CN112812191A - 一种提高酶可溶性表达的融合标签及其应用 - Google Patents

一种提高酶可溶性表达的融合标签及其应用 Download PDF

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Abstract

一种提高酶可溶性表达的融合标签及其应用，具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中的任意一种。本发明涉及了一种普适性强的融合标签，通过在原始酶N末端连接融合标签可以有效提高原始酶的可溶性表达。所述的标签序列可应用于萜类合成酶类，大幅提高酶的可溶性表达，具有很好的普适性和应用前景。

Description

一种提高酶可溶性表达的融合标签及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和生物化学领域，具体涉及一种提高酶可溶性表达的融合标签 (Solubility-Enhancing Tags) 及其应用。
背景技术
大肠杆菌作为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统，具有结构简单、生长速度快且易于培养、遗传背景明确、便于基因操作等优点。尽管大肠杆菌有众多的有点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都具有独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和大肠杆菌在密码子偏好性的差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。
获得高表达的异源蛋白一直是科研工作者关注的重点。人们往往通过调控启动子和核糖体位点、降低诱导温度、添加分子伴侣、目的基因密码子偏好性优化等手段提高异源蛋白可溶性表达，但很多时候仍然难以奏效。近些年，使用融合标签表达异源蛋白的技术得到广泛使用，它的应用不仅可以应用于蛋白的分离纯化，而且有的融合标签还能促进蛋白的表达。融合标签大多是一类能够在大肠杆菌中大量表达、可以正确折叠且性质稳定的一类蛋白。目前已经开发出一系列常见的融合标签，有小分子泛素样修饰蛋白（SUMO）、谷胱甘肽转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、转录终止抗终止因子（NusA）等。但这些融合标签不能解决所有蛋白可溶性表达的问题，这些融合标签较大，造成较大的空间位阻，融合蛋白往往会受到融合标签的影响失去原有活性。据此，我们设计了一类新型的小型融合标签以及相应的表达系统。
发明内容
解决的技术问题：本发明为了解决异源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达水平低的问题，提供一种提高酶可溶性表达的融合标签及其应用。利用荧光标记的高通量筛选的方法，通过荧光强弱反映蛋白可溶性表达情况。
技术方案：一种提高酶可溶性表达的融合标签，具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中的任意一种。
上述提高酶可溶性表达的融合标签，具有如SEQ ID NO.2-6所示核苷酸序列中的任意一种。
含有上述融合标签的重组表达载体。
含有上述重组表达载体的重组菌。
一种提高酶可溶性表达的方法，在酶的N末端连接所述的融合标签序列，并导入表达载体，将重组表达载体转化至重组菌进行表达。
上述酶为萜烯合成酶。
上述萜烯合成酶为香叶醇合成酶GES、芳樟醇合成酶LaLIS、芳樟醇合成酶bLIS或檀香烯合成酶TPS。
SEQ ID NO.1任一所述核苷酸序列作为融合标签在提高酶可溶性表达中的应用。
上述载体选用pETDuet-tac。
上述重组菌选用大肠杆菌DH5α。
有益效果：本发明涉及了一种普适性强的融合标签，通过在原始酶N末端连接融合标签可以有效提高原始酶的可溶性表达。所述的标签序列可应用于萜类合成酶类，大幅提高酶的可溶性表达，具有很好的普适性和应用前景。
附图说明
图1是重组表达载体质粒构建过程示意图。
图2为实施例2~3中，融合标签文库构建示意图。
图3为实施例4中，比较不同重组大肠杆菌香叶醇产量。
图4为实施例5中，比较普适性实验中萜烯产量。
具体实施方式
实施例1：构建插入融合标签的表达载体pETDuet-Fn-GES-GPPS及仅有GES的表达载体pETDuet-GES-GPPS
(1)通过三轮聚合酶链式反应 (PCR) 扩增得到Fn-GES片段。其中，设计引物Fn-F和引物Fn-R，通过第一轮PCR扩增得到Fn融合标签片段；设计引物GES-F和引物GES-R，通过第二轮PCR扩增得到GES基因片段；第三轮利用引物Fn-F和引物GES-R，通过重叠延伸PCR的方式将Fn融合标签基因片段与GES基因片段连接成大片段FnGES。
(2)设计引物V1-F和V1-R，将载体pETDuet-tac-GPPS线性化。
引物Fn-F基因序列：
TCACACAGGAAACAGTATCCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACC
引物Fn-R基因序列：
ATTCTTCCATGGCAACTGACTGAAATGCCTCA
引物GES-F基因序列：
GTCAGTTGCCATGGAAGAATCATCTAGTAAACGTCGTGAA
引物GES-R基因序列：
CCGAGCTCGAATTCGGATCCTTACTGGGTAAAAAACAGGGCATCC
引物V1-F基因序列：
GGATCCGAATTCGAGCTCGGC
引物V1-R基因序列：
GGATACTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCG
PCR反应体系：1 μL Fn-GES合成序列，1 μL上游引物F，1 μL下游引物R，25 μLPrimeSTAR Max聚合酶，22 μL ddH2O。
PCR反应条件：98℃变性10 sec，58℃退火20 sec，72℃延伸6 sec (延伸时间随片段长短变化)，30 Cycles；72℃延伸5 min；4℃保温。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化（Axygen，上海）。
(3)通过无缝克隆技术将步骤 (1) 获得的片段Fn-GES与步骤 (2) 获得的线性化载体进行连接，获得重组表达载体。质粒构建示意图如图1所示，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子进行测序验证，构建质粒pETDuet-Fn-GES-GPPS。载体pETDuet-GES-GPPS的构建方式与上述载体pETDuet-Fn-GES-GPPS一致。
实施例2：构建插入荧光蛋白EGFP的重组质粒pETDuet-Fn-GES-L-EGFP-GPPS
为了为后续筛选更有效的融合标签提供一种高通量筛选的方式，选择在目的蛋白C末端融合绿色荧光蛋白EGFP，利用荧光强度反映目的蛋白可溶性表达情况。
(1)通过三轮聚合酶链式反应 (PCR) 扩增得到L-EGFP片段。其中，设计引物L-F和引物L-R，通过第一轮PCR扩增得到如SEQ ID No.7所述LINKER片段；设计引物EGFP-F和引物EGFP-R，通过第二轮PCR扩增得到EGFP基因片段；第三轮利用引物L-F和引物EGFP-R，通过重叠延伸PCR的方式将LINKER片段与EGFP基因片段连接成大片段L-EGFP。
(2)设计引物V2-F和V2-R，将载体pETDuet-Fn-GPPS-GPPS线性化。
引物L-F基因序列：
ATGCCCTGTTTTTTACCCAGGGCGGTTCAGGCGGTGG
引物L-R基因序列：
CTTTTGACATAGAGCCGCCACCGCTAC
引物EGFP-F基因序列：
TGGCGGCTCTATGTCAAAAGGCGAAGAACTGTTTACCG
引物EGFP-R基因序列：
AGCTCGAATTCGGATCCTTATTATTTATACAGTTCATCCATGCCCAGGGTAATACC
引物V2-F基因序列：
TAAGGATCCGAATTCGAGCTCGGCG
引物V2-R基因序列：
CTGGGTAAAAAACAGGGCATCCACATAATTATCC
PCR反应体系：1 μL LINKER/EGFP序列，1 μL上游引物F，1 μL下游引物R，25 μLPrimeSTAR Max聚合酶，22 μL ddH2O。
PCR反应条件：98℃变性10 sec，58℃退火20 sec，72℃延伸6 sec (延伸时间随片段长短变化)，30 Cycles；72℃延伸5 min；4℃保温。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化 (Axygen，上海)。
(3)通过无缝克隆技术将步骤(1)获得的片段L-EGFP与步骤(2)获得的线性化载体进行连接，获得重组表达载体。转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子进行测序验证，构建质粒pETDuet-Fn-GES-L-EGFP-GPPS。
实施例3：构建融合标签Fn突变文库
蛋白N末端氨基酸及其对应核苷酸的类型对于翻译速率具有显著影响。饱和突变融合标签的N末端氨基酸，利用荧光标记进行高通量筛选，可以快速获得更有效的融合标签。
以质粒pETDuet-Fn-GES-L-EGFP-GPPS为模板，设计简并引物DP-F和引物DP-R，通过PCR获得线性化载体，利用无缝克隆技术将线性化载体连接。获得融合标签N末端氨基酸突变过后的文库质粒。
简并引物DP-F基因序列：CTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGC
简并引物DP-R基因序列：CAACGGTGGTATATCCAGTNNNNNNNNNCTCCA
将文库质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子进行测序验证，测序结果表明，融合标签的突变文库构建成功。
实施例4：文库筛选获得一系列更有效的融合标签用于香叶醇产量提升
将文库质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化体系：重组质粒1 μL，感受态细胞50 μL；混合好体系后，冰上放置5 min，然后42℃水浴90 s，再置于冰上5 min，加入500μL SOC培养基，37 ℃摇床孵育1 h，然后涂布于氨苄青霉素抗性的LB平板上，37 ℃培养12-16 h。
在96孔板中接种单菌落于200 μL液体LB培养基中，加入100 µg/mL Amp、34 µg/mLCm抗性，37 ℃培养12-16 h。按5%的接种量转接至200 µL TB (2%甘油)培养基，加入100 µg/mL Amp抗性，37 ℃培养，待OD600达到0.6时，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，然后转移至25℃低温诱导8 h。检测每孔中的荧光强度，筛选出5个荧光强度最强的突变菌株。融合标签F1、F2、F3、F4、F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-6所示。
将筛选到的含有融合标签F1、F2、F3、F4、F5重组质粒分别与质粒pJBEI-6409一同转化到大肠杆菌DH5α中。转化体系：重组质粒1 μL，感受态细胞50 μL；混合好体系后，冰上放置5 min，然后42℃水浴90 s，再置于冰上5 min，加入500 μL SOC培养基，37 ℃摇床孵育1 h，然后涂布于氯霉素/氨苄青霉素双抗性的LB平板上，37 ℃培养12-16 h。
接种单菌落于5 mL液体LB培养基中，加入100 µg/mL Amp、34 µg/mL Cm抗性，37℃培养12-16 h。按1%的接种量转接至50 mL液体TB (2%甘油) 培养基，加入100 µg/mLAmp、34 µg/mL Cm抗性，37 ℃培养，待OD600达到0.8-1.0时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG和5mL肉豆蔻酸异丙脂进行双层培养，然后转移至25 ℃低温诱导48 h。检测五种重组大肠杆菌的香叶醇产量，结果见图3，使用改造过融合标签F1、F2、F3、F4、F5的重组大肠杆菌，相比未使用融合标签的菌株，香叶醇产量提高了120.3%、112.4%、111.8%、99.7%、95.6%。
实施例5：融合标签的普适性实验
为了证明该标签及方法的普遍适应性，实验考察了效果最优的融合标签F1对不同酶表达效果的影响。包括两种不同来源的芳樟醇合成酶laLIS、bLIS以及檀香烯合成酶TPS。按照实施例1的方法进行改造，载体选用pETDuet-tac，重组菌选用大肠杆菌DH5α，并比较对应萜烯化合物的产量。结果见图4，在萜烯合成酶N末端添加融合标签均能够提升目标产物的产量。对比未使用融合标签的重组菌，融合标签F1改造后，酶laLIS芳樟醇产量提高了299.1%，酶bLIS芳樟醇产量提高了115.9%，酶TPS檀香烯产量提高了7711.3%。
上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种提高酶可溶性表达的融合标签及其应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagmhwr dwvvhactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60
cattttgagg catttcagtc agttgcc 87
<210> 2
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagacaa aaaaaactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60
cattttgagg catttcagtc agttgcc 87
<210> 3
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagatag aaagcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60
cattttgagg catttcagtc agttgcc 87
<210> 4
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggagataa gagaaactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60
cattttgagg catttcagtc agttgcc 87
<210> 5
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggagcaaa ttcctactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60
cattttgagg catttcagtc agttgcc 87
<210> 6
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggagcata taaacactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60
cattttgagg catttcagtc agttgcc 87
<210> 7
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcggttcag gcggtggctc agaaggtggc ggctcagaag gcggtggtag cgaaggtggc 60
ggctcagaag gcggcggtag cgaaggtggc ggtagcggtg gcggctct 108
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcacacagga aacagtatcc atggagaaaa aaatcactgg atatacc 47
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
attcttccat ggcaactgac tgaaatgcct ca 32
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcagttgcc atggaagaat catctagtaa acgtcgtgaa 40
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgagctcga attcggatcc ttactgggta aaaaacaggg catcc 45
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggatccgaat tcgagctcgg c 21
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggatactgtt tcctgtgtga aattgttatc cg 32
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgccctgtt ttttacccag ggcggttcag gcggtgg 37
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttttgacat agagccgcca ccgctac 27
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggcggctct atgtcaaaag gcgaagaact gtttaccg 38
<210> 17
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agctcgaatt cggatcctta ttatttatac agttcatcca tgcccagggt aatacc 56
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
taaggatccg aattcgagct cggcg 25
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgggtaaaa aacagggcat ccacataatt atcc 34
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctggatatac caccgttgat atatcccaat ggc 33
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caacggtggt atatccagtn nnnnnnnnct cca 33

Claims (10)

1.一种提高酶可溶性表达的融合标签，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中的任意一种。
2.根据权利要求1所述提高酶可溶性表达的融合标签，其特征在于，具有如SEQ IDNO.2-6所示核苷酸序列中的任意一种。
3.含有权利要求1或2所述融合标签的重组表达载体。
4.含有权利要求3所述重组表达载体的重组菌。
5.一种提高酶可溶性表达的方法，其特征在于，在酶的N末端连接权利要求1所述的融合标签序列，并导入表达载体，将重组表达载体转化至重组菌进行表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶为萜烯合成酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述萜烯合成酶为香叶醇合成酶GES、芳樟醇合成酶LaLIS、芳樟醇合成酶bLIS或檀香烯合成酶TPS。
8.SEQ ID NO.1任一所述核苷酸序列作为融合标签在提高酶可溶性表达中的应用。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述载体选用pETDuet-tac。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述重组菌选用大肠杆菌DH5α。
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XUN WANG: "Efficient Biosynthesis of R‑(−)-Linalool through Adjusting the Expression Strategy and Increasing GPP Supply in Escherichia coli", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *

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