治疗性组合物的施用可以使用已知方法进行，使用有效量并且持续一定时间以有效地减轻疾病的症状或替代标志物。例如，本发明的化合物用于治疗疾病和/或紊乱的有效量可以是缓解或减少症状或者延迟或改善疾病和/或紊乱所需的量。在施用调节基因表达的组合物的情况下，本发明的化合物的有效量是与不存在本发明的化合物时的基因表达相比足以实现所需调节的量。对于任何特定应用，有效量可能会因以下因素而有所不同，例如所治疗的疾病或病况、施用的特定化合物、受试者的体型，或疾病或病况的严重性。本领域普通技术人员可以凭经验确定特定化合物的有效量，而无需进行不必要的实验。
当全身给药时，优选治疗性组合物以足以使本发明的化合物的血液水平达到约0.0001微摩尔至约10微摩尔的剂量施用。对于局部给药，比此浓度低得多的浓度可能是有效的，并且可以容许高得多的浓度。优选地，本发明的化合物的总剂量为约0.001mg/患者/天至约200mg/kg体重/天。在一些实施方式中，总剂量可以为0.08、0.16、0.32、0.48、0.32、0.64、1、10或30mg/kg体重，每天、每周两次或每周施用。将治疗有效量的本发明的一种或多种治疗性组合物同时或依次作为单次治疗周期给个体施用可能是理想的。
本发明该方面的方法有助于基因表达的模型研究。该方法还可用于人或动物疾病的预防或治疗。例如，该方法有助于儿科和兽医对基因表达的抑制应用。
一些实施方式提供了用于治疗、预防或改善本文所述的疾病、紊乱或病况的试剂盒，其中，试剂盒包括：(i)本文所述的TIGIT特异性抑制剂；以及可选地，(ii)本文所述的第二药剂或疗法。本发明的试剂盒还可包括使用该试剂盒治疗、预防或改善本文所述的疾病、紊乱或病况的操作说明。
实施例
以下实施例说明了本公开的一些实施方式，并且是非限制性的。此外，虽然提供了具体的实施方式，发明人已预期这些具体实施方式的通用应用。
实施例1-反义寡核苷酸的合成
使用自动DNA/RNA合成仪(Mermade6，BioAutomation，得克萨斯州)，在固体支持物上，利用β-氰基亚磷酰胺化学过程，以10μmol的规模合成所有寡核苷酸。dA、dC、dG和T的亚磷酰胺在自动DNA/RNA合成仪上按所需顺序依次连接。粗寡核苷酸用氢氧化铵浓缩物在55℃处理过夜，使其去保护并从固相支持物切割。通过预制备的阴离子交换HPLC纯化粗寡核苷酸。纯化的寡核苷酸在C18柱中脱盐并且用大体积灭菌水透析过夜。寡核苷酸溶液用灭菌滤膜过滤(0.2μm或0.45μm HT Tuffryn Membrane，颇尔公司)并且冻干，得到最终产物。所有寡核苷酸分别通过IE-HPLC(Waters 600，Waters 486 260nm可调吸光度检测器，Empower软件)和MALDI-TOF质谱仪(携带337nm N2激光的Waters MALDI-ToF质谱仪)鉴定纯度和分子量。通过离子交换HPLC测定全长寡核苷酸的纯度范围在95-98％，剩余寡核苷酸缺少一个或两个核苷酸。所有寡核苷酸通过Limulus分析仪(Bio-Whittaker)测定内毒素水平，控制内毒素水平<0.1EU/mg。
实施例2-体外筛选TIGIT反义寡核苷酸
为了鉴定潜在的人TIGIT反义物，在人HeLa和/或NTERA-2细胞系(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)中筛选靶向TIGIT mRNA的反义寡核苷酸(ASO)，评估其与加扰对照寡核苷酸相比对人TIGIT mRNA表达的影响。将5×105个细胞接种至12孔组织培养板并且在37℃，5％CO2培养过夜。转染当天，将新鲜的培养基加至每孔。在50μl无血清培养基中制备浓度为25和50nM的反义寡核苷酸，并将其与含有3μl的
Figure BDA0003019885170000211
(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)的50μl无血清培养基混合。将混合物在室温孵育10分钟，然后加至培养板。然后，将板子在37℃，5％CO2培养48小时。根据生产商的说明书使用RNeasy Mini(Qiagen，日耳曼敦，马里兰州)提取总RNA。通过紫外分光光度计在260/280nm波长处测定RNA浓度。对于cDNA的合成，根据生产商的说明书，使用High-Capacity cDNA反转录试剂盒(赛默飞世尔科技)将1μg总RNA转录。通过实时定量PCR测定人TIGIT mRNA表达水平。简要地，将约75μg的cDNA与10μl的TaqManTM快速高级预混液(赛默飞世尔科技)和1μl人TIGIT基因表达探针(Hs00545087_m1，赛默飞世尔科技)或1μl人HPRT1基因表达探针(Hs02800695_m1，赛默飞世尔科技)混合。使用StepOnePlusTM实时PCR系统(赛默飞世尔科技)进行实时定量PCR，并且使用StepOne软件版本2(赛默飞世尔科技)计算TIGIT基因的相对表达。结果如表2所示。
表2.
Figure BDA0003019885170000221
Figure BDA0003019885170000231
使用小鼠TIGIT反义寡核苷酸(mTIGIT ASO)(5’-GCTGTCGTTAGCCAGTCTTCGATAC-3’)(SEQ ID NO：53)来分析其对小鼠CT26.CL25细胞系(ATCC)中小鼠TIGIT mRNA表达的影响。将5×105个细胞接种至12孔组织培养板并且在37℃，5％CO2培养过夜。转染当天，将新鲜的培养基加至每孔。在50μl无血清培养基中制备浓度为0.21、0.62、1.85、5.56、16.67和50nM的反义寡核苷酸，并将其与含有3μl的
Figure BDA0003019885170000232
(赛默飞世尔科技)的50μl的无血清培养基混合。将混合物在室温孵育10分钟然后加至培养板。然后，将板子在37℃，5％CO2培养48小时。根据生产商的说明书使用RNeasy Mini(Qiagen)提取总RNA。通过紫外分光光度计在260/280nm波长处测定RNA浓度。对于cDNA的合成，根据生产商的说明书，使用HighCapacity cDNA(赛默飞世尔科技)将1μg总RNA转录。通过实时定量PCR测定小鼠TIGIT mRNA表达水平。简要地，将约75μg的cDNA与10μl的Fast TaqMan分析缓冲液(赛默飞世尔科技)和1μl的小鼠TIGIT基因表达探针(Mm03807522_m1，赛默飞世尔科技)或1μl的小鼠HPRT1基因表达探针(Mm01324427_m1，赛默飞世尔科技)混合。使用StepOnePlus PCR仪进行实时定量PCR(赛默飞世尔科技)，并且使用StepOne软件版本2(赛默飞世尔科技)计算TIGIT基因的相对表达。小鼠TIGIT反义寡核苷酸(mTIGITASO)同系物显示出对小鼠CT26.CL25细胞系中小鼠TIGIT mRNA的有效抑制作用(图1)。
实施例3-体内实验评估抑制TIGIT的抗肿瘤活性
为了确定通过ASO敲低TIGIT会影响T细胞和NK细胞功能，在小鼠肿瘤模型中评估了单独的hTIGIT小鼠同系物或与抗PD-1抗体结合的hTIGIT小鼠同系物。
使用小鼠CT26.CL25肿瘤模型分析小鼠TIGIT抑制的体内效果。6-8周龄的BALB/c雌性小鼠皮下两侧注射3x106个小鼠结肠癌CT26.CL25(ATCC)细胞，以建立实体肿瘤。在肿瘤移植后的第4天，当肿瘤体积达到50至150mm3之间时，开始治疗。将荷瘤小鼠随机分成3个处理组(n＝10个小鼠/组)。将100μl PBS中的对照寡聚体(15mg/kg)、5或15mg/kg的mTIGITASO通过瘤内注射(i.t)施用至右侧肿瘤，在第4、7、11、13和15天注射，一共注射5次。两周一次卡尺测量并使用公式：体积＝(宽度)2×长度/2，来计算肿瘤体积。用mTIGIT ASO治疗的荷瘤小鼠在注射和未注射的肿瘤中均表现出剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用(图2)。在第15天收集来自15mg/kg的mTIGIT ASO和对照寡聚体处理组的肿瘤样品，并将其存储在10％甲醛缓冲液中。通过Mass Histology Service(伍斯特，马赛诸塞州)制备组织切片，并使用抗小鼠CD3抗体对CD3+T细胞染色。与对照寡聚体注射的肿瘤相比，对小鼠TIGIT表达的抑制导致了肿瘤浸润CD3+T淋巴细胞的增加(白色箭头表示)(图3)。
据报道，TIGIT主要地表达在NK和一些T细胞1。考虑到TIGIT的功能是NK和T细胞免疫功能的负调控因子1,2，抑制TIGIT可能导致这些细胞群体的活化。为了评估TIGIT ASO对NK和CD8+T细胞功能的作用，在NK或CD8+T细胞耗竭的小鼠肿瘤模型中进行研究。在第0天将3×106个小鼠结肠癌CT26.CL25细胞皮下注射至BALB/c小鼠右侧，以建立实体肿瘤。在第1、4、8和12天，分别腹腔注射50μl的Ultra-LEAFTM纯化的抗Asialo-GM1抗体(n＝10，Biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚)或25mg/kg抗小鼠CD8单克隆抗体(n＝8，克隆号YTS169.4；订购编号BE0117，BioXcell，西莱巴嫩，新罕布什尔州)，使NK细胞或CD8+T细胞耗竭。没有T细胞耗竭的荷瘤小鼠(n＝10)、NK或CD8+耗竭的荷瘤小鼠通过瘤内注射15mg/kg进行治疗，在第5、8、11、12和13天注射，一共注射5次。NK或CD8+细胞的耗竭不影响肿瘤生长。按照相同的注射安排，对幼稚
Figure BDA0003019885170000241
荷瘤小鼠瘤内注射15mg/kg对照寡聚体。两周一次卡尺测量并使用公式：体积＝(宽度)2×长度/2，来计算肿瘤体积。
在最后一次mTIGIT ASO或对照寡聚体处理后2天，收集血浆样品，通过ELISA测定干扰素-γ的水平。根据生产商的说明书，使用小鼠干扰素-γQuantikine ELISA试剂盒(R&DSystems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)进行ELISA分析。mTIGIT ASO的肿瘤生长抑制作用在NK细胞(图4A)和CD8+细胞(图4B)耗竭的荷瘤小鼠中被废除。这进一步支持了mTIGIT ASO靶向TIGIT基因表达(TIGIT表达在NK细胞和一些T细胞，包括CD8+T细胞)。进一步，mTIGIT ASO处理导致NK细胞关键细胞因子IFN-γ的产生增加(图4C)。通过NK细胞耗竭而不是CD8+T细胞耗竭废除了TIGIT抑制引起的IFN-γ产生增加(图4C)。这进一步支持了mTIGIT ASO抑制TIGIT表达和激活NK细胞。
基于以上内容，并且不希望受限于任何特定理论，认为对于局部给药，未修饰的ASO相对于修饰的ASO具有优势，因为未修饰的ASO的电荷可能会导致其在局部位点的停留时间更长。为了评估这种假设，同时修饰5个mTIGIT ASO的寡核苷酸的5’和3’末端得到2’-O-甲基核糖核苷酸，并比较它与原版的抗肿瘤活性。6-8周龄的BALB/c雌性小鼠在右侧皮下注射3×106个小鼠结肠癌CT26.CL25(ATCC)细胞，建立实体肿瘤。肿瘤移植后的第4天，当肿瘤体积达到50至150mm3之间时，开始治疗。荷瘤小鼠随机分成3个处理组(n＝10小鼠/组)。将对照寡聚体(15mg/kg)，15mg/kg的mTIGIT ASO或15mg/kg的mTIGIT 2’-OMe ASO(其中将100μl的PBS中的5个mTIGIT 2’-OMe ASO通过瘤内注射(i.t)施用至肿瘤，在第4、7、11、13和15天注射，一共注射5次)。两周一次卡尺测量并使用公式：体积＝(宽度)2×长度/2，来计算肿瘤体积。虽然2’-O-甲基修饰仍具有一些抗肿瘤活性，但是它的效力大大减少(图5)，说明与2’-O-甲基或2’-O-甲氧基乙基修饰的反义寡聚体相比，未修饰的反义寡聚体可能更适合瘤内给药。
与检查点抑制剂单一疗法相比，由于抑制TIGIT可以再活化NK和T细胞，因此与其他检查点抑制剂联合使用可在治疗癌症方面提供治疗优势。当在小鼠肿瘤模型中同时靶向mTIGIT和PD-1时，观察到协同的肿瘤生长抑制作用(图6)。
参考文献
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Claims (35)

1.合成的寡核苷酸化合物，其中，所述合成的寡核苷酸化合物包含12至30个硫代磷酸酯连接的核苷酸，所述合成的寡核苷酸化合物具有与SEQ ID NO：1的相等长度部分互补的至少12个连续核碱基，所述寡核苷酸的每个核苷酸包含天然核碱基和天然糖。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物的长度是15至25个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物在其全长上与SEQ ID NO：1的部分至少80％互补。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中，所述化合物在其全长上与SEQ ID NO：1的部分至少90％互补。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26的至少12个连续核碱基。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26的至少12个连续核碱基，并且，所述化合物与SEQ ID NO：1中的所述化合物的目的序列至少80％互补。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中，所述化合物与SEQ ID NO：1中的所述化合物的目的序列至少90％互补。
8.合成的寡核苷酸化合物，其中，所述合成的寡核苷酸化合物包含12至30个硫代磷酸酯连接的核苷酸，所述化合物的核碱基序列与SEQ ID NO：1的相等长度部分至少80％互补，所述寡核苷酸的每个核苷酸包含天然核碱基和天然糖。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中，所述化合物的长度是15至25个核苷酸。
10.根据权利要求8所述的化合物，其中，所述化合物在其全长上与SEQ ID NO：1的部分至少90％互补。
11.根据权利要求8所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26的至少12个连续核碱基。
12.根据权利要求8所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26的至少12个连续核碱基，并且，所述化合物与SEQ ID NO：1中的所述化合物的目的序列至少80％互补。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中，所述化合物与SEQ ID NO：1中的所述化合物的目的序列至少90％互补。
14.合成的寡核苷酸化合物，其中，所述合成的寡核苷酸化合物包含12至30个硫代磷酸酯连接的核苷酸，所述化合物的核碱基序列与SEQ ID NO：1的核碱基121-780、841-1440、1650至2160或2700至2800的相等长度部分至少80％互补，所述寡核苷酸的每个核苷酸包含天然核碱基和天然糖。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中，所述化合物的长度是15至25个核苷酸。
16.根据权利要求14所述的化合物，其中，所述化合物在其全长上与SEQ ID NO：1的部分至少90％互补。
17.根据权利要求14所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26的至少12个连续核碱基。
18.根据权利要求14所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26的至少12个连续核碱基，并且，所述化合物与SEQ ID NO：1中的所述化合物的目的序列至少80％互补。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中，所述化合物与SEQ ID NO：1中的所述化合物的目的序列至少90％互补。
20.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26。
21.根据权利要求8所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26。
22.根据权利要求14所述的化合物，其中，所述化合物包含SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26。
23.根据权利要求14所述的化合物，其中，所述化合物与SEQ ID NO：1的核碱基121-300、301-600、601-780、900-1250、1251-1440或1920至2400的相等长度部分至少80％互补。
24.一种组合物，其包含权利要求1至23中任一项所述的化合物和药学上可接受的载体。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述组合物还包含一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒性药物、化学治疗药物(传统化学疗法和现代靶向疗法)、放射线、激酶抑制剂、过敏原、抗生素、激动剂、拮抗剂、反义寡核苷酸、核糖酶、RNAi分子、siRNA分子、miRNA分子、核酸适配体、蛋白、基因疗法载体、DNA疫苗、佐剂、共刺激分子或它们的组合。
26.一种抑制TIGIT mRNA或蛋白表达的方法，其中，所述方法包括：使细胞与权利要求1至23中任一项所述的至少一种化合物或权利要求24所述的组合物接触。
27.一种治疗有需要的个体的TIGIT表达和/或活性相关的疾病、紊乱、或病况的方法，其中，所述方法包括：施用权利要求1至23中任一项所述的至少一种化合物或权利要求24所述的组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述疾病、紊乱或病况选自癌症、炎性疾病、病毒感染。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述癌症选自：黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、小细胞或非小细胞肺癌、肝细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、食管鳞状细胞癌、梅克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、微卫星不稳定性高癌或膀胱尿路上皮癌。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述炎性疾病选自：系统性红斑狼疮、系统性硬化症、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和败血症。
31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述病毒感染是艾滋病、乙型肝炎或丙型肝炎。
32.根据权利要求27所述的方法，其中，所述施用是通过肠胃外施用或局部施用。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述肠胃外施用选自皮下注射、静脉输注、肌内、腹膜内或皮内注射。
34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述局部施用选自瘤内注射、膀胱灌注、吸入、鞘内、胸膜腔、淋巴结或器官内注射。
35.根据权利要求27所述的方法，其中，所述方法还包括：施用一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒性药物、化学治疗药物(传统化学疗法和现代靶向疗法)、放射线、激酶抑制剂、过敏原、抗生素、激动剂、拮抗剂、反义寡核苷酸、核糖酶、RNAi分子、siRNA分子、miRNA分子、核酸适配体、蛋白、基因疗法载体、DNA疫苗、佐剂、共刺激分子或它们的组合。
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