CN112834641A - 一种旱地土壤反硝化培养装置及其应用 - Google Patents

Abstract

一种旱地土壤反硝化培养装置及其应用，包括培养系统、气路系统和分析测定系统；所述培养系统由至少一个培养罐体组成，罐体上部设有可拆卸的顶盖，顶盖上设有进气管和排气管，罐体内设有风扇，罐体内下部设有多孔板和聚酰胺滤膜，所述聚酰胺滤膜覆于多孔板上，罐体下部设有贯通底部的供气体或底物溶液进出管路；所述气路系统包括合成空气源装置和气体质量流量控制器，所述合成空气源的排气口与气体质量流量控制器的进气口管道连接，气体质量流量控制器的排气口经第一16位多孔通道阀控系统与培养罐体的进气管连接；所述分析测定系统包括气相色谱仪，培养罐体的排气管经第二16位多孔通道阀控系统分别与气相色谱仪的进样端连接。

Description

一种旱地土壤反硝化培养装置及其应用

技术领域

本发明属于反硝化测定技术领域，具体涉及一种旱地土壤反硝化培养装置及反硝化气体通量自动化在线测定方法。

背景技术

反硝化过程是活性氮最终以惰性氮形式离开土壤、水体等内生循环回归大气的最主要途径。一方面反硝化过程将活性氮以N₂的形式返回到大气圈，起着闭合全球氮循环和减少活性氮环境效应的作用；另一方面反硝化过程也会造成农田生态系统氮肥损失，并对全球气候变化产生不利影响。

在前期反硝化过程的研究中，多数只关注反硝化过程N₂O的产生和排放，而有关N₂产生和排放的研究却很少。这主要是因为大气中存在高背景浓度(78％)的N₂，要在如此高的背景N₂环境中，直接、准确地测定反硝化过程产生的微量N₂极其困难，导致目前反硝化过程在陆地生态系统氮循环过程研究中不确定性最大。在反硝化过程研究中，测定水体中反硝化产生的N₂要比旱地生态系统容易，主要原因是淹水密闭系统中基本不发生气体交换，水体溶解性N₂浓度较低，使得测定水体中反硝化过程的真实速率相对容易，目前常用的方法是N₂:Ar法。相比于水生生态系统，旱地生态系统反硝化过程产生的N₂的测定更加困难。

目前，适用于旱地生态系统反硝化过程的研究方法主要包括：乙炔抑制法、¹⁵N同位素示踪法和质量平衡法。上述几种方法在测定土壤N₂排放研究中缺陷都很明显，乙炔抑制法虽然简单快捷、成本低，但是会严重低估土壤反硝化速率，并且特别不适用淹水环境。¹⁵N同位素示踪法存在土壤微生物优先利用轻质同位素、标记¹⁵N底物和土壤本身¹⁵N混合不均匀等问题，所获取的结果只能定性解释氮的去向，而不能准确定量各种氮通量。对于质量平衡法而言，所有其它氮素去向测定的误差都累计到了反硝化过程中，导致结果变异非常大。

迄今为止，直接测定N₂法在探究河流、湖泊反硝化脱氮能力已有很好的应用，但在旱地土壤中的应用相对甚少。对于旱地生态系统，直接测定N₂法的原理是将土柱置于氦气(或氩气)环境的密闭系统进行培养，并使用高纯氦气(或氩气)和氧气的混合气置换土柱内部的空气，然后以一定流速的混合气连续吹扫土柱顶部间，在一定时间隔测气体中反硝化产物(N₂O和N₂)浓度的变化来确定反硝化气体通量。该方法为防止外界高背景浓度N₂的渗漏，对培养装置的气密性要求很高。这极大地限制了旱地土壤反硝化过程的研究进展，亟需开发能准确量化旱地土壤反硝化过程的新方法。

因此，亟需一种新的的方法来量化旱地生态系统反硝化过程的率和各气态产物排放通量的培养装置和方法，以降低目前旱地系统反硝化研究中的不确定性。

发明内容

解决的技术问题：针对乙炔抑制法、¹⁵N同位素示踪法和质量平衡法存在的局限性，本发明提供了一种旱地土壤反硝化培养装置及反硝化气体通量自动化在线测定方法。该方法在不破坏土壤结构以及不扰乱土壤微生物正常代谢的前提下可以实现对反硝化过程终端产物N₂的直接测定，该方法的测定精度与培养装置的气密性和气体置换效率有密切联系。在相对理想的状态下，利用该培养装置系统可以直接准确测定N₂产生量，是一种值得推荐的测定反硝化过程速率的方法，可用来量化旱地生态系统的反硝化过程。

技术方案：一种旱地土壤反硝化培养装置，包括培养系统、气路系统和分析测定系统；所述培养系统由至少一个培养罐体组成，罐体上部设有可拆卸的顶盖，顶盖上设有进气管和排气管，罐体内设有风扇，罐体内下部设有多孔板和聚酰胺滤膜，所述聚酰胺滤膜覆于多孔板上，罐体下部设有贯通底部的供气体或底物溶液进出管路；所述气路系统包括合成空气源装置和气体质量流量控制器，所述合成空气源的排气口与气体质量流量控制器的进气口管道连接，气体质量流量控制器的排气口经第一16位多孔通道阀控系统与培养罐体的进气管连接；所述分析测定系统包括气相色谱仪，培养罐体的排气管经第二16位多孔通道阀控系统分别与气相色谱仪的进样端连接。

上述合成空气源装置所提供气体为氦氧混合气。

上述顶盖与罐体密封连接。

上述多孔板为石英材质。

上述气相色谱仪内配备有两个检测器，分别为定量N₂的热导检测器(TCD)，以及检测N₂O的电子捕获检测器(ECD)。

旱地土壤反硝化培养装置在反硝化气体通量自动化在线测定中的应用，步骤为：向培养罐体装填不超过1.5kg的新鲜土壤样品，装样后罐内顶部空间体积为1L；向罐内土体表面加入反应底物溶液，密封培养罐体；利用气路系统的合成空气源对罐内气体进行置换，直至罐内气体为氦氧混合气所替换；进行土壤反硝化过程培养；在预设的时间间隔内依次利用第一16位多孔通道阀控系统切换气体的通进，而使得每个培养罐的气体出口端通过第二16位多孔通道阀控系统连接到分析测定系统进行测定；分析测定系统在上述设定的时间内，完成对各培养罐内顶空气体中N₂O和N₂的测定；根据各培养罐内顶空气体的组分浓度和气体流速测定，利用相应的公式计算反硝化气体通量。

上述预设的时间间隔根据培养罐以及标气数量和气相色谱的测样时间来计算，通过控制模块的程序语言以及编写的气象色谱测定序列联合控制培养装置的循环测定和浓度标定以及数据录入，具体的循环序列如下：“2次标气标定—16个培养罐内气体的测定—2次标气标定”；

上述反硝化气体通量计算，根据气相色谱仪和氮氧化物分析仪测定的顶空气体组分浓度，代入反硝化气体通量计算公式，如下：

式中，F为N₂O和N₂的排放通量，单位为kg(N₂O或N₂)ha^-1day^-1，如需计算N的通量，则用相应原子的摩尔质量除以相应分子的摩尔质量；c为校正后的单位气体浓度，单位为μmolmol^-1，flow rate为吹扫气体流速，单位为mL min^-1，常数60、24为时间转换，分别为分转小时、小时转天，π为圆周率，d为培养罐内土体的直径，单位为cm，10为体积比转换与面积比转换的乘积，μmol mol^-1转mol mol^-1和cm²转ha，ρ为N₂O和N₂气体的密度，单位为kg L^-1或g mL^-1。

有益效果：本发明通过优化培养罐体的设计，可实现直接测定N₂排放通量，利用本发明进行旱地生态系统土壤反硝化研究时，密封性良好的罐体及气路管道提高了测定的准确性，同时也可以在不扰动土体本身的情况下近似反映原位土壤的反硝化气体通量；

本发明耦合了气体流通培养技术以及阀控系统，不同于密闭的氦环境培养系统，可以更充分地模拟野外气体流通条件下的土表环境；

本发明将培养系统与气路以及测定系统通过集成的控制模块实现有机结合，可在线和连续测定反硝化气体通量，既保证了培养系统的密闭性和气体的流通扩散性，也可以实现反硝化气体产物浓度的实时高分辨率在线测定；

本发明旱地土壤反硝化培养装置耦合了气体流通培养技术以及阀控系统，通过在线动态监测以及数据分析，可以实时观察反硝化气体产物的变化，在一定程度上为反硝化气体通量及其产物比值的研究提供了技术支撑，对于旱地土壤反硝化测定技术的发展具有很好的推动作用。

附图说明

图1为一整套培养装置整体示意图；

图2为培养罐体的示意图；

图3为通道转换阀连接的示意图；

图4为实施例中的整体培养的示例图；

图5为实施例所测定的N₂O和N₂通量随培养时间的变化曲线；

图6为实施例所测定的反硝化气体产物比值N₂O/(N₂O+N₂)随培养时间的变化曲线。

具体实施方式

实施例1

本实施例将提供一种反硝化培养装置。

参见图1～3，所示为本实施例旱地土壤反硝化培养装置，包括培养系统、气路系统和分析测定系统(图1)；本实施例中培养系统由16个气密性良好的培养罐体组成；本实施例中培养罐罐体直径为16cm，高为15cm；培养罐罐体底端开口设有不可拆卸的底盖，其顶端开口设有可拆卸的顶盖，且底盖设有供气体或底物溶液进出管路，顶盖设有进气管和排气管(图2)；所述罐体底部设有石英石材质多孔板和聚酰胺材质滤膜；所述罐体顶部一硅橡胶圈，通过高性能真空硅脂与顶盖粘合，具体来说，在顶盖四端螺纹螺母啮合的机械压力作用下实现罐体的密封；所述培养罐体内壁设有红外迷你小风扇；

本实施例中所述气路系统设有三个通道分别为抽气通道、排气/液通道和测气通道；所述气路系统包括合成合成空气源、气体质量流量控制器(HORIBA METRON S48 32/HMT，中国北京)、真空泵、通道转换阀及若干直通阀和气路接头；所述合成空气源为高纯度氦氧混合气；所述气体质量流量控制计以可拆卸的方式安装与气源出口端以调节管路内气体流速；所述真空泵以可拆卸的方式连接至气路管道用以置换罐内气体；所述通道转换阀和直通阀，其两端分别连接气路管道和培养罐的进/排气端，本实施例中的16位多孔通道阀控系统为16位多孔通道转换阀(VICI EMT2CSF16MWE，美国休斯顿)，由16个进气端连接培养罐排气口和1个排气端连接分析测定系统(图3)；

所述分析测定系统为气相色谱仪(Agilent 7890B，美国加利福尼亚)，本实施例中气相色谱仪的工作通过控制模块(Gilson 508 Interface Module，美国麦迪逊)的程序语言以及编写的气相色谱测定序列联合控制进行测样、分析和记录等工作。

实施例2

为了使本发明的目的、技术法案及优点更加清楚明白，本实施例将利用实施例1装置展示一种反硝化气体通量自动化在线测定方法的具体实施效果，具体如下：

采集太湖流域常熟农业生态实验站附近长期设施蔬菜种植体系下0-20cm表层土，土壤采集后用封口袋密封尽快送至实验室，统一过2mm筛并去除杂质后备用。实验中通过添加硝酸钾溶液和秸秆分别作为氮、碳源，共设有三个处理，分别如下1)空白对照处理(未添加任何底物)，2)秸秆处理(添加3g·kg^-1秸秆干土计，3)秸秆+硝酸钾处理(添加3g·kg^-1秸秆干土计，并添加20mM硝酸钾，相当于60mg·kg^-1NO₃ ^-干土计)。在完成处理设置后，按以下步骤进行旱地土壤反硝化气体通量测定工作(图4)。

1)土柱样品制备

将过2mm筛的新鲜土壤样本和添加物按实验处理设计量预先混匀，加入到培养罐中后压实使土体至目标容重。用高性能真空硅脂以及硅橡胶圈密封罐体。

2)气体吹扫与平衡建立

利用气路系统的阀控系统，打开图1所示通道1所有的进气口阀门，并保持通道2、3的其他阀门常闭状态，用高纯氦气(配以不同含量的氧气)置换培养罐内(顶部空间和土柱内)的气体，使得容器内空气为高纯氦气和氧气所替代，置换用混合气体流速约为250mLmin^-1。气体置换采用的是负压式置换方法，通过真空泵同时抽除16个培养罐内气体直至达到真空状态，然后再通入高纯混合气源以平衡罐内气压。重复上述“抽洗—置换吹扫—平衡”步骤5次后，为建立罐内土柱顶部自然的浓度梯度，气体置换和底物添加完成后，高纯氦气和氧气的混合气源以25mL min^-1(其中氦气流速为20mL min^-1，氧气为5mL min^-1)的流速吹扫土柱的顶部空间(此时通道1、2所有阀门打开，通道3阀门关闭)，同时开启红外控制的迷你风扇，以便混匀顶空气体和平衡罐内压力。

3)顶空气体浓度测定及标定

利用培养装置控制模块的程序语言以及编写的气象色谱测定序列联合控制培养装置的循环测定和浓度标定以及数据录入，每个循环的测定周期为3.5h左右。具体的循环序列如下：“2次标气标定—16个培养容器的气体测定—2次标气标定”，每个气体样品的GC测定时长为10min。相邻培养罐气体样品之间，标准气体和样品气体的测定之间都设有一定的气体吹扫时间间隔，以避免交叉污染。同时，在设计实验的同时将其中3个培养容器设为N₂背景值对照用于校正培养试验中N₂测定浓度。

4)反硝化气态氮产物通量计算

将气相色谱测得的各气体浓度进行分类整理后，带入以下公式计算排放通量：

式中，F为N₂O和N₂的排放通量，单位为kg(N₂O或N₂)ha^-1day^-1，如需计算N的通量，则用相应原子的摩尔质量除以相应分子的摩尔质量；c为校正后的单位气体浓度，单位为μmolmol^-1，flow rate为吹扫气体流速，单位为mL min^-1，常数60、24为时间转换，分别为分转小时、小时转天，π为圆周率，d为培养罐内土体的直径，单位为cm，10为体积比转换与面积比转换的乘积，μmol mol^-1转mol mol^-1和cm²转ha，ρ为N₂O和N₂气体的密度，单位为kg L^-1或g mL^-1。

通过将上述培养装置测得的罐内顶空气体浓度代入公式1计算可得土壤在无碳源和氮源添加情况下的N₂日均通量为0.51±0.04kg N·ha^-1·day^-1，而碳源和氮源添加后，土壤的N₂日均通量为0.73±0.10～1.57±0.08kg N·ha^-1·day^-1。相比于空白处理，秸秆添加对N₂排放通量的提高幅度为43.1％，而秸秆和硝酸钾的同时添加下，N₂排放的增幅为207.8％。土壤的N₂O日均通量在0.64±0.06～2.12±0.11kg N·ha^-1·day^-1，空白处理为1.13±0.17kg N·ha^-1·day^-1，秸秆添加降低了43.4％的N₂O排放，而秸秆和硝酸钾的同时添加则促进了87.6％的N₂O排放(图5)。经过为期27天的培养，几种实验处理下，土壤累积N₂排放量为13.50±0.79～41.51±1.53kg N·ha^-1，N₂O累积排放为16.82±1.17～55.82±2.01kg N·ha^-1。通过计算培养过程气态氮总损失(N₂+N₂O)占矿质氮变化的比值，可得到各实验处理的气态氮产物回收率为58～97％，与前人通过其他方法研究所观测到的含氮气体(N₂O+N₂)的回收率相符，表明该装置及相应方法能够较好地捕捉到土壤反硝化产物气态氮的损失。此外，本方法也可实时计算N₂O和N₂通量的比值可以得到动态的N₂O/(N₂O+N₂)反硝化气体产物比(图6)，空白、秸秆添加及秸秆和硝酸钾联合添加三个处理在整个培养期间的N₂O/(N₂O+N₂)比值分别为0.69±0.05、0.47±0.02和0.57±0.02，该比值变化与前人有关土壤反硝化过程产物比值对外源氮或有机碳添加的响应研究相一致。

通过实施例2的实验完整的展示了本发明对旱地土壤反硝化气体通量测定的高分辨率响应，该装置及方法的高回收率和高精度可以为旱地生态系统土壤反硝化过程的研究提供技术支撑。

与传统研究方法相比，直接测定N₂法在研究土壤反硝化过程上是一种极具潜力的方法技术。而本发明所述的一种旱地土壤反硝化培养装置及反硝化气体通量自动化在线测定方法所具备的高分辨率和气密性的培养装置及相应方法可以满足旱地生态系统土壤反硝化过程的研究，该方法一定程度上弥补了以往对于旱地生态系统土壤反硝化过程定量分析不准确的不足。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。本发明对于推动陆地生态系统土壤氮循环特别是反硝化过程研究提供了重要的技术和方法支持。

Claims (7)

1.一种旱地土壤反硝化培养装置，其特征在于包括培养系统、气路系统和分析测定系统；

所述培养系统由至少一个培养罐体组成，罐体上部设有可拆卸的顶盖，顶盖上设有进气管和排气管，罐体内设有风扇，罐体内下部设有多孔板和聚酰胺滤膜，所述聚酰胺滤膜覆于多孔板上，罐体下部设有贯通底部的供气体或底物溶液进出管路；

所述气路系统包括合成空气源装置和气体质量流量控制器，所述合成空气源的排气口与气体质量流量控制器的进气口管道连接，气体质量流量控制器的排气口经第一16位多孔通道阀控系统与培养罐体的进气管连接；

所述分析测定系统包括气相色谱仪，培养罐体的排气管经第二16位多孔通道阀控系统分别与气相色谱仪的进样端连接。

2.根据权利要求1所述旱地土壤反硝化培养装置，其特征在于所述合成空气源装置所提供气体为氦氧混合气。

3.根据权利要求1所述旱地土壤反硝化培养装置，其特征在于所述顶盖与罐体密封连接。

4.根据权利要求1所述旱地土壤反硝化培养装置，其特征在于所述多孔板为石英材质。

5.根据权利要求1所述旱地土壤反硝化培养装置，其特征在于所述气相色谱仪内配备有两个检测器，分别为定量N₂的热导检测器(TCD)，以及检测N₂O的电子捕获检测器(ECD)。

6.权利要求1-5任一所述旱地土壤反硝化培养装置在反硝化气体通量自动化在线测定中的应用，其特征在于步骤为：向培养罐体装填不超过1.5kg的新鲜土壤样品，装样后罐内顶部空间体积为1L；向罐内土体表面加入反应底物溶液，密封培养罐体；利用气路系统的合成空气源对罐内气体进行置换，直至罐内气体为氦氧混合气所替换；进行土壤反硝化过程培养；在预设的时间间隔内依次利用第一16位多孔通道阀控系统切换气体的通进，而使得每个培养罐的气体出口端通过第二16位多孔通道阀控系统连接到分析测定系统进行测定；分析测定系统在上述设定的时间内，完成对各培养罐内顶空气体中N₂O和N₂的测定；根据各培养罐内顶空气体的组分浓度和气体流速测定，利用相应的公式计算反硝化气体通量。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述预设的时间间隔根据培养罐以及标气数量和气相色谱的测样时间来计算，通过控制模块的程序语言以及编写的气象色谱测定序列联合控制培养装置的循环测定和浓度标定以及数据录入，具体的循环序列如下：“2次标气标定—16个培养罐内气体的测定—2次标气标定”；

所述反硝化气体通量计算，根据气相色谱仪和氮氧化物分析仪测定的顶空气体组分浓度，代入反硝化气体通量计算公式，如下：

式中，F为N₂O和N₂的排放通量，单位为kg(N₂O或N₂)ha^-1day^-1，如需计算N的通量，则用相应原子的摩尔质量除以相应分子的摩尔质量；c为校正后的单位气体浓度，单位为μmolmol^-1，flow rate为吹扫气体流速，单位为mL min^-1，常数60、24为时间转换，分别为分转小时、小时转天，π为圆周率，d为培养罐内土体的直径，单位为cm，10为体积比转换与面积比转换的乘积，μmol mol^-1转mol mol^-1和cm²转ha，ρ为N₂O和N₂气体的密度，单位为kg L^-1或g mL^-1。

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