CN112816513B - 金钆复合纳米探针、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
公开一种金钆复合纳米探针、制备方法及应用，能够保证同步辐射实验与常规成像、定量研究结果的一致性，可以实现同步X射线成像，大大节省同步X射线成像筛选样品的时间，可以计算得到复合探针内金属含量与细胞所表达蛋白质分子的比例关系，计算出细胞内蛋白质的表达量，是实现单细胞尺度特定蛋白质胞内分布以及表达量的定量分析的有效解决方案。这种金钆复合纳米探针，包括：纳米金和纳米氧化钆复合在一起形成的纳米复合结构、在纳米复合结构外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子。
Description
技术领域
本发明涉及化学、纳米材料及生物学的技术领域，尤其涉及一种金钆复合纳米探针，这种探针的制备方法，以及该金钆复合纳米探针在制备用于同步辐射X射线断层扫描单细胞蛋白质可视化成像及定量检测的应用。
背景技术
蛋白质在细胞功能和结构构建中起着重要作用，其表达和定位影响细胞迁移、细胞间相互作用，同时还与一些病症如癌症的发展程度密切相关。但是由于在一个生物系统中，蛋白质的表达量往往出现较大的异质性，不同组织中同一蛋白表达量相差很大，即使同一组织中不同环境中的细胞表达蛋白质的量也有一定差别。在单细胞尺度分析蛋白质表达水平及分布，对于阐明每个细胞在这些系统的功能中所起的作用是很重要的。
同步辐射X射线显微镜以能量可调、高单色性、相干性和能量分辨能力的同步辐射X射线为光源，基于物质对X射线的吸收、相位、衍射、折射等物理过程，能够实现对生物细胞的高分辨三维完整及精细结构多尺度成像(几纳米-几微米)。然而，由于蛋白质分子与生物样品本征的差异性较小，仅靠细胞蛋白样品对X射线的响应是无法明显分辨出目标蛋白质的数量和分布。若能够开发能够特异性结合特定蛋白质，且适用于X射线显微镜的生物探针，则可有效解决此问题。因此，将基于同步辐射的X射线显微镜与生物探针技术相结合，开发出多种适用于X射线显微镜的生物探针，实现生物大分子的高分辨率空间定位，是实现单细胞尺度特定蛋白质胞内分布以及表达量的定量分析的有效解决方案。同时，由于同步辐射资源的紧缺，有必要在同步辐射实验前做好预实验，而为了保证多种研究结果的一致性，有必要设计一种多信号的可用于同步X射线成像的蛋白质探针。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明要解决的技术问题是提供了一种金钆复合纳米探针及其制备方法，其能够保证同步辐射实验与常规成像、定量研究结果的一致性，可以实现同步X射线成像，大大节省同步X射线成像筛选样品的时间，可以计算得到复合探针内金属含量与细胞所表达蛋白质分子的比例关系，计算出细胞内蛋白质的表达量，是实现单细胞尺度特定蛋白质胞内分布以及表达量的定量分析的有效解决方案。
本发明的技术方案是：这种金钆复合纳米探针，其包括：纳米金和纳米氧化钆复合在一起形成的纳米复合结构、在纳米复合结构外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子。
金钆复合纳米探针的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将一定浓度的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC水溶液，加入到蛋白质的水溶液中，室温搅拌使之混合均匀，之后再加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS或N-羟基硫代琥珀酰亚胺S-NHS的水溶液，避光继续搅拌2～12小时，得到第一溶液；
(2)将一定浓度的多肽分子的水溶液加入到第一溶液中，室温搅拌半小时，之后透析提纯，冷冻干燥保存，得到多肽分子修饰的蛋白分子；
(3)在一定浓度的肽蛋白水溶液中加入一定量的一定浓度的氯金酸水溶液和钆无机盐化合物的水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀，随后加入一定量的氢氧化钠NaOH水溶液，调节pH至12左右，于37摄氏度环境中继续搅拌5～24小时，透析纯化冷冻干燥后得到金钆复合纳米探针。
本发明包括纳米金和纳米氧化钆复合在一起形成的纳米复合结构、在纳米复合结构外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子，因此能够保证同步辐射实验与常规成像、定量研究结果的一致性；探针中钆元素对特定波长的X射线具有较强的吸收能力，实现了同步X射线成像；基于探针中金纳米颗粒的荧光性质，可以在普通显微镜上对靶向能力进行预成像研究，大大节省同步X射线成像筛选样品的时间；同时结合探针内金属含量的测定，以及所修饰多肽分子与特定蛋白质分子的特异性结合比例，可以计算得到复合探针内金属含量与细胞所表达蛋白质分子的比例关系；通过定量探针金属元素含量，计算出了细胞内蛋白质的表达量；因此是实现单细胞尺度特定蛋白质胞内分布以及表达量的定量分析的有效解决方案。
还提供了所述金钆复合纳米探针用于：同步X射线成像，在普通显微镜上对靶向能力进行预成像研究，结合电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)或者同步辐射X射线谱学方法定量金或钆元素，计算复合探针内金属含量与细胞所表达蛋白质分子的比例关系，计算细胞内蛋白质的表达量。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的金钆复合纳米探针的TEM图像。
图2为本发明实施例2制备的金钆复合纳米探针的TEM图谱。
图3为本发明实施例1得到的金钆复合纳米探针对细胞整合素蛋白进行抗体共定位荧光染色图像。
图4为本发明实施例1得到的金钆复合纳米探针对细胞整合素蛋白进行同步辐射X射线二维成像图样。
图5为根据本发明的金钆复合纳米探针的制备方法的流程图。
具体实施方式
这种金钆复合纳米探针，其包括：纳米金和纳米氧化钆复合在一起形成的纳米复合结构、在纳米复合结构外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子。
优选地，所述生物蛋白质分子和多肽分子的摩尔比例是1：a，a为1～20；所述生物蛋白质分子与金钆复合纳米探针中金、钆元素的摩尔比例是1：b：c，b为10～1000，c为10～1000。
优选地，所述生物蛋白质分子是牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白、铁红蛋白、纤连蛋白、卵清蛋白中的一种或多种；所述多肽分子是是特定蛋白质或特定亚细胞器结构靶向序列组成的序列，所述特定蛋白质包含但不限于整合素蛋白、人表皮生长因子受体-2(以下写为HER2)蛋白、纤连蛋白、核蛋白(如Ki-67蛋白)，所述特定亚细胞器结构包括但不限于细胞膜、内质网、溶酶体、细胞核、线粒体。
如图5所示，金钆复合纳米探针的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将一定浓度的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC水溶液，加入到蛋白质的水溶液中，室温搅拌使之混合均匀，之后再加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS或N-羟基硫代琥珀酰亚胺S-NHS的水溶液，避光继续搅拌2～12小时，得到第一溶液；
(2)将一定浓度的多肽分子的水溶液加入到第一溶液中，室温搅拌半小时，之后透析提纯，冷冻干燥保存，得到多肽分子修饰的蛋白分子(以下简称肽蛋白)；
(3)在一定浓度的肽蛋白水溶液中加入一定量的一定浓度的氯金酸水溶液和钆无机盐化合物的水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀，随后加入一定量的氢氧化钠NaOH水溶液，调节pH至12左右，于37摄氏度环境中继续搅拌5～24小时，透析纯化冷冻干燥后得到金钆复合纳米探针。
本发明包括纳米金和纳米氧化钆复合在一起形成的纳米复合结构、在纳米复合结构外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子，因此能够保证同步辐射实验与常规成像、定量研究结果的一致性；探针中钆元素对特定波长的X射线具有较强的吸收能力，实现了同步X射线成像；基于探针中金纳米颗粒的荧光性质，可以在普通显微镜上对靶向能力进行预成像研究，大大节省同步X射线成像筛选样品的时间；同时结合探针内金属含量的测定，以及所修饰多肽分子与特定蛋白质分子的特异性结合比例，可以计算得到复合探针内金属含量与细胞所表达蛋白质分子的比例关系；通过定量探针金属元素含量，计算出了细胞内蛋白质的表达量；因此是实现单细胞尺度特定蛋白质胞内分布以及表达量的定量分析的有效解决方案。
优选地，所述步骤(1)中，所述蛋白质：EDC二者的投料摩尔比为1∶d，d为3～40，EDC：NHS或S-NHS二者的投料摩尔比为1：e，e为0.9～1。
优选地，所述步骤(2)中，多肽分子与第一溶液中蛋白质分子投料摩尔比例为1：f，f为0.1～0.6，透析条件为选取截留分子量3000～15000的透析袋，透析时间5～20小时。
优选地，所述步骤(3)中，所述钆无机盐包括但不限于氯化盐、硝酸盐、乙酸盐、硫酸盐；所述肽蛋白与金元素的投料摩尔比为1：g，g为10～100；所述金与钆元素的投料摩尔比为1：h，h为0.5～2；加入NaOH的量使得最终溶液pH为9～14。
优选地，所述步骤(3)中，NaOH的加入量使得最终溶液pH为10～12。
还提供了所述金钆复合纳米探针用于：同步X射线成像，在普通显微镜上对靶向能力进行预成像研究，计算复合探针内金属含量与细胞所表达蛋白质分子的比例关系，计算细胞内蛋白质的表达量。
优选地，在用于细胞成像研究时，将细胞预先固定半小时，并使用质量浓度为3％的BSA溶液孵育1小时，防止非特异性吸附，之后将探针与细胞共培一段时间，洗涤后，使用倒置荧光显微镜对荧光成像效果进行观察，评判探针特异性结合蛋白质的效果，为之后同步X射线成像准备；用于X射线成像的细胞，种于氮化硅窗上，之后处理过程类似，除了可以单细胞成像外，X射线成像图片中衬度不同也用于分析细胞内不同部位相关蛋白质分布的半定量对比；用于蛋白质表达量的定量分析，将细胞与探针共培并洗涤后，对收集的细胞样品进行消解，结合电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对金和钆元素进行定量，从而得到细胞蛋白质的实际含量。
下面结合附图对本发明的实施方式做详细说明。
实施例1
制备金钆复合纳米探针
A)将0.1毫摩尔的EDC溶于0.5毫升的水中，随后加入到20毫升含有200毫克BSA的水中，室温搅拌使之混合均匀，后向混合液中加入含有0.09毫摩尔S-NHS的0.5毫升的水溶液，搅拌直至混合均匀后，避光继续搅拌4小时，得到溶液1。
B)设计含有可特异性靶向整合素蛋白的多肽序列，记为肽序列CV，取10毫克合成好的肽序列CV加入到1毫升水中，搅拌均匀后加入到步骤A得到的溶液1中，室温搅拌半小时，之后选取截留分子量8000的透析袋透析10小时，冻干保存，得到肽序列CV修饰的BSA分子(以下记为BSA-CV)。
C)于2毫升以BSA含量测算浓度为50克每升的BSA-CV水溶液中，加入1.6毫升25毫摩尔每升的氯金酸水溶液及0.8毫升50毫摩尔每升的硝酸钆水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀。随后加入0.1毫升2摩尔每升的NaOH水溶液，于37摄氏度环境中继续搅拌12小时，透析纯化冻干后得到探针粉末，即为复合探针。
参见图1。图1为本发明实施例1制备的复合探针的性质表征图像。
由图1可知，本发明实施例1制备的蛋白肽BSA-CV中，BSA分子上修饰的肽序列CV的个数是四，得到的复合探针平均粒径是3.3±0.7纳米，且分散性好、尺寸均一，可见0.139纳米的立方晶格金纳米颗粒的高清相和0.221纳米的六方晶系的氧化钆纳米颗粒的高清相，颗粒中的金元素是0价态，钆元素是+3价态，且颗粒具有较好的荧光性能。
实施例2
A)将0.05毫摩尔的EDC溶于0.5毫升的水中，随后加入到50毫升含有500毫克卵清蛋白的水中，室温搅拌使之混合均匀，后向混合液中加入含有0.05毫摩尔S-NHS的0.5毫升的水溶液，搅拌直至混合均匀后，避光继续搅拌4小时，得到溶液1。
B)设计含有可特异性靶向内质网结构的多肽序列，记为肽序列DS，取6毫克合成好的肽序列DS加入到1.5毫升水中，搅拌均匀后加入到步骤A得到的溶液1中，室温搅拌半小时，之后选取截留分子量8000的透析袋透析5小时，冻干保存，得到肽序列CR修饰的卵清蛋白分子(以下记为卵清蛋白肽)。
C)于5毫升以卵清蛋白含量测算浓度为20克每升的卵清蛋白肽水溶液中，加入1毫升20毫摩尔每升的氯金酸水溶液及2毫升20毫摩尔每升的氯化钆水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀。随后加入0.4毫升1摩尔每升的NaOH水溶液，于37摄氏度环境中剧烈搅拌12小时，透析纯化冻干后得到复合探针粉末。
参见图2。图2为本发明实施例2制备的复合探针的TEM图像。
由图2可知，本发明实施例2制备的复合探针平均粒径是5.6纳米，且分散性好、尺寸均一。
实施例3
复合探针细胞荧光成像
A)成对数生长的人红白血病细胞(以下记为HEL)使用4％多聚甲醛固定细胞30min,后用PBS洗涤2次。随后使用3％BSA溶液与细胞孵育1h，防止非特异性吸附。
C)向步骤A处理过的细胞中加入稀释150倍的整合素抗体的3％BSA溶液，并继续孵育2h，随后避光在稀释200倍的绿色荧光染料修饰的山羊抗小鼠抗体(记为IgG-FITC)的3％BSA溶液中孵育40min。PBS洗涤3次。
D)向步骤B处理过的细胞中加入步骤1得到的红色荧光染料修饰的金钆复合纳米探针并继续孵育1h，加入细胞核染料(记为DAPI)对细胞染色30分钟，用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞。
参见图3。图3为本发明实施例1得到的金钆复合纳米探针对细胞整合素蛋白进行抗体共定位荧光染色图像。
由图3可知，本发明实施例1得到的复合探针，能够实现与荧光染料修饰的整合素蛋白抗体荧光共定位，且二者主要分布于细胞膜上。说明得到的复合探针可以有效的特异性靶向结合细胞表达的整合素蛋白。
实施例4
复合探针定量细胞中整合素蛋白表达量
A)成对数生长的HEL细胞调整密度至1.5×106个每毫升，之后与复合探针共孵育1小时，离心并使用PBS洗两次。
B)将步骤A得到的探针染色细胞稀释至1×106个每毫升，取0.1毫升加入到1毫升的王水中消解12小时。之后使用硝酸与盐酸摩尔比例为2:1的混合酸(其中硝酸浓度为80毫摩尔每升)，稀释至10毫升的终体积。
C)使用电感耦合等离子体质谱(以下写为ICP-MS)对步骤B得到的最终消解液进行总金/钆元素的测定。
经测定，每一个HEL细胞中整合素蛋白的表达量约为1.5×107个。
实施例5
复合探针细胞同步辐射X射线成像
A)HEL细胞种在氮化硅窗上，并使用多聚甲醛的PBS溶液进行固定。
B)将实施例1得到的复合探针与步骤A得到的固定在氮化硅窗上的细胞进行孵育1小时，后用PBS洗两次。
C)步骤B得到的染色细胞样进行梯度脱水，并于4摄氏度保存。
D)对步骤C得到的脱水样品进行同步辐射X射线细胞成像实验。可选取的是基于钆元素的吸收边。
参见图4。图4为本发明实施例1得到的复合探针对细胞整合素蛋白进行同步辐射X射线二维成像图样。
由图4可知，本发明实施例1得到的金钆复合纳米探针可用于单细胞同步辐射X射线整合素蛋白分布成像，其对X射线的吸收程度也与所检测到的金钆复合纳米探针的浓度成正比，可用于半定量对比所靶向结合的整合素蛋白在细胞中的分布，从图4中也可看出整合素蛋白主要不规则分布于细胞膜上。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属本发明技术方案的保护范围。
Claims (2)
1.金钆复合纳米探针，适用于单细胞的同步X射线成像，以及结合电感耦合等离子体质谱技术实现靶向蛋白定量检测，其特征在于：其制备过程为，
A）将0.1毫摩尔的EDC溶于0.5毫升的水中，随后加入到20毫升含有200毫克BSA的水中，室温搅拌使之混合均匀，后向混合液中加入含有0.09毫摩尔S-NHS的0.5毫升的水溶液，搅拌直至混合均匀后，避光继续搅拌4小时，得到溶液1；
B）设计含有可特异性靶向整合素蛋白的多肽序列，记为肽序列CV，取10毫克合成好的肽序列CV加入到1毫升水中，搅拌均匀后加入到步骤A得到的溶液1中，室温搅拌半小时，之后选取截留分子量8000的透析袋透析10小时，冻干保存，得到肽序列CV修饰的BSA分子，BSA-CV；
C）于2毫升以BSA含量测算浓度为50克每升的BSA-CV水溶液中，加入1.6毫升25毫摩尔每升的氯金酸水溶液及0.8毫升50毫摩尔每升的硝酸钆水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀；随后加入0.1毫升2摩尔每升的NaOH水溶液，于37摄氏度环境中继续搅拌12小时，透析纯化冻干后得到探针粉末，即为复合探针；
所述金钆复合纳米探针中：蛋白肽BSA-CV中，BSA分子上修饰的肽序列CV 的个数是四，得到的复合探针平均粒径是3.3 ± 0.7纳米。
2.根据权利要求1所述金钆复合纳米探针，应用于：在用于细胞成像研究时，将细胞预先固定半小时，并使用质量浓度为3%的BSA溶液孵育1小时，防止非特异性吸附，之后将探针与细胞共培一段时间，洗涤后，使用倒置荧光显微镜对荧光成像效果进行观察，评判探针特异性结合蛋白质的效果，为之后同步X射线成像准备；用于X射线成像的细胞，种于氮化硅窗上，X射线成像图片中衬度不同用于分析细胞内不同部位相关蛋白质分布的半定量对比；用于蛋白质表达量的定量分析，将细胞与探针共培并洗涤后，对收集的细胞样品进行消解，结合ICP-MS对金和钆元素进行定量，从而得到细胞蛋白质的实际含量。
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