CN112834644A - 膀胱癌相关的组合标志物和检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于疾病诊断用生物标志物技术领域，具体涉及膀胱癌相关的组合标志物和检测试剂盒。本发明提供以3‑甲基胞苷，1‑甲基腺苷，假尿嘧啶核苷，1‑甲基鸟苷，3‑甲基尿苷，1‑甲基次黄苷，N4‑乙酰胞苷和N,N‑二甲基鸟苷八种修饰核苷作为组合标志物用于膀胱癌诊断和复发监测。并提供基于LC‑MS检测平台的检测试剂盒，安全无创，省时高效，准确性较高，对膀胱癌有较高的灵敏性和特异性。

Description

膀胱癌相关的组合标志物和检测试剂盒

技术领域

本发明属于疾病诊断用生物标志物技术领域，具体涉及膀胱癌相关的组合标志物。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中发病率和病死率均居首位。临床上一般使用电切术对膀胱癌患者进行治疗，但效果不尽人意，复发率极高，造成病人的生存率大大降低。为了提高膀胱癌患者的生存率，临床上常用三种方法对膀胱癌患者进行早期诊断。膀胱镜检是临床上公认的膀胱癌诊断金标准，属于人体侵入性检查，费用昂贵，且敏感性较低，仅有71％(49-93％)，特异性仅有72％(47–96％)。尿液脱落细胞学检查虽为无创性检查，特异性高达98％，但尿液中细胞数量少，泌尿系结石、感染等对细胞产生干扰导致其诊断困难，敏感性较差，只有44％(38–51％)。除此之外，膀胱癌影像学检查由于其无创性且费用低的优点，在临床也经常用于膀胱癌的检查，但该方法在早期无法发现原位癌和小于5mm的肿瘤，因此临床所需的灵敏性也较低。近年来，由FDA认证的用于检测膀胱癌的分子试剂盒例如膀胱肿瘤抗原(BTA)，核基质蛋白22(NMP-22)等已经问世，但由于缺乏临床诊断膀胱癌所需的灵敏性，且预后效果较差。因此，我们迫切需要发展基于分子水平的高灵敏性，高特异性且准确性高的无创检测方法用于膀胱癌早期诊断及术后复发监测。

近年，关于尿液修饰核苷在肿瘤标志物的研究中颇多。修饰核苷在正常成年人个体间排放的浓度差异较小，浓度分布在较窄的范围。而在肿瘤发生和发展的过程中，RNA修饰酶高度活跃，且tRNA代谢速率远高于正常细胞，修饰核苷大量排泄到体液中，因此尿中修饰核苷的含量基本反映了tRNA的代谢速度，因而成为乳腺癌，头颈癌，胃癌，食道癌，结直肠癌等多种癌症诊断和监测的潜在信号。因此，筛选获得对膀胱癌的早期诊断及术后复发监测具有高灵敏度、高特异性的尿液修饰核苷标志物成为了目前亟待解决的技术问题。

目前用于尿液修饰核苷的定量检测技术主要有三种，首先是二维纤维素薄层析技术分离法，该方法操作简便，灵敏度高，但比较费时。高效液相色谱检测技术(HPLC)比较省时，但只适用于高丰度的修饰核苷。液相色谱与质谱联用检测技术(LC-MS)弥补了前两者的缺陷，除了节约时间，能够检测到尿液中低丰度的修饰核苷外，它还具有较高的专属性，能够较好的分离一些分子量相同的修饰核苷，为更多疾病标志物的筛选提供了有利的工具。因此，LC-MS在尿液修饰核苷含量检测方面具有较大的优势。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供膀胱癌相关的组合标志物，以尿液中的8种修饰核苷标志物的含量变化进行膀胱癌诊断和复发监测，具有高的灵敏性和特异性。

本发明的目的之二在于提供膀胱癌早期诊断和复发监测用试剂盒。

膀胱癌相关的组合标志物为3-甲基胞苷，1-甲基腺苷，假尿嘧啶核苷，1-甲基鸟苷，3-甲基尿苷，1-甲基次黄苷，N4-乙酰胞苷和N,N-二甲基鸟苷八种修饰核苷的组合。

一种膀胱癌早期诊断和复发监测用试剂盒，包括3-甲基胞苷，1-甲基腺苷，假尿嘧啶核苷，1-甲基鸟苷，3-甲基尿苷，1-甲基次黄苷，N4-乙酰胞苷和N,N-二甲基鸟苷的检测试剂。

可选的，上述试剂盒应用在LC-MS平台检测，所述试剂盒包括3-甲基胞苷，1-甲基腺苷，假尿嘧啶核苷，1-甲基鸟苷，3-甲基尿苷，1-甲基次黄苷，N4-乙酰胞苷和N,N-二甲基鸟苷标准品。

进一步的，所述LC-MS平台采用的色谱柱为极性嵌入键合固定相色谱柱3μm*150mm*2.1mm，流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，采用离子源为ESI，正离子多反应监测扫描。

更进一步的，所述LC-MS平台采用流动相的流速为0.3mL/min，柱温40℃；梯度洗脱程序为0-2min，A：99％～99％、B：1％～1％；2-7min，A：99～80％、B：1～20％；7-7.01min，A：80～5％、B：20-95％；7.01-10min，A：5％～5％、B：95％～95％；10-10.01min，A：5％～95％、B：95％～1％；10.01-13min，A：99％～99％、B：1％～1％；

质谱检测条件设置气帘气为30Psi，离子源温度为550℃，离子源雾化气为55Psi，辅助气为55Psi，离子源喷雾电压为5500V。

在本发明的实施例中，采用本发明试剂盒进行组合标志物检测还包括样本制备：包括将尿样离心取上清液，用冰乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡，离心弃去蛋白沉淀，取上清液加入内标溶液，并用初始流动相定容，充分混匀离心，用0.22μm的滤膜过滤上清液。

其中，上述内标溶液包括N¹⁵-2’脱氧腺苷和d³-肌酐。

本发明将8种尿液修饰核苷作为组合标志物用于膀胱癌诊断和复发监测。与现有的技术相比，本发明依据这八种尿液修饰核苷的含量变化来应用于膀胱癌诊断和复发监测的评价中，具有以下优点(1)安全无创，不仅适用于膀胱癌患者，还适用于非癌症人群；(2)省时高效，该方法在13分钟内就能分析出8种修饰核苷，并且实验过程较为简单，非常适用于膀胱癌复发和转移的动态监测；(3)准确性较高，对膀胱癌有较高的灵敏性和特异性，比较适用于膀胱癌的早期诊断和预后监测。

附图说明

图1为8种尿液修饰核苷作为膀胱癌诊断标志物的ROC曲线；

图2为8种尿液修饰核苷作为监测膀胱癌复发标志物的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

本发明实施例提供以3-甲基胞苷m3C，1-甲基腺苷m1A，假尿嘧啶核苷Psu，1-甲基鸟苷m1G，3-甲基尿苷m3U，1-甲基次黄苷m1I，N4-乙酰胞苷ac4C和N,N-二甲基鸟苷m² ₂G八种修饰核苷作为组合标志物，用于膀胱癌早期诊断和复发监测。

本发明提供基于LC-MS平台对八种修饰核苷进行检测，并评价其作为标志物的诊断准确性，具体方法步骤包括：

1)尿液样本的收集：每个膀胱癌初发患者(PPBC)，膀胱癌复发患者(PPBCR)，膀胱癌未复发患者(PPBCNR)及良性疾病对照患者(NC)提供1mL晨起中段尿液，离心后收集尿液上清，-80℃保存；

2)标准储备液的配制：准确称取上述9种标准品，分别用甲醇溶解，分别配制成1mg/mL的溶液，再用初始流动相将3-甲基胞苷(m3C)、3-甲基尿苷(m3U)、N,N-二甲基鸟苷(m² ₂G)、假尿嘧啶核苷(Psu)、1-甲基鸟苷(m1G)、1-甲基腺苷(m1A)、1-甲基次黄苷(m1I)、N4-乙酰胞苷(ac4C)及肌酐(Cr)配制浓度为800ng/mL，400ng/mL，800ng/mL，2400ng/mL，800ng/mL，1600ng/mL，1600ng/mL，800ng/mL，40000ng/mL的标准品混合储备液；

3)内标溶液的配制：准确称取一定量的内标物N¹⁵-2dA和d³-Cr，分别用甲醇溶解，并分别配制成1mg/mL的溶液，并分别用初始流动相稀释为500ng/mL，10000ng/mL的内标储备液；

4)混合标准溶液的配制：分别取一系列梯度的标准储备液100μL于1.5mL离心管中，并分别加入100μL步骤2)制备的标准储备液，用初始流动相定容至1mL，放入高速离心机中进行离心操作，转速设置为14000×g，时间设置为10min。离心结束后取上清液作为待测混合标准液；

5)样本制备：取收集的尿液500μL，5000×g，离心10min，取上清液100μL，并加入4倍体积的冰乙腈沉淀蛋白，14000×g，离心15min弃去蛋白沉淀，再分别加入100μL步骤3)制备的N¹⁵-2dA和d³-Cr的内标储备液，并用初始流动相定容至1mL，充分混匀，14000×g离心15min，上清用0.22μm滤膜过滤，滤液作为待测样本；

6)样品的检测：将待测混合标准液和处理后的尿样通过多反应监测(MRM)模式进行3-甲基胞苷(m3C)，1-甲基腺苷(m1A)，假尿嘧啶核苷(Psu)，1-甲基鸟苷(m1G)，3-甲基尿苷(m3U)，1-甲基次黄苷(m1I)，N4-乙酰胞苷(ac4C)，N,N-二甲基鸟苷(m² ₂G)的色谱分离和质谱检测：

其中色谱分离条件为：流动相的流速为0.3mL/min；进样量2μL；色谱柱为极性嵌入键合固定相色谱柱，规格为3μm*150mm*2.1mm；柱温40℃；A和B作为流动相，其中流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱程序如表1所示：

表1梯度洗脱程序

质谱检测条件为：采用的离子源为ESI，正离子多反应检测(MRM)扫描，气帘气(CUR)为30Psi，离子源温度(TEM)为550℃，离子源雾化气(GS1)为55Psi，辅助气(GS2)为55Psi，离子源喷雾电压(IS)为5500V；

7)制作标准曲线：将待测混合标准液中检测到的各修饰核苷的峰面积与内标物的峰面积之比对工作标准液中各修饰核苷的浓度进行线性回归，得到各修饰核苷的标准曲线；

数据处理：将尿样中修饰核苷的峰面积与内标物的峰面积之比带入对应修饰核苷标准品的标准曲线中得到该修饰核苷的浓度，将尿样中的肌酐的峰面积与内标物的峰面积之比带入对应肌酐标准品的标准曲线中得到肌酐的浓度，两者浓度之比即为膀胱癌患者尿样中的修饰核苷的含量，其结果如表2所示：

表2四组患者尿液中8种尿液修饰核苷的含量

将四组患者的尿液修饰核苷的含量进行ANOVA分析，p值如表3所示：

表3四组进行两两比较的p值

通过绘制受试者特征曲线(ROC)曲线，并计算曲线下面积(AUC)以评估8种尿液修饰核苷对膀胱癌诊断和监测膀胱癌复发的灵敏性和特异性。判断标准为：当AUC<0.5时，表示诊断无意义，当0.5<AUC<0.7，表示诊断准确性较低，当0.7<AUC<0.9，表示诊断准确性一般，当0.9<AUC<1，表示诊断准确性较高。本发明用于膀胱癌诊断的8种尿液修饰核苷的ROC曲线见图1，AUC值和常见诊断值等结果见表4，用于监测膀胱癌复发的8种尿液修饰核苷的ROC曲线见图2，AUC值和常见诊断值等结果见表5。

表4 8种尿液修饰核苷应用膀胱癌诊断的AUC值及常见诊断值

表5 8种尿液修饰核苷监测膀胱癌复发的AUC值及常见诊断值

有上述结果可知8种尿液修饰核苷能够准确的进行膀胱癌的早期诊断和复发监测。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.膀胱癌相关的组合标志物，其特征在于，所述组合标志物为3-甲基胞苷，1-甲基腺苷，假尿嘧啶核苷，1-甲基鸟苷，3-甲基尿苷，1-甲基次黄苷，N4-乙酰胞苷和N,N-二甲基鸟苷八种修饰核苷的组合。

2.一种膀胱癌早期诊断和复发监测用试剂盒，其特征在于，包括检测3-甲基胞苷，1-甲基腺苷，假尿嘧啶核苷，1-甲基鸟苷，3-甲基尿苷，1-甲基次黄苷，N4-乙酰胞苷和N,N-二甲基鸟苷的试剂。

3.如权利要求2所述的膀胱癌早期诊断和复发监测用试剂盒，其特征在于，应用在LC-MS平台检测，所述试剂盒包括3-甲基胞苷，1-甲基腺苷，假尿嘧啶核苷，1-甲基鸟苷，3-甲基尿苷，1-甲基次黄苷，N4-乙酰胞苷和N,N-二甲基鸟苷标准品，以及肌酐标准品。

4.如权利要求3所述的膀胱癌早期诊断和复发监测用试剂盒，其特征在于，所述LC-MS平台采用的色谱柱为极性嵌入键合固定相色谱柱3μm*150mm*2.1mm，流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)，采用离子源为ESI，正离子多反应监测扫描。

5.如权利要求3或4所述的膀胱癌早期诊断和复发监测用试剂盒，其特征在于，所述LC-MS平台采用流动相的流速为0.3mL/min，柱温40℃；梯度洗脱程序为0-2min，A：99％～99％、B：1％～1％；2-7min，A：99～80％、B：1～20％；7-7.01min，A：80～5％、B：20-95％；7.01-10min，A：5％～5％、B：95％～95％；10-10.01min，A：5％～95％、B：95％～1％；10.01-13min，A：99％～99％、B：1％～1％；

质谱检测条件设置气帘气为30Psi，离子源温度为550℃，离子源雾化气为55Psi，辅助气为55Psi，离子源喷雾电压为5500V。

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