CN109385269B - 一种pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备方法，是先将亲水性聚丙烯酸与疏水性的TPE分子通过共价连接制得兼具pH敏感和AIE特性的聚合物，该聚合物进一步与稀土元素Eu(III)发生配位，形成具有双荧光性质的配合物，该配合物能够自组装形成单分散性的、尺寸在100nm范围内的纳米小球，同时表现出很好的双荧光特性，在365~400nm激发范围内两种颜色能够很好的独立分开。Hela细胞染色结果表明，该Pdots能很好的对癌细胞进行染色并在细胞质中聚集从而产生高亮荧光；在365 nm激发时能产生明亮的蓝光，在395 nm激发时产生高亮的红光，因此，在生物细胞成像中具有很好的应用前景。

Description

一种pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备和应用
技术领域
本发明涉及一种pH敏感型双荧光聚合物量子点（Pdots）的制备，尤其涉及一种基于四苯乙烯（TPE）和聚丙烯酸（PAA）的pH敏感型双荧光聚合物量子点（Pdots）的制备；本发明同时还涉及该聚合物量子点（Pdots）在双色活细胞成像中的应用。
背景技术
pH敏感聚合物量子点Pdots是最受欢迎的纳米材料之一，主要是因为生物体内各组织的pH环境各不相同，比如一般肿瘤细胞的pH呈酸性，而正常组织一般为中性或弱碱性。pH 敏感Pdots的典型特点是可以在生物体内通过荧光的亮度来定位靶细胞的位置，例如Zhang等人将pH敏感的聚丙烯酸和稀土元素配位制得发淡红光的纳米材料。Chan等制备了一种大共轭结构且pH敏感的Pdots，pH不同时产生不同颜色的荧光，可以应用在不同pH的细胞成像中。也有人通过引入pH敏感的聚合物和药物键合制备的敏感性聚合物纳米粒子，这类 pH 敏感类聚合物药物载体Pdots能够在酸度较窄范围（6.5~7.0）内对药物释放，但是，这类聚合物受pH的变化粒径开始变大或纳米粒子开始形成或瓦解。
聚丙烯酸是由丙烯酸单体聚合而成的线性聚合物，且含有大量的羧基基团，容易在水溶液中形成凝胶，在pH敏感、光响应、药物释放等领域具有很好的应用前景。当pH呈碱性时聚丙烯酸表面的羧基会失去氢离子，电负性增强，呈碱性，静电作用加强。聚丙烯酸纳米颗粒会受到外界刺激而诱导其膨胀、收缩或生物相容性变化。
TPE（四苯乙烯）是一种经典的AIE（Aggregation Induced Emission 聚集诱导发光）分子，即在溶液中没有荧光，但是固体却存在较强的荧光，与传统聚集淬灭分子刚好相反，因此在有机光电材料等领域具有重要的应用，也越来越多的引起人们的关注。
发明内容
本发明的第一目的，是提供一种基于四苯乙烯和聚丙烯酸的pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备方法；
本发明的另一目的是，提供该聚合物量子点（Pdots）在双色活细胞成像中的应用。
一、pH敏感型双荧光聚合物量子点（Pdots）的制备
本发明将亲水性聚丙烯酸与疏水性的TPE分子通过共价连接制得兼具pH敏感和AIE特性的聚合物，由于聚合物链上含有大量的羧基，其进一步与稀土元素Eu(III)发生配位作用，制备得到具有双荧光性质的Pdots。其具体制备工艺如下：
1、TPE-tetraPAA聚合物的制备
（1）TPE-tetraOH的制备：THF作为溶剂，在真空无水无氧环境下，以Zn粉为还原剂，4,4-二羟基二苯甲酮与四氯化钛以1:1~1:2的摩尔比，于70~75℃的油浴环境中反应22~24h，用K2CO3溶液猝灭反应，用乙酸乙酯萃取、收集、旋蒸干燥，得到棕黄色的产物TPE-tetraOH；Zn粉的加入量为4,4’-二羟基二苯甲酮摩尔量的1~2倍；
（2）引发剂TPE-AZO的制备：将TPE-tetraOH和偶氮-4,4’-二氰基戊二酸（ACVA）以1:4~1:6的摩尔比溶解在THF中，再加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）和脱水剂二环己基碳二亚胺（DCC），在真空无水无氧环境下，于70~75℃反应20~24h后，冷却、过滤，滤液用甲苯沉淀，过滤，滤液旋蒸干燥，即得TPE-AZO；DMAP的加入量为TPE-tetraOH的摩尔量的3~4倍；DCC的加入量为TPE-tetraOH的摩尔量的1~2倍；
（3）TPE-tetraPAA的制备：将引发剂TPE-AZO与丙烯酸单体以1:100~1:200的摩尔比溶于THF中，于70~75℃真空反应22~24h，冷却至室温，加正己烷沉淀出聚合物，纯化，真空干燥，即得聚合物TPE-tetraPAA。
2、TPE-tetraPAA-Eu(III)配合物的制备
将聚合物TPE-tetraPAA溶于无水乙醇中，再注入EuCl3溶液，搅拌20~24 h充分发生配位反应后，用正己烷沉淀出聚合物，纯化，真空干燥，得到淡粉色的粉末，即为目标产物TPE-tetraPAA-Eu(III)。TPE-tetraPAA与EuCl3的摩尔比为1:10~1:50。
3、TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots的构筑
Pdots纳米结构的构筑是利用共沉淀的方法制得：将TPE-tetraPAA-Eu(III)配合物超声分散于无水乙醇中，形成澄清透明的溶液；在超声作用中缓慢滴加不良溶剂二氯甲烷，直至溶液颜色由透明变为淡灰白色，停止滴加不良溶剂，继续超声处理20~25 min后冷冻干燥，得到TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots。
二、TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的表征
1、结构表征
图1为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots 的1H-NMR谱图。由图1可以看出，聚合物TPE-tetraPAA和稀土元素Eu(III)的配位作用，导致配体相应元素的结合能发生变化，稀土元素很容易与具有孤对电子的非金属元素（如O、N等）发生配位作用。
2、XPS图谱
图2为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots各元素的XPS能级谱图。XPS谱图能够提供分子结构精确的结合能和共价电子结构信息，通过测试TPE-tetraPAA、TPE-tetraPAA-Eu(III)中配位元素碳、氧的结合能的变化，可以进一步确定配合物的结构。从图2中可以看出：C-O、C=O键上的O1s的结合能强度增加了，而碳的结合能基本不变，主要原因是Eu(III)对O元素的配位作用使得C-O、C=O键的结合能减弱了，配合物内能也降低，从而整个配合物更加趋于稳定。这一结果进一步表明，TPE-tetraPAA-Eu(III)是通过Eu(III)和聚合物链上的羧基的氧元素发生配位形成的，Eu(III)的引入导致O元素上的电子云密度降低，Eu(III)的电子云密度增加。只有在Eu(III) 的配合物中，Eu3d、Eu4d的结合能强度也被观察到。说明Eu(III)与PAA上的羧基发生了配位作用。
3、红外光谱
红外光谱数据可以获得该聚合物官能团的特征吸收数据。TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots的红外谱图如图3所示，聚合物的官能团羧基在1750~1720cm-1处的吸收在配位前后发生了很明显变化，吸收峰变宽，3200~3000cm-1处为羟基宽的吸收峰，1400cm-1和约920cm-1处为羧酸的弯曲振动吸收峰，确定了羧酸结构的存在。而烷基链上C-H伸缩振动的吸收峰在2900~3000cm-1处被大量羟基的吸收峰所覆盖。可见Eu(III)的配位使得指纹区内的其他官能团的吸收峰消失，出现这种结果的主要原因在于配位作用使得聚合物分子内键的摆动、扭曲等形变减少。PAA的特征吸收峰在1500~1520 cm–1（C=O伸缩振动）和 1070~1090 cm–1 （C-O伸缩振动）也相应出现。
4、紫外吸收光谱
为了进一步探究其发光性质，首先测试了TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots紫外吸收光谱（UV-vis）。Pdots的紫外吸收光谱如图4所示，在配合物TPE-tetraPAA-Eu(III)中，铕的引入使得配合物对280~380nm范围内的紫外光吸收更强了。谱图中，在200~300nm波长范围内，由于空气中的二氧化碳的紫外吸收也处于该区域，而聚合物在该区域内的荧光转化效率（荧光发射峰面积比紫外吸收峰面积）较小，所以只考虑该配合物在280~380nm范围内的紫外吸收。进一步发现该配合物对长波长的激发光吸收较好，而TPE的最佳激发波长为360nm，TPE和PAA共价键结合在一起，使得PAA对可见光波长范围内的光吸收增强，根据能量共振转移原理，这有利于配合物在该波长区域内激发而产生更强的荧光，如被激发出红色荧光。配合物对近紫外和可见光的吸收能力更强、范围更宽，能更高效地吸收激发能，从而使更多的第一能级基态电子跃迁到高能级，更多的激发态电子以光的形式释放能量，降低了辐射能的消耗，从而增强了发光效率。
5、扫描电镜图
TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的扫描电镜图片见图5。从图5中可以看出，该Pdots的尺寸大约在50nm，因为该Pdots中的PAA分子段是具有很强亲水性的，容易在分子间发生交联，所以形成Pdots时容易发生小球的团聚。
三、TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的性能
1、AIE特性
对于纳米级发光粒子而言，粒子的分散状态严重影响其发光强度，如量子点等的聚集致荧光猝灭（ACQ）现象，荧光聚合物链在高浓度下的聚集或分散对荧光强度的增加或减少能表明Pdots的AIE性能。为了从量变的角度解释Pdots的AIE行为，我们将TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots在溶液中的聚集状态和浓度发生变化时，分别测试了相应溶液的荧光强度。
TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的浓度和聚集对荧光的变化如图6所示。其中图a（左）为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots水溶液荧光强度随浓度变化趋势图。从图a可以看出，Pdots在水相中表现出很好的溶解性，在浓度对荧光强度的关系中，在360nm激发下，10 mg/mL低浓度溶液的荧光强度较低，可以观察到460nm、615nm的双色荧光，随浓度在10~50 mg/mL范围增加时相应荧光强度也会增强，当浓度再增大时，PAA分子段比TPE端的比例显著增多，PAA的荧光占据了主导地位。图b（右）为相同浓度的Pdots溶液在不同程度聚集状态下的荧光强度变化。从图b可以看出，在Pdots的乙醇溶液中，滴加不同体积二氯甲烷，使其聚集程度不断增加。在无水乙醇中，Pdots的蓝色荧光强度较低，甚至不发光，相反的随二氯甲烷的加入荧光强度逐渐增加，Pdots的聚集程度随之增加，溶液的蓝色荧光（TPE的荧光）强度增加，整个过程中红色荧光（铕配合物的荧光）强度基本不变，当聚集状态增加至一定程度时Pdots出现沉淀，会使溶液有效荧光强度降低，结果也表明Pdots的聚集致发光性能。当TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots溶于良溶剂无水乙醇时分子链几乎完全舒展开，TPE上苯环的摆动空间比较大，当被激发时，配合物能以苯环的振动以热能的形式将激发能耗散掉，从而光能利用率较低地产生了荧光；当不良溶剂二氯甲烷的体积分数增加，促使分子聚集，分子间距较小，阻碍了分子中苯环的振动和减少了分子链活动空间，使得分子不能以热能的形式耗散激发能，从而增加了荧光产率。聚集致发光性质不仅是该材料能在固体下呈现很好的荧光，还使得在细胞吞噬的状态下荧光更强，更有利于在生物学领域开阔其应用前景。
2、Pdots的敏感性
我们考察了该Pdots在环境改变时对光的吸收或发射的情况。图7 为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots水溶液在365 nm处的透过率随温度变化关系。从图7发现，温度的改变也会影响该配合物的透光率和荧光效率，不难理解，荧光强弱受激发态电子能量影响，荧光效率受温度的影响较大，配合物的配位键能不稳定，温度升高时分子内运动加剧，Eu(III)对聚合物的配位作用减弱，使Eu(III)在溶液中的溶解度下降，溶液的透光率下降。在低温状态时，PAA分子上的羧基能够与水分子之间形成稳定的氢键，使聚合物周围形成一层水膜，分子很好地分散在水溶液中，当温度较高时，水分子膜破坏，聚合物链上羧基向内收缩，烷基链逐渐伸向外延，外层形成疏水性的烷基链，聚合物的在水溶液中聚集程度增加，对360 nm光的透过率减小。
此外，我们考察了温度对该Pdots的荧光性质的响应。图8为在360 nm激发下TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的荧光强度受温度的响应。可见，Pdots的蓝光和红光发射变化都不明显，TPE-tetraPAA-Eu(III)中由于PAA的引入，TPE的特征峰为410nm处的发射强度受温度的变化而变化，温度在20~32.5℃之间升高时，蓝色荧光强度逐渐减小，在32.5~37.5℃范围内升高温度时荧光强度反而升高，温度更高时，蓝色荧光再次降低，而整个过程中红色荧光的强度保持不变，不难理解，因为该Pdots再升高温度时聚集程度增加，该Pdots的AIE特性使得荧光增强，但由于分子热运动加聚，激发态的电子主要以热的形式释放出能量，从而荧光效率降低，在宏观上表现为对激发光的吸光度增加而荧光强度减弱。当温度较高时，该Pdots的荧光强度受温度和AIE特性的双重作用。
聚合物PAA是pH敏感性聚合物，主要原因是PAA链上含有大量的-COOH，该聚合物含有酸度解离常数pKa（约为4.28）值，pH在该值以下时，分子中羧基主要以-COOH的形式存在，聚合物主要表现为疏水性，而pH高于pKa值时，羧基主要以-COO-的形式存在，聚合物主要表现为亲水性。pH的变化对聚合物在水相溶液中的亲疏水性的改变，从而导致聚合物的光学性质的变化，这也是该聚合物对pH敏感的主要原理。图9为Pdots在 365nm激发下荧光强度受pH变化的关系（其中，左图为不同pH下Pdots荧光光谱，右图为Pdots在420 nm及615nm处荧光光度随pH的变化曲线图）。图9显示，Pdots水溶液的pH在1~14范围内，有如下几个阶段的荧光变化：在pH1~5范围内升高时，蓝色荧光强度缓慢增强；在pH5~9范围内，蓝色荧光强度增加迅速；pH值再升高时，荧光强度却再次减小，因为在酸度、碱度很高的水溶液中，TPE的荧光强度较弱，酸度较低时溶液中的羧基以-COOH形式存在，聚合物主要表现为疏水性，分子的羧基向内聚集，TPE被包覆在PAA聚合物链中，荧光强度较低，pH值升高至中性过程中，聚合物链的团聚结构逐渐解开，TPE的发光影响减少，PAA链分子逐渐解开，聚合物的蓝色荧光增强；当溶液的碱度增加时，溶液中出现了大量的OH-，聚合物链上的羧基以-COO-的形式存在，表现为亲水性，在溶液中的Eu(III)和氢氧根离子结合形成更稳定的配合物而沉淀出来，使得溶液的荧光强度降低。
3、Pdots的双荧光性质
图10为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots在不同激发下的双荧光发射图。有图10可见，该Pdots是一种具有双荧光性质的纳米粒子，配合物TPE-tetraPAA-Eu(III)的荧光受激发波长的不同而不同，在360~400 nm范围内可以使配合物的颜色有蓝色渐变成红色，并且两种颜色互不干扰。在360~390 nm范围内材蓝色发光占主导作用，表现出蓝色光，主要是结合了PAA和TPE的特征光分别在400nm和460nm，这两个峰半峰宽较大很难分开但都处在蓝光范围内，所以溶液的荧光整体呈现蓝色，而在390~400nm范围内蓝光强度逐渐减弱、红光强度增强，红光最后占据主导作用，表现出的红光主要是铕的配位产生的色纯度很高的两个红色可见峰，即为590nm和614nm的相应于5D0→7F1， 5D0→7F2电子跃迁而释放的荧光。
图 11为 TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots在不同激发下的CIE色度图。可以看出，在标准色板上TPE-tetraPAA-Eu(III) 呈现出一条复合光的直线。该 Pdots 分别在激发波长365 nm、400 nm时分别表现出最明显地蓝色、红色发射，表现出双荧光性质。由两个450 nm、615 nm的发射带组成，两个发峰之间有195 nm波长的间距隔开，提升了检测和成像分析的分辨率，450 nm处的发射是由Pdots里的AIE团簇TPE的发光，615nm处的发射带可以认为是Eu(III)配合物的发光。实际上，铕配合物的发光为590nm和615nm的两个非常窄、发射强的特征峰，最显著的发射峰在615 nm（5D0→7F2），也是TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的主要红色发光，据报道称Eu(III)配合物的含量的增加也会促进Pdots的发射。
综上所述，双荧光测试结果表明两种Pdots材料均可通过调节激发波长可逆调控发光颜色。其中，通过逐步增加365~400 nm 范围内激发波长，TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots的发光颜色逐渐从蓝光转变为红光，当在365 nm激发时蓝光远强于红光，而当激发波长为395 nm时，TPE-tetraPNIPAM-Eu(III) Pdots红光远强于蓝光，且由裸眼即可观察到这一转变（见图11）。
4、双色活细胞成像
我们在十二孔平板细胞板培养Hela细胞24h，培养基质为含有1%的链霉素和10%的胎牛血清1640溶液，在含有100μg/mL TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的培养基和湿度为5%和37℃的条件下培养一天后，分离出两个培养基中细胞并用磷酸盐缓冲溶液冲洗，再用培养好的细胞进行双色荧光的检测。Pdots能产生高亮红色和蓝色的双荧光，在360nm激发下产生蓝色的发光和395nm激发下的红色发光，该Pdots可以在细胞环境内产生蓝色和红色相复合的细胞成像，因此，我们探究了该Pdots在活细胞中的可调双荧光的性能，选择Hela细胞为Pdots在细胞成像应用的模板。Pdots在生物上应用时评价细胞毒性是至关重要的依据，测试被染色Hela细胞的存活率是评价Pdots能否在生物应用的重要依据。如图12所示，在不同浓度的Pdots（50~400 μg/mL）中培养Hela细胞48h后仍然有超过95%的细胞存活，Pdots浓度高至200μg/mL时Hela细胞的存活率也特别显著，表明该Pdots在细胞存活率实验仍然没有细胞毒性，也就是能应用在细胞成像实验中。
对Pdos的可调双色光显影实验是用共聚焦激光扫描显微镜对Hela细胞的观察实验，Pdots浓度都是在100 μg.mL-1下培养Hela细胞24h标记后，观察到蓝色、红色双色荧光信号在Hela细胞质中聚集，表明Pdots都能够自由通过细胞膜进入细胞质，保留了可调双色荧光的性能，而且在细胞质区域内聚集程度较高荧光强度较强，但没有进入细胞核，核内没有Pdots的积累。即该Pdots可以选择性地对Hela细胞质进行染色，在360nm激发光下，细胞中能够观察到TPE发出的蓝色特征峰，当温度调至395nm时，铕配合物的红光在细胞质中能够非常明显地看到，表明TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots可以作为一种荧光标记材料在生物成像中应用。
综上所述，本发明制备了以经典分子TPE为中心分子，四臂偶氮引发剂TPE-AZO原位引发聚合丙烯酸单体制得pH敏感性的PAA为基础的聚合物，聚合物链上的羧基能够和稀土元素配位，形成具有双荧光性质的配合物TPE-tetraPAA-Eu(III)，该配合物能够自组装形成微球，尺寸约为纳米级，这种Pdots能自组装成单分散性的、尺寸均在100nm范围内的纳米小球，同时表现出很好的双荧光特性，在365~400nm激发范围内两种颜色能够很好的独立分开。此外，该Pdots能够受pH的控制而改变荧光强度，温度对荧光的影响比较显著，温度升高至32.5℃时，该Pdots对360 nm光的透过率逐渐减小，在37.5 ℃之后温度不高的范围内，其水溶液的透过率保持不变。通过对该Pdots的双荧光性质的研究，发现在不同的激发波长下能够产生蓝色和红色的复合光，尤其是在365nm激发时能产生明亮的蓝光，在400nm激发时产生明亮的红光。此外，Hela细胞的染色结果表明，该Pdots能很好的对癌细胞进行染色，并在细胞质中聚集，从而产生高亮荧光，在365 nm激发时能产生明亮的蓝光，在395 nm激发时产生高亮的红光，因此，该Pdots在生物细胞成像中的应用，为未来低毒性的新型Pdots的开发和在生物医学领域的应用提供借鉴和参考。
附图说明
图1为 TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots 的1H-NMR谱图。
图2 为pH敏感性的Pdots各元素的XPS能级谱图。
图3为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的红外谱图。
图4为 pH敏感性的Pdots的紫外吸收光谱。
图 5 为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的扫描电镜图。
图6为 TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的浓度和聚集对荧光的变化。
图7 为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots水溶液在365 nm处的透过率随温度变化关系。
图8为在360 nm激发下TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots的荧光强度受温度的响应。
图9 为 365nm激发下荧光强度受pH变化的关系。
图10为TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots在不同激发下的双荧光发射图。
图 11为 TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots在不同激发下的CIE色度图。
图12 TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots不同浓度下对Hela细胞的活性的影响。
图13为被标记的Hela细胞的共聚焦激光扫描显微镜成像照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明pH敏感性的Pdots的制备方法作进一步说明。
实验试剂：4,4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛（1M二氯甲烷）、4,4'-偶氮(4-氰基戊酸) （ACVA）、碳酸钾、二环己基碳二亚胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、三氧化二铕均为分析纯未经纯化直接使用，氯化铕溶液的制备见于第二章2.2.3节。丙烯酸（AR）冷藏在干燥的环境，上述试剂购买自萨恩化学技术（上海）有限公司；乙酸乙酯、石油醚、甲苯、正己烷、无水乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃均为分析纯，除水干净后加分子筛保存备用，以及浓盐酸、N,N-二甲基亚砜（AR）均由兰州肯特化工有限公司提供。
测试仪器和表征方法：玻璃仪器为实验室常规玻璃器皿；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）数据是在Nicolet AVATAR 360型号红外光谱仪上测试；凝胶分散色谱（GPC）通过GPCV2000凝胶分散色谱(Waters)用聚苯乙烯作为校准标准物、THF作为洗脱液；X-ray光电子能谱（XPS）数据通过型号Thermo-Fishier Scientific EscaLab 250Xi X-ray光电子能谱仪测试；形貌的观察是通过扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope, SEM）ULTRA Plus测试；荧光数据是在室温下通过F97 Pro 荧光仪测试所得。
TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots的制备，包括以下步骤：
1、TPE-tetraPAA的制备
TPE-tetraOH的制备：在冰水浴中，2.0mmol的4,4’-二羟基二苯甲酮，加入250mL的三口烧瓶中，再加入2.0mmol的Zn粉、150.0mL的THF作为溶剂，真空环境下，保持体系无水无氧，搅拌下注入0.3mL（2.73mmol）的四氯化钛，再转入75℃的油浴环境中，反应24h后注入20.0mL、10%的K2CO3猝灭反应，TPE-tetraOH用乙酸乙酯萃取、收集、旋蒸干燥，得到棕黄色的产物TPE-tetraOH，产率为60%。
引发剂TPE-AZO的制备：1.0mmol TPE-tetraOH和4.0mmol的ACVA溶解于50.0mL的THF溶液中，再加入3.0 mmol的DMAP和1.0 mmol的DCC，抽真空保持无水无氧环境75℃加热反应24h后，冷却后过滤，滤液用甲苯沉淀过滤，滤液旋蒸干燥即为TPE-AZO。
TPE-tetraPAA的制备：将3.0g（41.7mmol）丙烯酸单体（约3.0 mL）和0.61g（0.42mmol）TPE-AZO引发剂，溶于100mL的干燥THF，75℃真空反应24h，冷却至室温，加正己烷沉淀过滤，聚合物纯化，真空室温干燥，即为TPE-tetraPAA（Mn≈12000）。
2、TPE-tetraPAA-Eu(III)配合物的制备
将1.0g的聚合物TPE-tetraPAA溶于20.0mL无水乙醇中，再注入1.0 mL事先制备好的EuCl3溶液（浓度0.4 mol/L），搅拌20 h充分发生配位反应后，用正己烷沉淀出聚合物，纯化，真空干燥，得到淡粉色的粉末，即为目标产物TPE-tetraPAA-Eu(III)。
3、TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots的构筑
将上述制备的TPE-tetraPAA-Eu(III)配合物溶于无水乙醇中，超声处理使其彻底分散，形成澄清透明的溶液后，在超声作用中缓慢滴加不良溶剂二氯甲烷，直至溶液颜色由透明变为淡灰白色，停止滴加不良溶剂，继续超声处理20分钟后冷冻干燥，得到尺寸分布在近50 nm的TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots。

Claims (6)

1.一种pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备方法，包括以下步骤：
（1）TPE-tetraPAA聚合物的制备
TPE-tetraOH的制备：THF作为溶剂，在真空无水无氧环境下，以Zn粉为还原剂，4,4’ -二羟基二苯甲酮与四氯化钛以1:1~1:2的摩尔比，于70~75℃的油浴环境中反应22~24h，用K2CO3溶液猝灭反应，用乙酸乙酯萃取、收集、旋蒸干燥，得到棕黄色的产物TPE-tetraOH；
引发剂TPE-AZO的制备：将TPE-tetraOH和偶氮-4,4’-二氰基戊二酸以1:4~1:6的摩尔比溶解在THF中，再加入催化剂4-二甲氨基吡啶和脱水剂二环己基碳二亚胺，在真空无水无氧环境下，于70~75℃反应20~24h后，冷却、过滤，滤液用甲苯沉淀，过滤，滤液旋蒸干燥，即得TPE-AZO；
TPE-tetraPAA的制备：将引发剂TPE-AZO与丙烯酸单体以1:100~1:200的摩尔比溶于THF中，于70~ 75℃真空反应22~24h，冷却至室温，加正己烷沉淀出聚合物，纯化，真空干燥，即得聚合物TPE-tetraPAA；
（2）TPE-tetraPAA-Eu(III)配合物的制备
将聚合物TPE-tetraPAA溶于无水乙醇中，再注入EuCl3溶液，搅拌20~24 h充分发生配位反应后，用正己烷沉淀出聚合物，纯化，真空干燥，得到淡粉色的粉末，即为目标产物TPE-tetraPAA-Eu(III)；
（3）TPE-tetraPAA-Eu(III)Pdots的构筑
将TPE-tetraPAA-Eu(III)配合物超声分散于无水乙醇中，形成澄清透明的溶液；在超声作用中缓慢滴加不良溶剂二氯甲烷，直至溶液颜色由透明变为淡灰白色，停止滴加不良溶剂，继续超声处理20~25 min后冷冻干燥，得到TPE-tetraPAA-Eu(III) Pdots。
2.如权利要求1所述一种pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，Zn粉的加入量为4,4’ -二羟基二苯甲酮摩尔量的1~2倍。
3.如权利要求1所述一种pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，4-二甲氨基吡啶的加入量为TPE-tetraOH的摩尔量的3~4倍。
4.如权利要求1所述一种pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，脱水剂二环己基碳二亚胺的加入量为TPE-tetraOH的摩尔量的1~2倍。
5.如权利要求1所述一种pH敏感型双荧光聚合物量子点的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，TPE-tetraPAA与EuCl3的摩尔比为1:10~1:50 。
6.如权利要求1所述方法制备的pH敏感型双荧光聚合物量子点在双色活细胞成像中的应用。
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