CN112708415B - 含铁纳米探针、制备方法及同步辐射用途 - Google Patents

含铁纳米探针、制备方法及同步辐射用途 Download PDF

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Abstract

公开一种含铁纳米探针、制备方法、及其细胞同步辐射原位检测用途，其能够适用于同步辐射X射线显微镜，实现生物大分子或亚细胞结构的高分辨率原位空间定位成像，其是一种多信号的可用于同步辐射X射线成像的蛋白质探针，能够在同步辐射实验前做好预实验，保证结果的一致性，充分利用紧缺的同步辐射资源；同时所含金属元素可用于细胞中所标记蛋白质表达量的定量测定。这种适用于同步辐射X射线蛋白质原位检测的含铁纳米探针，其包括铁基纳米颗粒以及在复合在纳米颗粒外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子。

Description

含铁纳米探针、制备方法及同步辐射用途
技术领域
本发明涉及化学、纳米材料及生物学的技术领域，尤其涉及一种适用于同步辐射X射线细胞检测的含铁纳米探针，这种探针的制备方法，以及该含铁纳米探针同步辐射细胞原位检测的用途。
背景技术
蛋白质在细胞功能和结构构建中起着重要作用。由于位置的异质性，蛋白质在细胞结构中的构象和表达受不同细胞环境和功能状态的影响，同时，细胞内蛋白质的表达和定位影响细胞迁移、细胞间相互作用，同时还与一些病症(如癌症)的发展程度密切相关。而在一个生物组织内部的生物系统构成中，也往往包含一系列具有不同蛋白表达水平的细胞。因此，在单个细胞的尺度上分析蛋白质表达水平及分布对于阐明每个细胞在这些系统的功能中所起的作用是很重要的。在临床诊断中，不断发展的更高灵敏度的检测技术可以为此提供更好的诊断。生命科学的研究者们普遍认为，细胞是生命的基本组成单位，关于细胞水平的分析很早之前已经开始进行研究。随着同步光源、检测设备以及光学技术的不断进步，具有超短波长的同步辐射X射线显微镜在细胞成像方面的研究取得了很大的进展。同步辐射装置产生的X射线适用于多种成像机制，包括透射X射线断层摄影术(TXM)，相干X射线衍射成像(CDI)，软X射线断层摄影显微镜(STXM)等。其中软X射线断层摄影术(SXT)是一种能够表征和量化的成像技术。基于这些技术的显微镜和超短波长X射线的成像，可以实现纳米级的分辨率，有望获得高分辨率、完整的细胞/亚细胞结构的二维或三维成像。
然而，由于蛋白质分子与生物样品本征的差异性较小，仅靠细胞样品对同步辐射X射线的响应是无法明显分辨出蛋白质的数量和分布的，因此，有必要将同步辐射X射线显微镜与生物探针技术相结合，开发出多种适用于同步辐射X射线显微镜的生物探针，实现生物大分子的高分辨率空间定位。同时，由于同步辐射资源的紧缺，有必要在同步辐射实验前做好预实验，而为了保证结果的一致性，有必要设计一种多信号的可用于同步X射线成像的蛋白质探针。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明要解决的技术问题是提供了一种同步辐射含铁纳米探针及其制备方法，其能够适用于同步辐射X射线显微镜，实现生物大分子的高分辨率原位空间定位成像，其是一种多信号的可用于同步X射线成像的蛋白质探针，能够在同步辐射实验前做好预实验，保证结果的一致性，充分利用紧缺的同步辐射资源；同时所含金属元素可用于细胞中所标记蛋白质表达量的定量测定。
本发明的技术方案是：这种含铁纳米探针，其包括铁基纳米颗粒以及在复合在纳米颗粒外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子。
含铁纳米探针的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将一定浓度的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC的二甲基亚砜DMSO溶液，加入到蛋白质的生物磷酸盐缓冲液PBS中，室温搅拌使之混合均匀，得到第一溶液；
(2)将一定浓度的多肽分子的PBS溶液加入到第一溶液中，室温搅拌半小时，之后透析提纯，冷冻干燥保存，得到多肽分子修饰的蛋白分子，称为肽蛋白；
(3)在一定浓度的肽蛋白水溶液中加入一定量的一定浓度的二价铁和三价铁化合物的水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀，随后加入一定量的氢氧化钠NaOH水溶液，调节pH至12，于37摄氏度环境中剧烈搅拌12小时，透析纯化冻干后得到纳米颗粒探针。
本发明包括铁基纳米颗粒以及在复合在纳米颗粒外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子，因此能够适用于X射线显微镜，实现生物大分子的高分辨率空间定位成像，其是一种多信号的可用于同步X射线成像的蛋白质探针，能够在同步辐射实验前做好预实验，保证结果的一致性，充分利用紧缺的同步辐射资源；同时所含金属元素可用于细胞中所标记蛋白质表达量的定量测定。
还提供了所述含铁纳米探针用于：在细胞内蛋白质靶向原位荧光成像、同步X射线细胞蛋白质原位靶向成像、或通过探针金属元素含量定量计算出细胞内蛋白质的表达量。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的纳米颗粒探针的TEM图像。
图2为本发明实施例2制备的纳米颗粒探针的TEM图谱。
图3为本发明实施例1得到的纳米颗粒探针对细胞HER2蛋白进行抗体共定位荧光染色图像。
图4为本发明实施例1得到的纳米颗粒探针对细胞HER2蛋白进行同步辐射X射线二维成像图样。
图5为本发明实施例1得到的纳米颗粒探针对细胞HER2蛋白进行同步辐射X射线三维成像图样。
图6为根据本发明的同步辐射含铁纳米颗粒探针的制备方法的流程图。
具体实施方式
这种含铁纳米探针，其包括铁基纳米颗粒以及在复合在纳米颗粒外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子。
优选地，所述生物蛋白质分子和多肽分子的摩尔比例是1：a，a为1～20；所述生物蛋白质分子与铁元素的比例是1：b，b为10～200。
优选地，所述生物蛋白质分子是牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白、铁红蛋白、纤连蛋白、蛋清蛋白中的一种或多种；所述多肽分子是细胞表达的蛋白质或细胞中亚细胞器结构靶向序列组成的序列，所述细胞表达的蛋白质包含但不限于：整合素蛋白、人表皮生长因子受体-2蛋白、纤连蛋白、核蛋白细胞表达的蛋白质，所述细胞的亚细胞器结构包括但不限于：细胞膜、内质网、溶酶体、细胞核、线粒体。
优选地，含铁纳米探针的粒径为1～50纳米。
如图6所示，含铁纳米探针的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将一定浓度的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC的二甲基亚砜DMSO溶液，加入到蛋白质的生物磷酸盐缓冲液PBS中，室温搅拌使之混合均匀，得到第一溶液；
(2)将一定浓度的多肽分子的PBS溶液加入到第一溶液中，室温搅拌半小时，之后透析提纯，冷冻干燥保存，得到多肽分子修饰的蛋白分子，称为肽蛋白；
(3)在一定浓度的肽蛋白水溶液中加入一定量的一定浓度的二价铁和三价铁化合物的水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀，随后加入一定量的氢氧化钠NaOH水溶液，调节pH至12，于37摄氏度环境中剧烈搅拌12小时，透析纯化冻干后得到纳米颗粒探针。
本发明包括铁基纳米颗粒以及在复合在纳米颗粒外层的包覆物质，所述包覆物质包括生物蛋白质分子和多肽分子，因此能够适用于X射线显微镜，实现生物大分子的高分辨率空间定位成像，其是一种多信号的可用于同步X射线成像的蛋白质探针，能够在同步辐射实验前做好预实验，保证结果的一致性，充分利用紧缺的同步辐射资源；同时所含金属元素可用于细胞中所标记蛋白质表达量的定量测定。
优选地，所述步骤(1)中，所述Sulfo-SMCC的DMSO溶液的浓度为2～10克每升，所述蛋白质的PBS溶液的浓度为5-50克每升，蛋白质∶Sulfo-SMCC的投料摩尔比为1∶c，c为3～40。
优选地，所述步骤(2)中，多肽分子的PBS溶液浓度为5～20毫摩尔每升，多肽分子与第一溶液中蛋白质分子投料摩尔比例为1：d，d为0.1～0.6，透析条件为选取截留分子量3000～15000的透析袋，透析时间5～20小时。
优选地，所述步骤(3)中，所述二价铁和三价铁化合物为二价铁和三价铁的无机盐，包括：氯化盐、硝酸盐、乙酸盐、硫酸盐；所述二价铁和三价铁化合物水溶液浓度为10～100毫摩尔每升；所述肽蛋白与总铁元素的投料摩尔比为1：e，e为10～100；二价铁与三价铁元素的投料摩尔比为1：f，f为0.5～4；加入NaOH的量使得最终溶液pH为9～14。
优选地，所述步骤(3)中，二价铁与三价铁元素的投料摩尔比为1：g，g为1～2；NaOH的加入量使得最终溶液pH为10～12。
还提供了所述含铁纳米探针用于：在细胞内蛋白质靶向原位荧光成像、同步X射线细胞蛋白质原位靶向成像、或通过探针金属元素含量定量计算出细胞内蛋白质的表达量。本发明的同步辐射含铁纳米颗粒探针中铁元素对特定波长的X射线具有较强的吸收能力，实现了同步X射线成像；同时结合探针内金属含量的测定，以及所修饰多肽分子与特定蛋白质分子的特异性结合比例，可以计算得到纳米颗粒探针内金属含量与细胞所表达蛋白质分子的比例关系；通过定量探针金属元素含量，能够计算出细胞内蛋白质的表达量。
下面结合附图对本发明的实施方式做详细说明。
实施例1
制备纳米颗粒探针
A)将3毫克Sulfo-SMCC溶于0.5毫升的DMSO中，随后加入到10毫升含有100毫克BSA的PBS中，室温搅拌使之混合均匀，得到第一溶液。
B)设计含有可特异性靶向人表皮生长因子受体-2蛋白(HER2)的多肽序列，记为肽序列PHER2，取10毫克合成好的肽序列PHER2加入到1毫升PBS中，搅拌均匀后加入到步骤A得到的第一溶液中，室温搅拌半小时，之后选取截留分子量8000的透析袋透析10小时，冻干保存，得到肽序列PHER2修饰的BSA分子(以下记为BSA-PHER2)。
C)于2毫升以BSA含量测算浓度为50克每升的BSA-PHER2水溶液中，加入1.6毫升25毫摩尔每升的氯化亚铁水溶液及0.4毫升50毫摩尔每升的氯化铁水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀。随后加入0.1毫升2摩尔每升的NaOH水溶液，于37摄氏度环境中剧烈搅拌12小时，透析纯化冻干后得到探针粉末，记为纳米颗粒探针。
参见图1。图1为本发明实施例1制备的纳米颗粒探针的TEM图像。
由图1可知，本发明实施例1制备的纳米颗粒探针平均粒径是4.2纳米，且分散性好、尺寸均一。
实施例2
A)将2毫克Sulfo-SMCC溶于1毫升的DMSO中，随后加入到20毫升含有80毫克人血清蛋白的PBS中，室温搅拌使之混合均匀，得到溶液1。
B)设计含有可特异性靶向内质网结构的多肽序列，记为肽序列CR，取6毫克合成好的肽序列CR加入到1.5毫升PBS中，搅拌均匀后加入到步骤A得到的溶液1中，室温搅拌半小时，之后选取截留分子量8000的透析袋透析5小时，冻干保存，得到肽序列CR修饰的BSA分子(以下记为BSA-CR)。
C)于5毫升以BSA含量测算浓度为20克每升的BSA-CR水溶液中，加入1毫升20毫摩尔每升的硫酸亚铁水溶液及2毫升20毫摩尔每升的硫酸铁水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀。随后加入0.4毫升1摩尔每升的NaOH水溶液，于37摄氏度环境中剧烈搅拌12小时，透析纯化冻干后得到探针粉末。
参见图2。图2为本发明实施例2制备的纳米颗粒探针的TEM图像。
由图2可知，本发明实施例2制备的纳米颗粒探针平均粒径是7.6纳米，且分散性好、尺寸均一。
下面以人表皮生长因子受体-2蛋白(HER2)作为靶向模型蛋白，实施纳米探针细胞原位检测。
实施例3
纳米颗粒探针细胞荧光成像
A)将实施例1得到的纳米颗粒探针材料与红色荧光染料异硫氰酸罗丹明B混合于水溶液中，其中探针材料中所含蛋白质与异硫氰酸罗丹明B的摩尔量比为1:4，搅拌12小时后透析得到荧光染料修饰的纳米颗粒探针。
B)成对数生长的人乳腺癌细胞(以下记为SKBR3)使用4％多聚甲醛固定细胞30min,后用PBS洗涤2次。随后使用3％BSA溶液与细胞孵育1h，防止非特异性吸附。
C)向步骤A处理过的细胞中加入稀释150倍的HER2抗体的3％BSA溶液，并继续孵育2h，随后避光在稀释200倍的绿色荧光染料修饰的山羊抗小鼠抗体(记为IgG-FITC)的3％BSA溶液中孵育40min。PBS洗涤3次。
D)向步骤B)处理过的细胞中加入步骤A得到的红色荧光染料修饰的纳米颗粒探针并继续孵育1h，加入细胞核染料(记为DAPI)对细胞染色30分钟，用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞。
参见图3。图3为本发明实施例1得到的纳米颗粒探针对细胞HER2蛋白进行抗体共定位荧光染色图像。
由图3可知，本发明实施例1得到的纳米颗粒探针修饰了红色荧光染料后，能够实现与绿色荧光染料修饰的HER2蛋白抗体荧光共定位，且二者主要分布于细胞膜上。说明纳米颗粒探针可以有效的特异性靶向结合细胞表达的HER2蛋白。
实施例4
纳米颗粒探针定量细胞中HER2蛋白表达量
A)成对数生长的SKBR3细胞调整密度至1.5×106个每毫升，之后与纳米颗粒探针共孵育1小时，离心并使用PBS洗两次。
B)将步骤A得到的探针染色细胞稀释至1×106个每毫升，取0.1毫升加入到1毫升的王水中消解12小时。之后使用硝酸与盐酸摩尔比例为2:1的混合酸(其中硝酸浓度为80毫摩尔每升)，稀释至10毫升的终体积。
C)使用激光等离子体解离质谱(以下写为ICP-MS)对步骤B)得到的最终消解液进行总铁元素的测定。
经测定，每一个SKBR3细胞中HER2蛋白的表达量约为1.1×107个。
实施例5
纳米颗粒探针细胞同步辐射X射线成像
A)SKBR3细胞种在氮化硅窗上，并使用多聚甲醛的PBS溶液进行固定。
B)将纳米颗粒探针与步骤A得到的固定在氮化硅窗上的细胞进行孵育1小时，后用PBS洗两次。
C)步骤B得到的染色细胞样进行梯度脱水，并于4摄氏度保存。
D)对步骤C得到的脱水样品进行同步辐射X射线细胞成像实验。可选取的是基于铁元素的吸收边。
参见图4、图5。图4为本发明实施例1得到的纳米颗粒探针对细胞HER2蛋白进行同步辐射X射线二维成像图样。图5为本发明实施例1得到的纳米颗粒探针对细胞HER2蛋白进行同步辐射X射线三维成像图样。
由图4可知，本发明实施例1得到的纳米颗粒探针可用于细胞同步辐射X射线HER2蛋白分布成像，其对X射线的吸收程度也与所检测到的纳米颗粒探针的浓度成正比，可用于半定量对比所靶向结合的HER2蛋白在细胞中的分布，从图4中也可看出HER2蛋白主要不规则分布于细胞膜上。
由图5可知，本发明实例1得到的纳米颗粒探针得到的二维数据，经数据处理可得到HER2蛋白在细胞三维分布的图像数据。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.含铁纳米探针的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
（1）将浓度为2~10克每升的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC的二甲基亚砜DMSO溶液，加入到蛋白质的生物磷酸盐缓冲液PBS中，室温搅拌使之混合均匀，得到第一溶液；
（2）将浓度为5~20毫摩尔每升的多肽分子的PBS溶液加入到第一溶液中，室温搅拌半小时，之后透析提纯，冷冻干燥保存，得到多肽分子修饰的蛋白分子，称为肽蛋白；
（3）在肽蛋白水溶液中加入10~100毫摩尔每升的二价铁和三价铁化合物的水溶液，剧烈搅拌使之混合均匀，随后加入一定量的氢氧化钠NaOH水溶液，调节pH至12，于37摄氏度环境中剧烈搅拌12小时，透析纯化冻干后得到纳米颗粒探针。
2.根据权利要求1所述的含铁纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述蛋白质的PBS溶液的浓度为5-50克每升，蛋白质∶Sulfo-SMCC的投料摩尔比为 1∶c，c为3~40。
3.根据权利要求2所述的含铁纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，多肽分子与第一溶液中蛋白质分子投料摩尔比例为1：d，d为0.1~0.6，透析条件为选取截留分子量3000~15000的透析袋，透析时间5~20小时。
4.根据权利要求3所述的含铁纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述二价铁和三价铁化合物为二价铁和三价铁的无机盐，包括：氯化盐、硝酸盐、乙酸盐、硫酸盐；所述肽蛋白与总铁元素的投料摩尔比为1：e，e为10~100；二价铁与三价铁元素的投料摩尔比为1：f，f为0.5~4；加入NaOH的量使得最终溶液pH为9~14。
5.根据权利要求4所述的含铁纳米探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，二价铁与三价铁元素的投料摩尔比为1：g，g为1~2；NaOH的加入量使得最终溶液pH为10~12。
6.根据权利要求1所述的含铁纳米探针的制备方法得到的含铁纳米探针，其特征在于：其包括铁基纳米颗粒以及在复合在纳米颗粒外层的包覆物质，所述包覆物质是生物蛋白质分子和多肽分子组成的肽蛋白。
7.根据权利要求6所述的含铁纳米探针，其特征在于：所述生物蛋白质分子和多肽分子的摩尔比例是1：a，a为1~20；所述生物蛋白质分子与铁元素的比例是1：b，b为10~200。
8.根据权利要求7所述的含铁纳米探针，其特征在于：所述生物蛋白质分子是牛血清白蛋白、人血清白蛋白、铁红蛋白、纤连蛋白、蛋清蛋白中的一种或多种；所述多肽分子是细胞表达的蛋白质或亚细胞器结构的靶向序列组成的序列，所述细胞表达的蛋白质包含：整合素蛋白、人表皮生长因子受体-2蛋白、纤连蛋白、核蛋白细胞表达的蛋白质，所述亚细胞器结构包括：细胞膜、内质网、溶酶体、细胞核、线粒体。
9.根据权利要求6所述的含铁纳米探针，其特征在于：其粒径为1~50纳米。
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