CN112831156B - 一种聚合物点及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚合物点及其制备方法和应用，所述聚合物点包括侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚苯乙烯马来酸；所述聚芴材料和聚苯乙烯马来酸形成团聚体，所述聚芴材料中的甲基丙烯酰基团和聚苯乙烯马来酸中的羧基暴露于所述团聚体的表面。本发明所述聚合物点经链霉亲和素或者免疫球蛋白抗体偶联后，具有细胞靶向、凝胶锚定和明亮荧光特性，在多色超分辨扩展显微成像中的性能优越。

Description

一种聚合物点及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及半导体聚合物技术领域，尤其涉及一种聚合物点及其制备方法和应用。

背景技术

传统的光学成像方法受限于光的衍射极限，无法对细胞的精细结构和分子的动态过程进行清晰成像，严重制约了许多生命科学问题的深入研究。近年来，随着新型荧光探针和成像理论的发展，研究人员开发出了多种突破光学衍射极限的超分辨显微成像方法。其中一类超分辨率光学成像方法，如受激发射损耗显微成像和结构光照明显微成像，是依靠图案照明在空间上调节荧光发射；而随机光学重建成像和光激活定位显微成像，通过随机开启/关闭荧光分子来实现单个分子的定位。通过将光学显微镜的分辨能力推进到纳米尺度，超分辨显微成像技术已在许多前沿科学中得到很好的应用，促进了生命科学研究的快速发展。2014年，诺贝尔化学奖授予超分辨荧光成像领域的三位领军人物，美国科学家EricBetzig，德国科学家Stefan W.Hell和美国科学家William E.Moerner，以表彰他们在超分辨荧光显微成像技术方面的重大贡献。

虽然超分辨率成像已经取得了重大进展，但这些方法通常需要先进的光学设备和复杂的图像分析方法。相比之下，扩展显微成像(ExM)是2015年提出的基于物理上扩展样本并通过传统方式获得超分辨图像的显微成像技术。这项技术利用可膨胀聚合物在荧光标记后的样本周围形成密集的网状结构，并在水存在的情况下均匀膨胀，样本体积随之线性方向扩大4.5倍甚至更多，最终在传统显微镜上实现简便快速的纳米级分辨率成像。到目前为止，扩展显微成像技术已广泛用于检测培养细胞、果蝇组织、小鼠脑神经元和临床样本(包括人类乳腺和肺组织)中的蛋白和RNA。

当然，ExM技术本身也面临着一些挑战。几乎所有的ExM研究中，试样扩展后的荧光标记亮度明显下降，荧光衰减仍然是ExM技术广泛应用的一个挑战。产生上述结果主要有以下几方面原因：首先，由于样品在三维空间线性扩展4倍及以上，标记密度则被稀释了64倍以上，导致显微镜探测器检测到的荧光信号急剧减小；其次，对于有机染料和荧光蛋白，凝胶聚合过程和蛋白酶消化等化学处理会产生自由基，与荧光团发生反应，甚至完全破坏分子结构(如菁染料)；此外，ExM研究中使用的大多数荧光团通过靶向抗体或蛋白质间接固定在凝胶网络上，可能会在消化和溶胀过程中被冲走。因此，保持高标记密度和高荧光信号是进一步发展ExM技术的关键和主攻方向。

半导体聚合物点(Pdots)是一种具有可调光学特性的有机荧光探针，它是具有π-共轭结构的一类聚合物纳米粒子，具有吸收截面大、量子效率高、发射波长丰富、跃迁速率快和光化学性质稳定等优异的光学特性。相比较无机量子点和商用荧光染料，Pdots具有更加优异的荧光亮度，在相同测试条件下其单粒子荧光亮度高出CdSe/ZnS量子点和荧光染料30倍。这些优良的光物理性质使得它们在生物成像和医学检测中大放异彩。通过表面功能化修饰，Pdots能够特异性的识别各种细胞结构，实现对不同细胞结构的高亮度特异性标记。此外，小尺寸的Pdots已成功应用于超分辨率光学涨落成像，开拓了其在超分辨成像领域的新应用。综上所述，聚合物点所具备的超高荧光亮度、强稳定性以及简易的表面功能化，有望推动ExM技术的进一步发展，为其更好的服务于生命科学、生物医学领域打下基础。CN109211861A公开了一种聚合物点/金纳米簇比率荧光探针的合成及其对三聚氰胺比率荧光检测的应用，其公开的合成方法将聚乙烯亚胺、水和还原剂混合搅拌，加热还原后得到聚乙烯亚胺聚合物点；然后，将氯金酸、水、谷胱甘肽混合搅拌，加热还原得到金纳米簇；最后，将聚乙烯亚胺聚合物点、金纳米簇自组装，得到聚乙烯亚胺聚合物点/金纳米簇比率荧光探针。其公开的荧光探针能够有效地检测痕量三聚氰胺，并且在常见阴、阳离子以及天然氨基酸中对三聚氰胺具有高效选择性。其公开的荧光探针检测了去蛋白质和脂肪的牛奶中三聚氰胺的含量，回收率分别为97.3％、102.1％、101.2％，并且所有相对标准偏差(RSDs)均低于5％。

CN105784988A公开了一种基于聚合物发光点的免疫探针及其制备方法与应用，其公开的免疫探针通过聚苯撑乙烯衍生物和苯乙烯-马来酸酐共聚物反应，制备得到聚合物点(PDs)水溶液；接着将PDs水溶液、丁二烯—苯乙烯共聚物和碳二亚胺混匀，得到混合液体A；将混合液体A和亚胺硫磷抗体混合反应，得到基于聚合物发光点的免疫探针。该免疫探针能特异性识别亚胺硫磷，因此可用其定性检测亚胺硫磷、半定量或定量检测亚胺硫磷。其公开的定性和半定量检测方法为原位可视化检测方法；其公开的定量检测方法灵敏度高，特异性强，可以进行高灵敏度定量检测。但是其公开的聚合物点形成的免疫探针不具有细胞靶向的特点，无法克服ExM中的标记瓶颈。

综上所述，开发一种具有细胞靶向、凝胶锚定和明亮荧光特性的聚合物点对于克服ExM中的标记挑战至关重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种聚合物点及其制备方法和应用，所述聚合物点具有细胞靶向、凝胶锚定和明亮荧光特性，在多色超分辨扩展显微成像的性能优越。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提提供一种聚合物点，所述聚合物点包括侧链含有甲基丙烯酰基团(MA)的聚芴材料和聚苯乙烯马来酸；

所述聚芴材料和聚苯乙烯马来酸形成团聚体，所述聚芴材料中的甲基丙烯酰基团和聚苯乙烯马来酸中的羧基暴露于所述团聚体的表面。

本发明所述聚合物点包括侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料，聚芴材料具有优良的光物理性质和易于调控的聚合物骨架和侧链，所述聚芴材料和聚苯乙烯马来酸由于疏水相互作用形成团聚体，亲水性的MA基团和功能性的羧基裸露在团聚体表面。

侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料属于共轭聚合物，本身具有超高的荧光亮度。此外，与荧光染料或荧光蛋白相比，聚芴材料中的MA基团能够直接锚定在水凝胶基质上，更好地保留样本的荧光信号。

聚苯乙烯马来酸中的功能性羧基使聚合物点表面功能化，能够与链霉亲和素或者二抗的胺基脱水缩合共价连接，最终通过靶向生物素化的抗体或者一抗来实现对不同细胞结构或者生物组织的高亮度特异性荧光标记。聚合物点标记不同细胞或者生物组织之后，再通过聚合成胶，组织蛋白消化，凝胶扩展等操作步骤，最后利用共聚焦显微镜获得超分辨率荧光图像。因此，所述聚合物点具有细胞靶向、凝胶锚定和明亮荧光特性，在生物成像中具有巨大的潜力。

优选地，所述甲基丙烯酰基团在所述侧链含有甲基丙烯酰基团聚芴材料中的摩尔比为5％-8％，例如5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％等。

优选地，所述侧链含有甲基丙烯酰基团聚芴材料的数均分子量为15000g/mol-30000g/mol，例如16000g/mol、17000g/mol、18000g/mol、19000g/mol、20000g/mol、21000g/mol、22000g/mol、23000g/mol、24000g/mol、25000g/mol、26000g/mol、27000g/mol、28000g/mol、29000g/mol等。

优选地，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料包括含有甲基丙烯酰基团的均聚聚芴及其衍生物、侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴-苯并噻唑及其衍生物或侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴-二噻吩苯并噻唑及其衍生物中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料包括式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示的聚合物中任意一种或至少两种的组合；

所述R基团选自含有甲基丙烯酰基团的侧链，优选1-甲基丙烯酰-己烷基；

式Ⅰ中所述m与n的摩尔比为(5-8):(92-95)，其中5-8可以为5.5、6、6.5、7、7.5等，92-95可以为92.5、93、93.5、94、94.5等；

式Ⅱ中所述o、p与q的摩尔比为(5-8):50:(42-45)，其中5-8可以为5.5、6、6.5、7、7.5等，42-45可以为42.5、43、43.5、44、44.5等；

式Ⅲ中所述x、y与z的摩尔比为(5-8):50:(42-45)，其中5-8可以为5.5、6、6.5、7、7.5等，42-45可以为42.5、43、43.5、44、44.5等。

上述三种聚芴材料分别是蓝绿红三种侧链接了MA的共轭聚合物，在多色超分辨扩展显微成像中的性能优越。

第二方面，本发明提供一种第一方面所述的聚合物点的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液混合后在去离子水中共沉淀，再去除溶剂，得到所述聚合物点。优选地，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液的质量浓度为0.5-1.5mg/mL，例如0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.3mg/mL、1.4mg/mL等，优选1mg/mL。

优选地，所述聚苯乙烯-马来酸酐溶液的质量浓度为1.5-2.5mg/mL，例如1.6mg/mL、1.7mg/mL、1.8mg/mL、1.9mg/mL、2mg/mL、2.1mg/mL、2.2mg/mL、2.3mg/mL、2.4mg/mL等，优选2mg/mL。

优选地，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液中的溶剂包括四氢呋喃。

优选地，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液的体积比为(1:0.03)-(1:0.08)，例如1:0.04、1:0.05、1:0.06、1:0.07等，优选1:0.05。

优选地，所述制备方法还包括：在侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液混合后进行稀释，得到侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)的混合液。

所述稀释的溶剂包括四氢呋喃。

优选地，所述共沉淀在超声仪中进行。

优选地，所述共沉淀具体包括：将侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)的混合液，在超声震荡的条件下注入去离子水，完成共沉淀。

优选地，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)的混合液与去离子水的体积比为(2-4):(8-12)，优选3:10，其中，2-4可以为2、3等，8-12可以为9、10、11等。

优选地，所述超声处理的时间为0.5-1.5分钟，例如0.6分钟、0.7分钟、0.8分钟、0.9分钟、1分钟、1.1分钟、1.2分钟、1.3分钟、1.4分钟等，优选1分钟，优选1分钟。

优选地，所述去除溶剂的温度为85-95℃，例如86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃等，优选90℃。

优选地，所述去除溶剂在通氮气的条件下进行。

优选地，所述制备方法还包括在去除溶剂后过滤。

优选地，所述过滤使用的滤膜的孔径为0.2-0.3μm例如0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm等，优选0.22μm。

优选地，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料的制备方法包括如下步骤：将2,7-二溴芴、四丁基溴化铵、1,6-二溴己烷和氢氧化钠水溶液混合反应，得到分子1，再将分子1、邻苯二甲酸亚胺钾盐和二甲基甲酰胺加热混合反应，得到分子2，然后将分子2、无水乙醇与水合肼反应形成分子3，再将分子3、无水三乙胺、无水二氯甲烷和2-甲基丙烯酰氯混合反应，得到分子4；

将分子4、分子5和分子6反应，得到式Ⅰ所示的聚合物；

或者，将分子4、分子7和分子8反应，得到式IⅠ所示的聚合物；

或者，将分子4、分子9和分子10反应，得到式IIⅠ所示的聚合物；

反应路径如下：

所述R为含有甲基丙烯酰基团的侧链，优选1-甲基丙烯酰-己烷基。

作为优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：将聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)分别进行溶液配制后混合，稀释，再在去离子水中超声处理0.5-1.5分钟完成共沉淀，再在85-95℃温度下通氮气去除溶剂，过滤，得到所述聚合物点。

第三方面，本发明提供一种生物偶联后的聚合物点，所述生物偶联后的聚合物点由第一方面所述的聚合物点和链霉亲和素或免疫球蛋白抗体偶联得到。

第四方面，本发明提供一种第四方面所述的生物偶联后的聚合物点在细胞免疫荧光标记及扩展显微成像中的应用。

本发明所述的生物偶联后的聚合物点在应用时使用一种扩展缓冲液，所述扩展缓冲液包括聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、吐温20、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或十二烷基硫酸钠(SDS)中的任意一种，优选Triton X-100。

聚合物因为分子量大和不溶于水的特性，限制了其在生物研究中的应用，本发明通过共沉淀法制备成水溶的纳米尺寸的聚合物点，聚芴材料做成纳米尺寸的聚合物点后荧光亮度有所降低，通过用含有表面活性剂的水溶液，即上述扩展缓冲液，处理聚合物点，使得聚集的荧光团构象变得松散，荧光得到进一步增强。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所述聚合物点实现了在扩展显微镜中高效的靶向、凝胶锚定和荧光报告。在凝胶形成时，聚合物点直接与凝胶交联，保证了较高的固定效率和在消化和扩展过程中荧光团的保留。在相同条件下，聚合物点标记的目标扩增后的荧光亮度比Alexa染料高出3-6倍。此外，通过结合多色超分辨扩展显微成像(ExM)和超分辨光学涨落成像(SOFI)技术，本发明所述聚合物点的光学特性允许多模态超分辨率成像，从而使亚细胞结构在约为30nm分辨率下清晰可见。这些发现表明了聚合物点在多色生物成像中的巨大潜力。

附图说明

图1是实施例1所述聚合物点的制备路径示意图；

图2是实施例1-3所述聚合物点进行链霉亲和素偶联后应用于扩展显微成像技术示意图；

图3a是实施例1-3所述聚合物点的吸收光谱；

图3b是实施例1-3所述聚合物点的发射光谱；

图3c是用动态光散射法测定链霉亲和素偶联前后实施例1-3三种类型聚合物点的水动力直径；

图3d是实施例2所述聚合物点的TEM图像；

图3e是用动态光散射法测定链霉亲和素偶联前后三种类型聚合物点的Zeta电位图；

图4a是用实施例1所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管蛋白共聚焦图像；

图4b是用实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管蛋白共聚焦图像；

图4c是用实施例3所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管蛋白共聚焦图像；

图4d是用链霉亲和素偶联的Alexa 405染料标记的微管蛋白共聚焦图像；

图4e是用链霉亲和素偶联的Alexa 488染料标记的微管蛋白共聚焦图像；

图4f是用链霉亲和素偶联的Alexa 594染料标记的微管蛋白共聚焦图像；

图4g是图4a-图4f的信号背景比的比较图；

图4h是实施例1-3所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管结构和相应的Alexa染料的平均荧光强度比较图；

图4i是实施例1和实施例3所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的线粒体膜(短棒状)和酪氨酸化微管(柱状)的双色成像图；

图4j是实施例1和实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的网格蛋白(圆点状)和微管蛋白(柱状)的双色成像图；

图5a是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管在扩展处理前后的同一地区共聚焦图像；

图5b是图5a面板框内α微管扩展前的视图；

图5c是图5a面板框内α微管扩展后的视图；

图5d是沿图5b和图5c中相应箭头方向的强度分布图；

图5e是ExM后微管的均方根误差；

图5f是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后的z最大投影；

图5g是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的网格蛋白扩展后的共聚焦图像；

图5h是图5g内部白色方框i的放大图；

图5i是图5g内部白色方框ii的放大图；

图5j是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后的宽度分布(n＝30)；

图5k是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的网格蛋白有被小泡扩展后的横剖面的尺寸统计(n＝28)；

图5l是实施例2所述聚合物点经免疫球蛋白抗体偶联后标记的C57小鼠海马细胞突触前巴松蛋白(Bassoon蛋白，绿色，MA-PFBT)和突触后荷蒙蛋白(Homer蛋白，红色，MA-PFO)扩展后的共聚焦图像；

图5m是沿图5j中相应箭头方向的横向剖面的强度分布；

图6a是用实施例1所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后的共焦图像；

图6b是用链霉亲和素偶联的Alexa405标记的微管扩展后的共焦图像；

图6c是用实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后的共焦图像；

图6d是用链霉亲和素偶联的Alexa 488标记的微管扩展后的共焦图像；

图6e是用实施例3所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后的共焦图像；

图6f是用链霉亲和素偶联的Alexa 594标记的微管扩展后的共焦图像；

图7a是实施例2所述聚合物点在四种质量浓度为0.025％-1.6％的表面活性剂孵育前后的荧光强度图；

图7b是实施例1所述聚合物点在不同浓度Triton X-100孵育前后的荧光光谱；

图7c是实施例3所述聚合物点在不同浓度Triton X-100孵育前后的荧光光谱；

图8是不同浓度Triton X-100处理前后凝胶的平均大小比值；

图9a是实施例1所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后未经TritonX-100处理的荧光图像；

图9b是实施例1所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后在TritonX-100处理后的荧光图像；

图9c是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后未经TritonX-100处理的荧光图像；

图9d是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后在TritonX-100处理后的荧光图像；

图9e是实施例3所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后未经TritonX-100处理的荧光图像；

图9f是实施例3所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后在TritonX-100处理后的荧光图像；

图10是实施例1-3所述聚合物经链霉亲和素偶联后标记的细胞微管扩展后，未经TritonX-100处理，在Triton X-100处理后与相应链霉亲和素偶联的Alexa染料标记的细胞微管扩展后荧光强度比较图；

图11a是用实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的扩展的微管蛋白(杆状)和用实施例1所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的线粒体外膜转运酶(短棒状)的共聚焦图像；

图11b是用实施例3所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的扩展的微管蛋白(杆状)和用实施例1所述聚合物点标记的网格蛋白有被小泡(圆点状)的共聚焦图像；

图12a是用Triton X-100处理前后实施例1所述聚合物点的强度轨迹的平均自相关曲线(n＝300)；

图12b是用Triton X-100处理前后实施例2所述聚合物点的强度轨迹的平均自相关曲线(n＝300)；

图13a实施例1所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后的宽场TIRF图像和八阶SOFI图像；

图13b是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的微管扩展后的宽场TIRF图像和八阶SOFI图像；

图13c是图13a所示对应箭头方向的扩展前后的强度分布图；

图13d是图13b所示对应箭头方向的扩展前后的强度分布图；

图13e是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的BS-C-1细胞扩展的微管的转盘(SD)共聚焦图像；

图13f是通过分析面板13e 500帧原始数据重建得到的二阶SOFI图像；

图13g是通过分析面板13e 500帧原始数据重建得到的四阶SOFI图像；

图13h是分析图13e及其经过一阶，二阶，三阶，四阶SOFI分析的分辨率对比；

图13i是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的Tomm20蛋白的3D最大投影的SD图像；

图13j是实施例2所述聚合物点经链霉亲和素偶联后标记的Tomm20蛋白经四阶SOFI分析重建得到的图像。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供了一种聚合物点，所述聚合物点中的聚合物基体如式Ⅰ所示(MA-PFO聚合物)，R基团为1-甲基丙烯酰-己烷基，摩尔百分比为5％，数均分子量为16958g/mol，重均分子量18591g/mol，分散性指数(PDI)1.14。

上述聚合物点的制备方法包括如下步骤：

(1)MA-PFO聚合物的制备

将12.96g的2,7-二溴芴(40mmol)和1.28g的四丁基溴化铵加入装有150mL的1,6-二溴己烷的圆底烧瓶中，再加入50mL质量分数为50％的氢氧化钠水溶液混合；将反应混合物在70℃下搅拌12h，冷却至室温后，分离有机层，用二氯甲烷萃取水层；再将混合后的有机溶液用水冲洗三次，二氯甲烷蒸发后，在真空条件下除去残留的液体试剂；然后以乙酸乙酯/石油醚混合物(体积比1:160)为洗脱剂，采用硅胶柱层析法对粗品进行纯化，得到白色固体(22.6g，产率87％)，即为分子1。核磁共振波谱仪鉴定产物结构：¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)，δ7.53(d，J＝8.0Hz，2H)，7.49-7.42(m，4H)，3.29(t，J＝6.8Hz，4H)，1.97-1.87(m，4H)，1.73-1.60(m，4H)，1.24-1.04(m，8H)，0.65-0.51(m，4H)。

将0.65g的分子1(1mmol)和0.93g的邻苯二甲酸亚胺钾盐(5mmol)加入到装有20mL二甲基甲酰胺的100mL圆底烧瓶中，将反应体系加热到110℃，搅拌12小时，待圆底烧瓶冷却到室温后，过滤掉其中的固体，收集滤液；在所述滤液中加入100mL二氯甲烷，用50mL饱和盐水洗涤3遍，再用50mL去离子水洗涤3遍；随后，用无水硫酸钠干燥有机层，再进行过滤和蒸发溶剂的操作，得到0.51g的白色固体，即为分子2，无需进一步纯化，产率为65％。核磁共振波谱仪鉴定产物结构：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ＝7.80(ddd，J＝12.1，6.1，2.5，4H)，7.72-7.64(m，4H)，7.51(d，J＝8.0，2H)，7.46-7.38(m，4H)，3.57(t，J＝7.2，4H)，1.92-1.87(m，4H)，1.49(s，4H)，1.09(s，8H)，0.55(s，4H)。

将1.92g的分子2(2.5mmol)加入100mL圆底烧瓶中，再依次加入40mL的无水乙醇和0.6mL的98％水合肼混合，加热回流2小时；待加热完成后，收集滤液，再用氢氧化钠溶液冲洗收集的滤液3遍，然后用去离子水冲洗3遍；随后，用无水硫酸钠干燥有机层；经过过滤和蒸发溶剂，得到1.26g的无色油性液体，得到分子3，产率为96.3％。核磁共振波谱仪鉴定产物结构：¹H-NMR(300MHz,，CDCl₃)，δ7.52(d，J＝8.8Hz，2H)，7.47-7.42(m，4H)，2.59(d，J＝7.0Hz，2H)，1.97-1.84(m，4H)，1.67(s，4H)，1.26(d，J＝2.4Hz，2H)，1.08(s，8H)，0.59(s，4H)。

在氮气保护下，分别取0.69g的分子3(1.3mmol)和0.5mL无水三乙胺加入到30mL无水二氯甲烷中，在零度条件下滴加0.4mL的2-甲基丙烯酰氯。将混合物在室温下搅拌2小时，使充分反应。最后，加入5mL去离子水完成反应，再用去离子水冲洗反应液3遍，加入无水硫酸钠干燥反应液，然后过滤掉硫酸钠晶体，蒸发溶剂得到粗产物；最后用柱层析纯化粗产物，以乙酸乙酯/石油醚混合物(体积比1：3)作为洗脱液洗脱得到高纯度的产物，经过旋转蒸发获得0.48g白色固体终产物，即分子4，产率为56％。核磁共振波谱仪鉴定产物结构：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ7.52(d，J＝8.0Hz，2H)，7.45(d，J＝10.2Hz，4H)，2.57(t，J＝7.0Hz，4H)，1.96-1.85(m，4H)，1.49(s，8H)，1.14-1.01(m，8H)，0.58(d，J＝7.8Hz，4H)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：168.38，152.27，140.16，139.09，130.29，126.10，121.53，121.27，119.23，55.60，40.08，39.60，29.50，29.46，26.57，23.54，18.75。

分别称取0.0659g的分子4(0.1mmol)，0.3212g的单体9,9-二辛基芴-2,7-双(硼酸频哪醇酯)(0.5mmol)，0.2194g的单体2,7-二溴-9,9-二辛基-9h-芴(0.4mmol)，13mg的四丁基溴化铵，加入到含有10mL甲苯的圆底烧瓶中，充分搅拌后，缓慢加入5mL碳酸钠水溶液(2.0M)。加入10mg四磷酸(三苯基膦)钯作为催化剂。将反应体系做脱气处理并充入氮气三次，对反应体系在90℃下加热48小时，在聚合完成前，加入10mg(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-酰基)苯，搅拌3小时后，再加入0.1mL的溴苯继续反应，搅拌3小时，完成聚合反应。再利用甲醇沉淀粗产物，然后采用索斯提取器提纯。所得聚合物在60℃真空干燥24小时后，获得114mg灰白色固体，即为所述MA-PFO聚合物。核磁共振波谱仪鉴定产物结构：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ7.84(d，J＝7.4Hz，20H)，7.68(s，40H)，6.99(d，J＝3.0Hz，9H)，5.60(s，1H)，5.25(s，1H)，2.27(s,，11H)，2.12(s，38H)，1.43(s，81H)，1.20(dd，J＝32.3，14.4Hz，300H)，0.82(d，J＝6.0Hz，123H)，0.07(s，46H)。

(2)MA-PFO聚合物点的制备

称取10mg的MA-PFO溶解于10mL四氢呋喃(THF)中，配置成1mg/mL的储液；称取20mg的PSMA溶解于10mL THF中，配置成2mg/mL的储液。分别取300μL的MA-PFO(THF)溶液和15μL的PSMA(THF)溶液加入到含有2.7mL THF溶液的20mL玻璃瓶中，吹吸混匀，将装有10mL去离子水的另外一个玻璃瓶放入超声仪中，确保瓶中液体在超声仪水位之下，吸取上述混匀液，垂直于超声仪中的玻璃瓶，快速注入10mL去离子水中，超声处理1分钟。将样本转移到90℃的加热台，通氮气排除体系中的THF。待THF除尽后，使用0.22μm的滤膜去除制备过程中的异常聚集体，得到所述聚合物点，制备路径示意图如图1所示。

实施例2

本实施例提供了一种聚合物点，所述聚合物点中的聚合物基体如式Ⅱ所示(MA-PFBT聚合物)，R基团为1-甲基丙烯酰-己烷基，摩尔百分比为7％，数均分子量为19234g/mol，重均分子量21978g/mol，分散性指数(PDI)1.14。

上述聚合物点的制备方法包括如下步骤：

(1)MA-PFBT聚合物的制备

分子1、分子2、分子3和分子4所示分子的制备与实施例1相同。

将0.0659g的分子4(0.1mmol)，0.194g的2,1,3-苯并噻二唑-4,7-双(硼酸频哪醇酯)(0.4mmol)，0.2194g的2,7-二溴-9,9-二辛基-9H-芴(0.4mmol)和13mg的四丁基溴化铵，加入到含有10mL甲苯的圆底烧瓶中，充分搅拌后，缓慢加入5mL碳酸钠水溶液(2.0mol/L)。再加入10mg四磷酸(三苯基膦)钯作为催化剂，将反应体系做脱气处理并充入氮气三次。对反应体系在90℃下加热48小时。在聚合完成前，加入10mg(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-酰基)苯，搅拌3小时后，再加入0.1mL的溴苯继续反应，搅拌3小时，完成聚合反应。粗产物用甲醇沉淀，再采用索斯提取器提纯。所得聚合物在60℃真空干燥24小时后，获得255mg黄色固体，即为所述MA-PFBT。核磁共振波谱仪鉴定产物结构：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ8.17-7.88(m，28H)，5.59(s，1H)，5.24(s，1H)，2.27(s，2H)，2.14(s，11H)，1.90(s，4H)，1.46-1.40(m，9H)，1.29-1.03(m，81H)，0.94(s，14H)，0.81(s，22H)，0.07(s，2H)。

(2)MA-PFBT聚合物点的制备

本实施例聚合物点的制备与实施例1的区别在于将MA-PFO聚合物替换为MA-PFBT聚合物，其余均与实施例1的步骤(2)相同。

实施例3

本实施例提供了一种聚合物点，所述聚合物点中的聚合物基体如式Ⅲ所示(MA-PFDTBT聚合物)，R基团为1-甲基丙烯酰-己烷基，摩尔百分比为7％，数均分子量为27570g/mol，重均分子量29359g/mol，分散性指数(PDI)1.06。

上述聚合物点的制备方法包括如下步骤：

(1)MA-PFDTBT聚合物的制备

分子1、分子2、分子3和分子4的制备与实施例1相同。

将0.0659g的分子4(0.1mmol)，0.3212g的9,9-二辛基芴-2,7-双(硼酸频哪醇酯)(0.5mmol)，0.2506g 4,7-双(5-溴-4-己基噻吩-2-基)苯并[c][2,1,3]噻唑(0.4mmol)和13mg的四丁基溴化铵，加入到含有10mL甲苯的圆底烧瓶中，充分搅拌后，缓慢加入5mL碳酸钠水溶液(2.0mol/L)。再加入10mg四磷酸(三苯基膦)钯作为催化剂，将反应体系做脱气处理并充入氮气三次，对反应体系在90℃下加热48小时。在聚合完成前，加入10mg(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-酰基)苯，搅拌3小时后，再加入0.1mL的溴苯继续反应，搅拌3小时，完成聚合反应。将粗产物用甲醇沉淀，再采用索斯提取器提纯。所得聚合物在60℃真空干燥24小时后，获得274mg红色固体，即为所述MA-PFDTBT。核磁共振波谱仪鉴定产物结构：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)，δ8.08(s，7H)，7.80(dd，J＝50.0，43.0Hz，20H)，7.53(s，14H)，7.26(s，4H)，5.59(s，1H)，5.25(s，1H)，2.82(s，13H)，1.98(d，J＝64.1Hz，22H)，1.76(s，17H)，1.54-1.00(m，163H)，0.89(s，22H)，0.85-0.66(m，40H)，0.07(s，10H)。

(2)MA-PFDTBT聚合物点的制备

本实施例聚合物点的制备与实施例1的区别在于将MA-PFO聚合物替换为MA-PFDTBT聚合物，其余均与实施例1的步骤(2)相同。

性能测试

将实施例1-3所述聚合物点进行生物偶联，所述聚合物点的生物偶联具体包括：

聚合物点偶联链霉亲和素：取1mL 50ppm的聚合物点水溶液，20μL羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(1mol/L)，20μL的5％(wt/wt)聚乙二醇(PEG)水溶液和60μL的链霉亲和素(1mg/mL)水溶液依次加入到1.5mL的离心管中，再加入20μL的催化剂碳二亚胺(EDC)水溶液(1mg/mL)，将其置于混匀仪上，在20转/分钟条件下室温反应4小时。待偶联反应结束后，将连接产物和终浓度0.1％(wt/wt)的PEG溶液，20mM的HEPES溶液，0.2％的TritonX-100混合，加入到100KD的超滤离心管中，以4000转/分钟的转速离心4min，去除滤下的游离的链霉亲和素。重复以上操作三次，收集浓缩纯化的聚合物点溶液保存在4℃。

聚合物点偶联免疫球蛋白(IgG)抗体：取1mL 50ppm的聚合物点水溶液，20μLHEPES缓冲液(1mol/L)，20μL 5％(wt/wt)PEG水溶液，45μL的IgG抗体(0.1mg/mL)水溶液分别加入到1.5mL的离心管中，再加入20μL的催化剂EDC水溶液(1mg/mL)，将其置于混匀仪上，20转/分钟，室温反应2小时。为了减少特异性吸附，加入10μL的1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，继续孵育1小时。反应结束后，将连接产物和终质量浓度0.1％的PEG溶液，20mmol/L的HEPES溶液，0.2％TritonX-100混合，加入到100KD的超滤离心管中，以4000转/分钟的转速离心4min，去除滤下的游离的IgG抗体。重复以上操作三次，收集浓缩纯化的聚合物点偶联物溶液保存在4℃。

将实施例1-3所述聚合物点和生物偶联后的聚合物点进行如下测试：

(1)形貌测试：采用Hitachi公司HT7700型透射电子显微镜进行测试，首先，将适当浓度的聚合物点溶液滴加到专用铜网上，待室温干燥后，安装到样本杆上，根据上样步骤将其放入透射电子显微镜样本室中。调节工作电压为100kV，在视野范围中找到合适的区域，切换到倍数更大的电荷耦合器件(CCD)，调节焦距和放大倍数使图像清晰，即可拍摄获得聚合物点的形貌图片。

(2)紫外可见吸收光谱测试：采用日本岛津UV2600系列UV-vis分光光度计进行测试，使用1mL石英四通比色皿，样本体积3mL。测试速度选用正常速度，去背景，扫描范围选择300～800nm。最终光谱数据使用Origin2016软件绘制。聚合物点的浓度通过样本的吸收峰值根据朗伯比尔定律进行标定。

(3)荧光光谱测试：采用Hitachi公司F4600型分光光度计进行测试，样本体积3mL，激发狭缝和接收荧光狭缝均为5。光电倍增管(PMT)电压选为400V。根据不同聚合物点的吸收光谱，确定荧光光谱的激发光参数，选择合适的接收范围。最终光谱数据使用Origin2016软件绘制。

(4)细胞免疫荧光标记：将细胞接种到35mm的玻璃底培养皿(10mm圆形玻底)中，当细胞密度达到80％左右，可用于细胞的免疫荧光标记。用预热的磷酸缓冲液(PBS)润洗细胞。若需要标记微管结构，用抽提液(0.1mol/L哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)，1mmol/L的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，1mmol/L的氯化钙(MgCl₂)，0.2％v/v的Triton X-100)抽提细胞30s，可提高成像质量。随后，轻轻吸走抽提液，用固定液(4％多聚甲醛，0.1％戊二醛)固定细胞15min。用PBS润洗细胞3次，每次1min。用透化液(0.5％TritonX-100)处理细胞5min，目的是溶解细胞膜方便后续抗体进入细胞。用封闭液(5％的BSA，0.1％的TritonX-100)室温封闭细胞30min，减少非特异性结合位点。对于微管结构的单色标记，用含有生物素修饰的抗α微管蛋白(alpha-tubulin)抗体的封闭液常温孵育细胞，37℃孵育1h或者4℃孵育12小时。用PBS润洗细胞三遍，每次5min。用含有偶联链霉亲和素的聚合物点的封闭液常温孵育细胞，37℃孵育1h或者4℃孵育12小时。用PBS润洗细胞3遍，每次5min。最后，留存1mL的PBS保持细胞的湿润，将其进行荧光成像。对于微管、网格蛋白有被小泡、线粒体的多色成像，为了避免交叉标记，每次只使用一种带链霉亲和素的聚合物点荧光探针孵育细胞。随后，再使用不同颜色的聚合物点标记其他细胞结构。对于神经细胞的标记，在体视显微镜下采用无菌解剖剪刀、镊子从刚出生的C57BL/6小鼠中取出海马区，放入装有解剖液(1％抗生素，PBS)的60mm培养皿中。用囊膜剪将海马区轻轻剪碎，转至消化液(胰蛋白酶，PBS)中，37℃条件下消化15min。沉淀组织用平衡盐溶液(HBSS)溶液洗涤3次，无菌巴斯德移液管吹吸剪切6-8次。将混合液离心5min，用添加10％胎牛血清的神经基础培养基重新悬浮。将海马细胞(10000个细胞/mL)置于胶原蛋白1和聚赖氨酸(3:1)预包覆的10mm玻璃底皿中，37℃，5％CO₂培养3h。细胞粘附后，加入生长溶液(96％神经基础培养基、1％谷氨酰胺、2％B27、1％抗生素)维持海马细胞生长。对于神经元突触蛋白的免疫染色，神经细胞用4％PFA固定10分钟，用PBS洗涤三次后，加入0.5％Triton x–100透化5分钟，再用封闭液(5％BSA,0.1％Triton x-100在PBS)封闭30分钟。将封闭好的细胞与小鼠来源的抗巴松蛋白抗体(anti-Bassoon抗体)(ab82958 Abcam)和兔来源的抗荷蒙蛋白抗体(anti-Homer l抗体)(ab184955Abcam)共同孵育1小时。PBS洗涤三次后，用MA-Pdots-IgG偶联物孵育1小时。用PBS润洗细胞3遍，每次5min。最后，留存1mL的PBS保持细胞的湿润，将其置于4度保存或者直接进行荧光成像。

(5)扩展显微成像：生物偶联后的聚合物点应用于扩展显微成像技术的示意图如图2所示。将聚合物点标记好的细胞用PBS润洗一遍。用冷的单体溶液(质量浓度为8.625％的丙烯酸钠，2.5％的丙烯酰胺，0.15％的N'N-亚甲基双丙烯酰胺，PBS，2mol/L氯化钠)润洗玻底区域，随后，将质量浓度为10％的四甲基乙二胺和10％的过硫酸铵按顺序迅速加入到单体溶液中，使两者终浓度为0.2％。将混匀液混匀后取100μL加入到玻底区域，4℃反应1min后转入37℃反应30min。凝胶形成后，用消化液(50mmol的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.5％TrionX-100，1mmol/L氯化钠，8U蛋白酶K)浸泡样本，37℃消化30min。消化完成后，吸除多余的消化液，用镊子小心地将带有样本的凝胶转移到10cm的培养皿中，加入过量的超纯水，使细胞吸水扩展。每隔30min换一次水，4次后凝胶不再胀大，样本实现完全的扩大。

(6)安装和成像：使用直径为40mm的玻璃培养皿用于放置样本，并根据需要剪切凝胶。预先将玻璃培养皿放入等离子体清洗机处理3分钟，随后用质量浓度为0.1％的多聚赖氨酸包被玻璃表面，常温孵育10min。吸走多余的液体，用高压氮气吹干玻璃皿备用。使用配有63×油镜(数值孔径NA 1.4)和HyD高灵敏探测器的徕卡激光扫描共聚焦显微镜采集图像，四通道宽场显微镜，分别使用405nm、448nm和514nm固体激光器激发蓝色、绿色和红色荧光团，多波段滤光片组控制不同发射范围的荧光。共聚焦显微镜的采集速度为200Hz，像素尺寸为184.52μm。为了分析聚合物点的自相关特性，用配备TIRF光源的尼康显微镜上(尼康，TIRF-E，日本)的100倍TIRF油镜(尼康，日本；NA，1.49)进行单粒子成像。使用配备有Andor集成激光设备(405nm、488nm、561nm激光)、Yokogawa CSU-X转盘单元(max:5000rpm)和电子倍增电荷耦合器件(iXon Life897，Andor)的转盘共聚焦显微镜记录三维时序图像。采用APO 100×oil/NA 1.49物镜拍摄。在转盘共聚焦显微镜上连续采集4个平面的原始数据(每平面500帧，每步250nm)，曝光时间为100ms。

(7)扩展显微成像扩大倍数和扭曲程度分析：

a)采集扩大前后样本的荧光图像：由于凝胶的扩大倍数在4～5倍不等，后续分析要求两者从肉眼上看尽量相似，默认其初始扩大倍数为4倍。利用ImageJ软件，将扩大前的图像像素数插值扩大4倍，同时将扩大后的图像进行4倍的高斯模糊，以便前后图像的配准。将处理后的图片保存为raw.data和.mhd源文件格式。

b)计算扩大倍数：利用Elastix来读取扩大前后的.mhd文件，通过刚性的相似性变换程序运算得到变换参数，在缩放因子的基础上乘以上述人为扩大的4倍即为扩大倍数。若样本是各向同性的扩大，运算后得到的经缩放、旋转、平移等新的扩展后的图像，它在最大程度上可与扩大前的图像配准。

c)绘制形变矢量图：利用上述相似性变换得到的新扩展后的图与原有的扩大前的图作为对比对象，通过非刚性的B-spline变换程序进行形变比对，B-spline配准会对扩大后的图像进行扭曲，以最佳的匹配扩大前的图像。若样本是各向同性的扩大，运算非刚性变换程序后得到的新的扩大后的图与输入的刚性相似性变换程序得到的图只有很小的形变。

d)计算均方根误差：在扩展显微成像技术中，误差定义为一根微管上两个点在扩大前后欧式距离的变化。通过提取微管骨架的坐标信息，使用B-spline配准的变换参数文件来计算扩大前后长度的差值，分组计算差值的均方根误差，根据所获数据绘制均方根误差图。

(8)SOFI分析：首先用基于亚像素漂移校正算法的Matlab 2017b代码(MathworksInc.，USA)进行校正，经过漂移校正后，用Matlab代码提取单粒子强度轨迹和相应的间隙时间间隔数据。通过soficumulant函数进行SOFI图像重建。

测试结果汇总于图3a-图13j中。

分析图3a-图3e可知，侧链含有MA的聚合物点(MA-Pdots)表现出与原聚芴聚合物点相似的强光学和胶体特性。MA-PFO Pdots在紫外区有378nm的峰值，BT和DTBT单体的引入导致MA-PFBT Pdots和MA-PFDTBT Pdots分别在蓝色和绿色区出现吸收带，在紫外激发下，所有的MA-Pdots显示出强烈的荧光，而且MA-PFO、MA-PFBT和MA-PFDTBT Pdots分别表现出蓝色(438nm)、绿色(558nm)和红色(672nm)的荧光发射。除此之外，MA-Pdots水溶液具有良好的胶体稳定性，几个月没有聚集的迹象；为了进一步标记生物分子，将经MA修饰的聚合物点与链霉亲和素结合，通过图3c动态光散射法测定纳米颗粒大小的增长情况(约6nm)来确定偶联反应成功，图3c中动态光散射确定了MA-PFO Pdots、MA-PFBT Pdots和MA-PFDTBTPdots的粒径分别为18nm、16nm和15nm，图3d的TEM图像显示了直径约为20nm的聚合物点的单分散性和球形形态，图3c和图3d的测量结果一致；图3e中Zeta电位测量显示MA-Pdots、与链霉亲和素偶联后的聚合物点在水溶液中均具有良好的胶体稳定性。

分析图4a-图4c可知，MA-PFO Pdots、MA-PFBT Pdots和MA-PFDTBT Pdots与链霉亲和素结合后形成的荧光探针对亚细胞显示了高度特异性和明亮的标记，在相同的激发和获取条件下将其与链霉亲和素偶联的Alexa荧光团标记后的亚细胞结构相比，即由图4d-图4f与图4a-图4c对比可知，图4a-图4c显示出优异的亮度，对于上述图像做定量分析，如图4g所示，MA-Pdots的信号背景比比它们对应的Alexa染料的信号背景高3-6倍；MA-Pdots和它们对应的Alexa染料的平均荧光强度如图4h所示，其中，MA-PFO的平均荧光强度比Alexa 405高6倍，而MA-PFBT Pdots和MA-PFDTBT Pdots的荧光强度比Alexa 488和Alexa 594的荧光强度高约3.0倍。

分析图4i可知，MA-PFO和MA-PFDTBT Pdots分别能有效靶向线粒体膜和酪氨酸化的α微管蛋白，两个收集通道之间很少有串扰，细胞内微管清晰，其中，线粒体呈球形或棒状，信号背景比高；同样，分析图4j可知，经链霉亲和素偶联后的MA-PFO Pdots和MA-PFBTPdots标记同时体现了网格蛋白有被小泡和alpha-tubulins的相对空间位置，这些结果证实了这三种类型的MA-Pdots具有较高的亮度和特异性，可以成功地应用于多色亚细胞标记。

通过使用改进的ExM方案，将MA-Pdots染色的细胞直接嵌入凝胶溶液中，然后进行消化和溶胀过程。图5a显示了MA-Pdots标记的培养细胞在扩展前后的共聚焦成像。分析图可知，应用MA-Pdots的ExM成像显示了高保真的微管结构，与试样扩展前的图像一致。通过直接比较相同区域，可以直观地看到分辨率增强(图5b-图5c)。如图5d所示，扩展后微管的横截面剖面图的半高全宽(FWHM)为89nm，与扩展前共焦图像的衍射极限分辨率(约等于280nm)相比，提高了4倍。为了验证MA-Pdots应用于ExM的各向同性扩展，图5e定量分析BS-C-1细胞扩展前后的微管图像表明失真非常小，均方根误差小于测量距离的1％，进一步说明样本的扩展均匀性。由于标记密度的降低和凝胶形成过程中自由基的破坏，凝胶扩展过程中MA-Pdots的荧光损失是不可避免的，这与传统的荧光团类似，如有机染料和荧光蛋白，而如图6a-图6f所示，MA-PFO-tubulin、MA-PFBT-tubulin和MA-PFDTBT-tubulin的平均荧光强度分别明显高于Alexa 405-tubulin、Alexa 488-tubulin和Alexa 594-tubulin，说明本发明所述聚合物点能在ExM中实现良好的应用。

本发明使用一种特殊的扩展缓冲液，其中含有表面活性剂，以提高MA-Pdots扩展后的标记亮度。聚合物点的荧光亮度是由吸收截面和荧光量子产率决定的，这与纳米颗粒的大小和聚合物的填充构象密切相关。由于聚合物点的MA基团与凝胶交联，聚合物构象在凝胶扩展过程中会被延展，表面活性剂能够通过减少链间相互作用来增强共轭聚合物的荧光。

假设表面活性剂可以通过扩展聚合物点的构象来放大扩展后的荧光。为了验证这一假设，通过将三种类型的MA-Pdots与不同类型的表面活性剂(Triton X-100、吐温20、CTAB和SDS)孵育来测量其荧光强度。

从图7a-图7c可以看出，随着表面活性剂浓度的增加，MA-Pdots的荧光增强效果明显，其中含有Triton x-100的缓冲液孵育的Pdots荧光增强效果最强。

如图8所示，Triton X-100的质量浓度较低(＜1.6％)的扩展缓冲液不影响凝胶的大小和样品的各向同性扩展。

如图9a-图9f所示，使用含Triton x-100缓冲液标记MA-Pdots的微管明显比使用无表面活性剂缓冲液标记的微管更亮。

综上所述，如图10所示，Triton X-100缓冲液处理扩展后的MA-PFO的平均荧光强度比链霉亲和素(streptavidin)偶联的Alexa 405高约6倍，而Triton X-100处理扩展后的MA-PFBT和MA-PFDTBT的荧光强度分别比Alexa 488和Alexa 594高约3倍。由于聚合物点的高标记亮度，用MA-Pdots标记的生物分子在扩展后显示出高信号背景比，这为亚细胞结构在高分辨率条件下的可视化铺平了道路。

本发明通过在共聚焦显微镜上捕获了扩展的非洲绿猴肾(BS-C-1)细胞的三维图像，如图5f所示的带颜色编码的α微管蛋白深度投影显示了细胞骨架结构沿Z轴的1μm的空间位置，观察发现原本致密的微管结构在扩展后变得更容易区分，这表明MA-Pdots能够沿凝胶网络有效地在所有三维空间传递样品信息。此外，通过MA-Pdots染色检测参与细胞囊泡系统的网格蛋白有被小泡(CCP)，由于ExM的4倍的分辨率提高，图5g、图5h和图5i清晰地显示出CCP的空心甜甜圈状结构，这是扩展前共焦显微镜图像不能分辨出来的。图5j显示扩增后微管的平均宽度为77nm(n＝30)。经计算，CCPs(n＝28)的平均直径约为174nm(图5k)，与电镜和STORM成像观测到的粒径分布(0.15～0.2μm)一致。

在不同的激发条件下，本发明通过不同类型的MA-Pdots可以获得多色ExM(如图11a-图11b所示)，还进一步观察MA-Pdots在C57BL/6小鼠海马细胞突触结构可视化中的表现。除此之外，分别用免疫球蛋白偶联后的MA-PFO Pdots和MA-PFBT Pdots标记突触前支架蛋白Bassoon和突触后支架蛋白Homer，结果如扩展图5l显示，Bassoon和Homer蛋白被清晰地分解；图5m中突触蛋白之间的距离约为180nm。这些成像图中显示出亚细胞结构和神经元突触的细节，分辨率约为80nm，表明了MA-Pdots在多色ExM成像中的优越性能。

最后，本发明利用扩展后MA-Pdots的荧光涨落，证明了成像分辨率能进一步被增强(高达30nm)。先前的研究表明，Pdots的单粒子荧光可以通过空穴极化子的复合来调节，这使得开发光致开关探针成为可能。而基于Pdots在超分辨率成像中的成功应用，将ExM与其他超分辨率方法结合可以进一步提高基于Pdots的ExM的分辨率。SOFI是一种超分辨率技术，允许通过分析时序图像来提取每个像素上的波动信号，从而重建分辨率增强的图像，荧光探针的涨落特性是SOFI成像的关键决定因素。值得注意的是，实验证明含表面活性剂的扩展缓冲液不仅增强了MA-Pdots的荧光亮度，而且如图12a-图12b所示，还增强了扩增后MA-Pdots的单粒子荧光自相关功能，这代表MA-Pdots的波动特性得到了改善。

本发明进一步研究了MA-Pdots作为荧光探针用于ExM增强的SOFI成像的适用性。最初，在配备了全内反射荧光(TIRF)模块的尼康显微镜上收集了用MA-Pdots标记的放大微管的时序图像。经过八阶SOFI累积分析，重构图像与宽场平均图像相比，结构分辨率有明显提高(图13a和图13b)。如图13c和13d所示，经过SOFI分析后的扩后微管的横切剖面，MA-PFOPdots的FWHM约为28nm，PFBT Pdots的FWHM约为33nm。尽管经生物偶联后的聚合物点可能会在一定程度上增加标记目标物的实际尺寸，这些值与微管的直径相当。离焦平面的荧光信号会影响整体成像质量，所以在宽视野显微镜下对厚样品进行荧光成像比较复杂。因此，利用旋转圆盘共聚焦显微镜记录扩展后微管的时序图像，以提高空间分辨率。转盘(SD)共聚焦图像和重构SOFI图像如图13e、图13f和图13g所示。通过二阶、三阶和四阶互累积量分析，与平均转盘共焦成像的ExM分辨率(约150nm)相比，ExM增强的SOFI微管分辨率如图13h所示，分别提高了1.4倍、2.0倍和2.7倍。基于转盘共聚焦显微镜的光学切片能力，以及SOFI的3D PSF调制，进一步研究了MA-Pdots标记的扩展线粒体膜的z堆叠，SD平均图像与SOFI四阶图像的比较如图13i和13j所示，与图13i相比，由于信号背景比和分辨率的提高，图13j中详细的线粒体特征得到了很好的体现。这些结果表明，MA-Pdots探针将有利于多模态超分辨率成像方法用于多种生物研究中，如基于扩展显微成像和超分辨光学涨落成像的三维超分辨成像(3D-Ex-SOFI)。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (27)

1.一种聚合物点，其特征在于，所述聚合物点包括侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚苯乙烯马来酸；

所述聚芴材料和聚苯乙烯马来酸形成团聚体，所述聚芴材料中的甲基丙烯酰基团和聚苯乙烯马来酸中的羧基暴露于所述团聚体的表面；

所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料包括式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示的聚合物中任意一种或至少两种的组合；

所述R基团选自1-甲基丙烯酰-正己烷基；

式Ⅰ中所述m与n的摩尔比为(5-8):(92-95)；

式Ⅱ中所述o、p与q的摩尔比为(5-8):50:(42-45)；

式Ⅲ中所述x、y与z的摩尔比为(5-8):50:(42-45)；

所述甲基丙烯酰基团在所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料中的摩尔比为5％-8％。

2.根据权利要求1所述的聚合物点，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料的数均分子量为15000g/mol-30000g/mol。

3.一种根据权利要求1或2所述的聚合物点的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液混合后在去离子水中共沉淀，再去除溶剂，得到所述聚合物点。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液的质量浓度为0.5-1.5mg/mL。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液的质量浓度为1mg/mL。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液的质量浓度为1.5-2.5mg/mL。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液的质量浓度为2mg/mL。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液中的溶剂包括四氢呋喃。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液的体积比为(1:0.03)-(1:0.08)。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液的体积比为1:0.05。

11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：在侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料溶液和聚(苯乙烯-马来酸酐)溶液混合后进行稀释，得到侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)的混合液；

所述稀释的溶剂包括四氢呋喃。

12.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述共沉淀在超声仪中进行。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述共沉淀具体包括：将侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)的混合液，在超声震荡的条件下注入去离子水，完成共沉淀。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)的混合液与去离子水的体积比为(2-4):(8-12)。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)的混合液与去离子水的体积比为3:10。

16.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的时间为0.5-1.5分钟。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理的时间为1分钟。

18.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述去除溶剂的温度为85-95℃。

19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述去除溶剂的温度为90℃。

20.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述去除溶剂在通氮气的条件下进行。

21.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在去除溶剂后过滤。

22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述过滤使用的滤膜的孔径为0.2-0.3μm。

23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述过滤使用的滤膜的孔径为0.22μm。

24.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述侧链含有甲基丙烯酰基团的聚芴材料的制备方法包括如下步骤：将2,7-二溴芴、四丁基溴化铵、1,6-二溴己烷和氢氧化钠水溶液混合反应，得到分子1，再将分子1、邻苯二甲酸亚胺钾盐和二甲基甲酰胺加热混合反应，得到分子2，然后将分子2、无水乙醇与水合肼反应形成分子3，再将分子3、无水三乙胺、无水二氯甲烷和2-甲基丙烯酰氯混合反应，得到分子4；

将分子4、分子5和分子6反应，得到式Ⅰ所示的聚合物；

或者，将分子4、分子7和分子8反应，得到式IⅠ所示的聚合物；

或者，将分子4、分子9和分子10反应，得到式IIⅠ所示的聚合物；

反应路径如下：

所述R为1-甲基丙烯酰-正己烷基。

25.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将聚芴材料和聚(苯乙烯-马来酸酐)分别进行溶液配制后混合，稀释，再在去离子水中超声处理0.5-1.5分钟完成共沉淀，再在85-95℃温度下通氮气去除溶剂，过滤，得到所述聚合物点。

26.一种生物偶联后的聚合物点，其特征在于，所述生物偶联后的聚合物点由权利要求1或2所述的聚合物点和链霉亲和素或免疫球蛋白抗体偶联得到。

27.一种根据权利要求26所述的生物偶联后的聚合物点在细胞免疫荧光标记及扩展显微成像中的应用。

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