CN112812187A

CN112812187A - 一种磷酸化eif5b特异性抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112812187A
Application number: CN202110060553.6A
Authority: CN
Inventors: 刘志礼; 吴昕; 刘家明
Original assignee: First Affiliated Hospital of Nanchang University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Nanchang University
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112812187B

Abstract

本发明公开了一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用，所述抗体为人源磷酸化ElF5BT78特异性位点多克隆抗体，所述抗体一方面为检测磷酸化EIF5BT78位点的表达，验证相关分子机制提供了可能，另一方面该抗体与磷酸化真核翻译起始因子5B(p‑EIF5B)蛋白结合，还提供包含这种抗体的组合物，本发明利用现有的磷酸化蛋白抗体技术，构建特异性磷酸化EIF5BT78位点多克隆抗体，解决了现有技术中EIF5B磷酸化抗体种类少，特异性差等特点，为检测磷酸化EIF5BT78位点的表达、验证相关分子机制提供了可能。

Description

一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用。

背景技术

真核翻译起始因子5B(eukaryotic translation initiation factors,eIF5B)又名翻译起始因子IF-2，位于2号染色体上，其在翻译启动中发挥着重要作用。在P位点与启动子-tRNA和密码子配对，启动蛋白质翻译。同时，EIF5B也是特异性mRNA翻译所必需的，有助于支持或稳定Met-tRNA结合。早期的研究发现，EIF5B在CSFV(猪瘟病毒)和HCV(丙型肝炎病毒)依赖于IRES的翻译启动机制中，将Met-tRNA递送至核糖体的P位点以启动病毒的翻译。

EIF5B在多种肿瘤中高表达，且在癌症的病理生理学中，尤其是在癌症的增殖转移中起到决定性作用(Ross,J.A.,Dungen,K.V.,Bressler,K.R.et al.Eukaryoticinitiation factor 5B(eIF5B)provides a critical cell survival switch toglioblastoma cells via regulation of apoptosis.Cell Death Dis 10,57(2019).)。值得关注的是，在最近的研究中，EIF5B被证实在胶质母细胞瘤(GBM)细胞帽依赖性低氧反应蛋白翻译过程中作为关键分子发挥重要的作用(Ho,J.J.D.et al.Oxygen-sensitiveremodeling of central carbon metabolism by archaic eIF5B.Cell Rep.22,17–26(2018).)。也有研究表明，EIF5B在肝癌细胞中高表达，能够促进ASAP1对肝癌细胞的增殖和侵袭能力(Wang Zhen-Guang,Zheng Hao,Gao Wei et al.eIF5B increases ASAP1expression to promote HCC proliferation and invasion.Oncotarget,(2016))。目前在EIF5B和肿瘤相关性的研究中存在如下技术问题：现有EIF5B抗体种类较少、特异性差。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于目前EIF5B抗体尤其是EIF5B磷酸化抗体种类少、特异性差的问题从而提出一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明第一方面提供一种磷酸化EIF5B特异性抗体，所述抗体为人源磷酸化ElF5BT78特异性位点多克隆抗体。

本发明第二方面提供一种制备所述的磷酸化EIF5B特异性抗体的方法，其包括如下步骤：

制备抗原，合成多肽1，所述多肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并取部分所述多肽1偶联血蓝蛋白制得抗原；

制备抗体，将偶联有血蓝蛋白的多肽1作为抗原进行免疫处理，得到抗体；

抗体纯化。

作为优选，还包括制备用于抗体纯化的多肽2的步骤，所述多肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

作为优选，所述免疫处理包括至少4次，免疫处理后还包括抗血清效价检测的步骤，分别检测第三次、第四次免疫后的抗血清效价，若抗血清效价大于1：32000，则效价达到要求，若抗血清效价小于1：32000，则增加1-2次免疫。

作为优选，所述抗体纯化包括：

判断抗血清效价是否大于1:32000，若是，则收集含抗体血清，分别采用多肽1和多肽2制作纯化柱进行纯化，得到修饰性抗体。

作为优选，纯化后的抗体效价大于1:64000。

作为优选，所述抗血清效价通过间接ELISA方法检测；所述抗体纯化通过抗原特异亲和纯化进行。

本发明第三方面提供一种所述的抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

作为优选，所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌肿瘤中的至少一种。

作为优选，所述抗肿瘤药物包括所述抗体及赋形剂。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明所述的磷酸化EIF5B特异性抗体，所述抗体为人源磷酸化ElF5B T78特异性位点多克隆抗体，所述抗体一方面为检测磷酸化EIF5B T78位点的表达，验证相关分子机制提供了可能，另一方面该抗体与磷酸化真核翻译起始因子5B(p-EIF5B)蛋白结合，还提供包含这种抗体的组合物，本发明利用现有的磷酸化蛋白抗体技术，构建特异性磷酸化EIF5BT78位点多克隆抗体，解决了现有技术中EIF5B磷酸化抗体种类少，特异性差等特点，为检测磷酸化EIF5B T78位点的表达、验证相关分子机制提供了可能。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例所述的多肽1的质谱图；

图2是本发明实施例所述的偶联有KLH的多肽1的质谱图；

图3是本发明实验例所述的蛋白质免疫印迹验证中的凝胶成像结果；

图4是本发明实验例中，肺癌肿瘤切片的倒置显微镜图片；

图5(a)为肝癌肿瘤切片的倒置显微镜图片；

图5(b)为肝癌旁组织的倒置显微镜图片；

图6(a)为前列腺癌肿瘤切片的倒置显微镜图片；

图6(b)为前列腺癌旁组织的倒置显微镜图片；

图7(a)为胃癌肿瘤切片的倒置显微镜图片；

图7(b)为正常胃组织的倒置显微镜图片。

具体实施方式

实施例

本实施例提供一种磷酸化EIF5B特异性抗体，所述抗体具体为人源磷酸化ElF5BT78特异性位点多克隆抗体。

磷酸化ElF5B T78特异性位点多克隆抗体通过如下方法制备：

S1、制备抗原，首先根据EIF5B的蛋白序列(如SEQ ID NO:3所示)合成20mg多肽1，所述多肽1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：KADRET(p)VAVKPTENN-Cys，SEQ ID NO:1中，该位点的苏氯酸(T)被磷酸化。取10mg多肽1偶联血蓝蛋白(KLH)，制得抗原。多肽1及偶联有KLH的多肽的质谱结果如图1-2所示。

S2、制备抗体，将偶联有血蓝蛋白的多肽1作为抗原进行免疫处理，得到抗体。采用偶联有KLH的多肽1作为抗原免疫2只新西兰大白兔，免疫试剂及抗原计量如表1所示：

表1

免疫时间	剂量(/只)
		一免(Day1)	0.5mg
二免(Day14)	0.5mg
		三免(Day28)	0.5mg
四免(Day42)	0.5mg

抗体制备具体包括如下步骤：

1、兔子的准备：挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只(约2Kg)，使其适应新的生活环境，稳定几天进行首次取血。

预采血(作阴性参照用)：

将兔子小心置于固定的架中，剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见，用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)，将收集的血液置于37℃灭活30min，最后置于4℃过夜使其凝结释放血清，将凝结好的血液在10000r/min离心10min，收集上清，即为血清。

2、兔子的免疫

2.1注射两只兔子的抗原为1ml，抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂，每只兔子初次免疫400μg抗原比较适合，也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100μg即可。

2.2将1ml的佛氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)与准备好的1ml抗原充分混匀，呈乳白色。

2.3小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可)，每个部位250μl，针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

2.4免疫周期为20天，免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血)，总共免疫4-5次。

S3、抗血清效价检测，分别用间接ELISA方法检测第三次及第四次免疫后的抗血清效价，若抗血清效价大于1：32000，则效价达到要求，若抗血清效价小于1：32000，则增加1-2次免疫。

S4、抗体纯化，判断抗血清效价是否大于1:32000，若是，则收集含抗体血清，采用抗原特异亲和方式纯化，分别采用多肽1和多肽2制作纯化柱进行纯化，得到修饰性抗体以及去除非修饰性抗体，纯化后进一步检测抗体效价，纯化抗体效价大于1:64000。

所述抗体效价通过如下方式检测：

1、选取两个参照：阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液)；阳性参照为以前阳性血清。

2、于96孔板中每孔滴加100ul，1μg/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。

3、倒掉抗原溶液，每孔加入200μl的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。

4、倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体，用洗涤液洗板三次，每次尽量拍干残留液体，若要放置一段时间，37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。

5、取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100μl，第二孔加入阳性参照液100μl，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1小时。

6、倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100μl的HRP标记的小鼠抗兔IgG(1：2000稀释)，于37℃孵育45分钟。

7、倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100μl的TMB底物(Sigma单组份TMB)37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。

8、每孔加入50μl的终止液(2N H₂SO₄)，在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。

抗体的抗原特异亲和纯化通过如下步骤进行：

1、亲和柱的制备，取1mg CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol/L的盐酸中，4℃过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。

2、将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol/L的盐酸洗介质3次。

3、用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液pH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。

4、将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中。

5、室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4℃过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。

6、加入15m l 1％BSA(牛血清白蛋白)溶液室温下孵育2小时或4℃过夜。

7、用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上。

8、抗原固相化完成，可用于纯化，若不立即使用或者使用后，用20％的乙醇封存。

抗血清的纯化和保存：

1、抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r/min离心15分钟，取上清。

2、用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。

3、将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。

4、室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4℃过夜。

5、用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白。

6、用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体。

7、用10倍体积PBS平衡柱子。

8、用20％的酒精封存柱子，4℃下保存。

在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50％甘油置于-20℃可长期保存。

本实施例中优选地，步骤S3之前还包括合成用于效价检测和抗体纯化的多肽2的步骤，所述多肽2的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示：KADRETVAVKPTENN-Cys，本实施例中，合成10mg的多肽2，多肽1、多肽2的纯度均大于90％。

所述多肽通过如下工艺制备：

1、树脂溶涨，将2-Chlorotrityl Chloride Resin(2-氯三苯甲基氯树脂)树脂放入反应管中，加DMF(二甲基甲酰胺)(15ml/g)，振荡30min。

2、接第一个氨基酸，通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Gly-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，最后加入DMF溶解，振荡30min。

3、脱保护，去除DMF，加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡5min，去掉再加入20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，振荡15min。

4、检测，抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN(氰化钾)、苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

5、洗涤，依次用DMF(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，DMF(10ml/g)洗涤两次。

6、缩合，方法a：保护氨基酸(FOMC-Asp-OH)三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM(N-甲基吗啡啉)十倍过量，反应30min。

方法b：保护氨基酸三倍过量，HOBt(1-羟基苯并三唑)三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)三倍过量，反应30min。

7、洗涤，依次用DMF(10ml/g)洗涤一次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，DMF(10ml/g)洗涤两次。

8、重复步骤2-7，从右到左连接序列中的氨基酸。

9、最后一个氨基酸连接后，脱保护，并按照如下顺序洗涤树脂：

DMF(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，DMF(10ml/g)洗涤两次，DCM(10ml/g)洗涤两次，抽干10min。

10、从树脂上切割多肽，首先配制切割液(10ml/g)：TFA 94.5％；水2.5％；EDT(1,2-乙二硫醇)2.5％；TIS(三异丙基硅烷)1％，切割时间：120min。

11、吹干洗涤，将裂解液用氮气吹干，用乙醚洗涤6次，然后常温挥干。

12、用HPLC(高效液相色谱)纯化多肽，将粗肽用纯水或者加少量乙腈溶解，按照下列条件纯化：

Pump A:0.1％trifluoroacetic(三氟乙酸)置于100％水中，

Pump B:0.1％trifluoroacetic(三氟乙酸)置于100％乙腈中，

Total Flow(总流速):1.0ml/min，

Volume(体积):30μl，

wave-length(波长):220nm，

Gradient(斜率):

Time(时间)(min)	A	B
			05.00	90％	10％
30.00	20％	80％

30.10min，停止。

Column:Venusi MRC-ODS C1830x250mm。

13、将纯化后的溶液冻干，得到成品。

14、鉴定，分别取少量成品多肽，做MS的分子量鉴定和HPLC分析的纯度鉴定。

15、将白色粉末状多肽密封包装，在-20℃保存。

本实施例还提供一种所述抗体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌肿瘤中的至少一种，另外，所述抗肿瘤药物包括上述抗体作为活性成分以及赋形剂，在制备药物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，药物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

实验例

1、抗体内源验证

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)验证：

采用的主要仪器如下表2所示：

表2

采用的主要试剂如下表3所示：

表3

检测过程具体包括如下步骤：

样品制备：使用A549及143B细胞制备磷酸化EIF5B激活细胞样本，收集细胞，使用RIPA裂解液((RIPA Lysis Buffer))在4℃条件下裂解细胞，将细胞裂解液于4℃下以12000rpm的速度离心20min，将上清转移到一个新的EP管中。BCA法测定蛋白的浓度，根据裂解液的体积加入5×SDS loading bufer，100℃煮沸5min。为防止蛋白降解，操作尽量在冰上进行。

SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)：按需要夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板(1.0mm或1.5mm)，将现配制好的SDS聚丙烯酰胺分离胶(8％、10％或12％)迅速加入玻璃板缝隙中至玻璃板的2/3处，用异丙醇封胶。待分离胶凝固后，倒出异丙醇，用滤纸吸出残留液体。将现配置好的5％的积层胶加到分离胶上，立即插入梳子。带胶完全凝固后拔出梳子用水冲洗加样孔。将电泳装置固定，加Tris-甘氨酸电泳缓冲液，按顺序加入样品20μl和预染Marker。将电泳装置与电源连接，将电压调到80V，待溴酚蓝跑到分离胶时，将电压调为120V，直到溴酚蓝跑到分离胶底部，关闭电源。分离胶各成分所需体积如表4所示：

表4

浓缩胶各成分所需体积如表5所示：

表5

检测步骤如下：

(1)转膜：将凝胶取下，除去积层胶和多余部分，在转膜缓冲液中浸泡；剪取和胶大小相等的4张滤纸和1张PVDF(聚偏氟乙烯)膜，用铅笔在膜的一角做一标记。将PVDF膜依次在100％甲醇中泡约1min，在ddH₂O中浸泡2min，之后在转膜缓冲液中浸泡。将转移装置的阴极板放平，放一层用转膜缓冲液浸泡过的海绵，在海绵上整齐地放两层转膜缓冲液浸泡过的滤纸，用玻璃棒赶出气泡。将凝胶平放于滤纸上，精确对齐滤纸，赶尽气泡。将处理好的PVDF膜放在凝胶上，做标记的一面朝下。将剩下的两张浸泡过的滤纸整齐地放在PVDF膜上，同样保证没有气泡。最后放一层转膜缓冲液浸泡过的海绵，将阳极板覆盖在海绵上，夹紧夹子。将装置置于电转槽中，加满预冷的转膜缓冲液，接通电源，200mA电转1.5h。

(2)封闭：将电转好的PVDF膜取出用TBST洗一遍，用5％milk/TBST室温摇床封闭1h。

(3)洗涤：用TBST漂洗2min。

(4)一抗和靶蛋白结合：用1％BSA/PBST按推荐稀释比稀释一抗，用杂交袋将膜封闭起来，4℃冰箱过夜。

(5)洗涤：用PBST洗涤3次，每次10min。

(6)二抗和一抗温育：将PVDF膜放入用5％milk/PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000)中，室温摇床孵育1h。

(7)洗涤：用PBST洗涤3次，每次10min。

(8)显色：取等量的Enhanced Luminol Reagent(增强鲁米诺试剂)和OxidizingReagent(氧化试剂)，用适量ddH₂O稀释，混匀后滴加在封口膜上。将PVDF膜的正面朝下接触发光试剂，显色1.5～2.0min，将PVDF翻转过来，用凝胶成像系统观察结果，测试结果如图3所示。

测试结果表明，在内参很强表达几乎一致的情况下，R1抗体(1号兔子纯化的抗体)检测8个样本(1号和5号为理论上的阴性对照，其余为推测阳性样本)，2、6和8号能爆出条带，说明可能存在T78磷酸化。R2(2号兔子纯化的抗体)检测8个样本的条带与预期大小138KD不符，8个样本在180KD左右有条带，其中5-8四个样本在75KD左右。结合两个抗体的效价检测结果，R1比R2针对磷酸化多肽更有区分度且效价更高。

上述测试采用的凝胶信息如表6所示：

表6

采用的一抗抗体稀释比例信息如表7所示：

表7

采用的二抗抗体稀释比例如表8所示：

表8

抗原蛋白EIF5B一共1220AAs，大小138.82KDa；pI 5.39；无信号肽，无跨膜螺旋，疏水性一般。蛋白会被酶切成两部分，其中一部分的大小为55KD左右，由于蛋白存在多个位点的磷酸化(磷酸化后蛋白分子量会变大)，因此R2抗体爆出来的条带在180KD和75KD左右是合理的，针对R1爆出来的条带，说明2号，6号和8号样本是发生了T78磷酸化。

2、IHC(免疫组化)验证

IHC验证采用的主要仪器信息如下表9所示：

表9

IHC验证采用的主要试剂信息如下表3所示：

表10

验证过程包括如下步骤：

(1)收集临床组织样本(包括肺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌及其癌旁)固定在4％多聚甲醛20min后用石蜡包埋

(2)切片机将组织样本切至3um厚

(3)脱蜡二甲苯，室温，两次，每次20分钟。

(4)水合100％→100％→95％→90％→80％→70％乙醇→蒸馏水，每级5分钟。

(5)3％过氧化氢，室温孵育10分钟。蒸馏水冲洗。PBS浸洗5分钟。

(6)抗原修复。

(7)PBS洗涤3分钟，3次。

(8)封闭用血清，室温孵育10-30分钟，倾去血清，勿洗。

(9)滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育60-90分钟，或者4℃过夜。

(10)PBS洗涤3分钟，3次。

(11)辣根过氧化物酶标记抗兔IgG多聚体，室温30分钟。

(12)PBS洗涤3分钟，3次。

(13)显色剂(DAB)显色反应，5-10分钟。光镜下控制显色程度。蒸馏水洗终止显色反应。

(14)细胞核复染苏木素3-5分钟。流水冲洗蓝化。

(15)脱水70％→80％→90％→95％→100％→100％，每级5分钟。

(16)透明二甲苯2次，每次5分钟。

(17)中性树胶封固。

(18)倒置显微镜拍摄图片并分析，测试结果如图2-所示。

其中，图4为肺癌肿瘤切片的倒置显微镜图片，图5(a)为肝癌肿瘤切片的倒置显微镜图片，图5(b)为肝癌旁组织的倒置显微镜图片，图6(a)为前列腺癌肿瘤切片的倒置显微镜图片，图6(b)为前列腺癌旁组织的倒置显微镜图片，图7(a)为胃癌肿瘤切片的倒置显微镜图片，图7(b)为正常胃组织的倒置显微镜图片。

从上述图片可见，在肝癌肿瘤组织与前列腺癌肿瘤组织中，可观察到阳性结果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 南昌大学第一附属医院

<120> 一种磷酸化EIF5B特异性抗体及其制备方法与应用

<130> 20201229

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Lys Ala Asp Arg Glu Thr Pro Val Ala Val Lys Pro Thr Glu Asn Asn

1 5 10 15

Cys Tyr Ser

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Lys Ala Asp Arg Glu Thr Val Ala Val Lys Pro Thr Glu Asn Asn Cys

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 3

<211> 1220

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 3

Met Gly Lys Lys Gln Lys Asn Lys Ser Glu Asp Ser Thr Lys Asp Asp

1 5 10 15

Ile Asp Leu Asp Ala Leu Ala Ala Glu Ile Glu Gly Ala Gly Ala Ala

20 25 30

Lys Glu Gln Glu Pro Gln Lys Ser Lys Gly Lys Lys Lys Lys Glu Lys

35 40 45

Lys Lys Gln Asp Phe Asp Glu Asp Asp Ile Leu Lys Glu Leu Glu Glu

50 55 60

Leu Ser Leu Glu Ala Gln Gly Ile Lys Ala Asp Arg Glu Thr Val Ala

65 70 75 80

Val Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Glu Glu Phe Thr Ser Lys Asp Lys

85 90 95

Lys Lys Lys Gly Gln Lys Gly Lys Lys Gln Ser Phe Asp Asp Asn Asp

100 105 110

Ser Glu Glu Leu Glu Asp Lys Asp Ser Lys Ser Lys Lys Thr Ala Lys

115 120 125

Pro Lys Val Glu Met Tyr Ser Gly Ser Asp Asp Asp Asp Asp Phe Asn

130 135 140

Lys Leu Pro Lys Lys Ala Lys Gly Lys Ala Gln Lys Ser Asn Lys Lys

145 150 155 160

Trp Asp Gly Ser Glu Glu Asp Glu Asp Asn Ser Lys Lys Ile Lys Glu

165 170 175

Arg Ser Arg Ile Asn Ser Ser Gly Glu Ser Gly Asp Glu Ser Asp Glu

180 185 190

Phe Leu Gln Ser Arg Lys Gly Gln Lys Lys Asn Gln Lys Asn Lys Pro

195 200 205

Gly Pro Asn Ile Glu Ser Gly Asn Glu Asp Asp Asp Ala Ser Phe Lys

210 215 220

Ile Lys Thr Val Ala Gln Lys Lys Ala Glu Lys Lys Glu Arg Glu Arg

225 230 235 240

Lys Lys Arg Asp Glu Glu Lys Ala Lys Leu Arg Lys Leu Lys Glu Lys

245 250 255

Glu Glu Leu Glu Thr Gly Lys Lys Asp Gln Ser Lys Gln Lys Glu Ser

260 265 270

Gln Arg Lys Phe Glu Glu Glu Thr Val Lys Ser Lys Val Thr Val Asp

275 280 285

Thr Gly Val Ile Pro Ala Ser Glu Glu Lys Ala Glu Thr Pro Thr Ala

290 295 300

Ala Glu Asp Asp Asn Glu Gly Asp Lys Lys Lys Lys Asp Lys Lys Lys

305 310 315 320

Lys Lys Gly Glu Lys Glu Glu Lys Glu Lys Glu Lys Lys Lys Gly Pro

325 330 335

Ser Lys Ala Thr Val Lys Ala Met Gln Glu Ala Leu Ala Lys Leu Lys

340 345 350

Glu Glu Glu Glu Arg Gln Lys Arg Glu Glu Glu Glu Arg Ile Lys Arg

355 360 365

Leu Glu Glu Leu Glu Ala Lys Arg Lys Glu Glu Glu Arg Leu Glu Gln

370 375 380

Glu Lys Arg Glu Arg Lys Lys Gln Lys Glu Lys Glu Arg Lys Glu Arg

385 390 395 400

Leu Lys Lys Glu Gly Lys Leu Leu Thr Lys Ser Gln Arg Glu Ala Arg

405 410 415

Ala Arg Ala Glu Ala Thr Leu Lys Leu Leu Gln Ala Gln Gly Val Glu

420 425 430

Val Pro Ser Lys Asp Ser Leu Pro Lys Lys Arg Pro Ile Tyr Glu Asp

435 440 445

Lys Lys Arg Lys Lys Ile Pro Gln Gln Leu Glu Ser Lys Glu Val Ser

450 455 460

Glu Ser Met Glu Leu Cys Ala Ala Val Glu Val Met Glu Gln Gly Val

465 470 475 480

Pro Glu Lys Glu Glu Thr Pro Pro Pro Val Glu Pro Glu Glu Glu Glu

485 490 495

Asp Thr Glu Asp Ala Gly Leu Asp Asp Trp Glu Ala Met Ala Ser Asp

500 505 510

Glu Glu Thr Glu Lys Val Glu Gly Asn Lys Val His Ile Glu Val Lys

515 520 525

Glu Asn Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp

530 535 540

Glu Glu Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Ser Glu Gly Ser

545 550 555 560

Glu Gly Asp Glu Glu Asp Glu Lys Val Ser Asp Glu Lys Asp Ser Gly

565 570 575

Lys Thr Leu Asp Lys Lys Pro Ser Lys Glu Met Ser Ser Asp Ser Glu

580 585 590

Tyr Asp Ser Asp Asp Asp Arg Thr Lys Glu Glu Arg Ala Tyr Asp Lys

595 600 605

Ala Lys Arg Arg Ile Glu Lys Arg Arg Leu Glu His Ser Lys Asn Val

610 615 620

Asn Thr Glu Lys Leu Arg Ala Pro Ile Ile Cys Val Leu Gly His Val

625 630 635 640

Asp Thr Gly Lys Thr Lys Ile Leu Asp Lys Leu Arg His Thr His Val

645 650 655

Gln Asp Gly Glu Ala Gly Gly Ile Thr Gln Gln Ile Gly Ala Thr Asn

660 665 670

Val Pro Leu Glu Ala Ile Asn Glu Gln Thr Lys Met Ile Lys Asn Phe

675 680 685

Asp Arg Glu Asn Val Arg Ile Pro Gly Met Leu Ile Ile Asp Thr Pro

690 695 700

Gly His Glu Ser Phe Ser Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ser Ser Leu Cys

705 710 715 720

Asp Ile Ala Ile Leu Val Val Asp Ile Met His Gly Leu Glu Pro Gln

725 730 735

Thr Ile Glu Ser Ile Asn Leu Leu Lys Ser Lys Lys Cys Pro Phe Ile

740 745 750

Val Ala Leu Asn Lys Ile Asp Arg Leu Tyr Asp Trp Lys Lys Ser Pro

755 760 765

Asp Ser Asp Val Ala Ala Thr Leu Lys Lys Gln Lys Lys Asn Thr Lys

770 775 780

Asp Glu Phe Glu Glu Arg Ala Lys Ala Ile Ile Val Glu Phe Ala Gln

785 790 795 800

Gln Gly Leu Asn Ala Ala Leu Phe Tyr Glu Asn Lys Asp Pro Arg Thr

805 810 815

Phe Val Ser Leu Val Pro Thr Ser Ala His Thr Gly Asp Gly Met Gly

820 825 830

Ser Leu Ile Tyr Leu Leu Val Glu Leu Thr Gln Thr Met Leu Ser Lys

835 840 845

Arg Leu Ala His Cys Glu Glu Leu Arg Ala Gln Val Met Glu Val Lys

850 855 860

Ala Leu Pro Gly Met Gly Thr Thr Ile Asp Val Ile Leu Ile Asn Gly

865 870 875 880

Arg Leu Lys Glu Gly Asp Thr Ile Ile Val Pro Gly Val Glu Gly Pro

885 890 895

Ile Val Thr Gln Ile Arg Gly Leu Leu Leu Pro Pro Pro Met Lys Glu

900 905 910

Leu Arg Val Lys Asn Gln Tyr Glu Lys His Lys Glu Val Glu Ala Ala

915 920 925

Gln Gly Val Lys Ile Leu Gly Lys Asp Leu Glu Lys Thr Leu Ala Gly

930 935 940

Leu Pro Leu Leu Val Ala Tyr Lys Glu Asp Glu Ile Pro Val Leu Lys

945 950 955 960

Asp Glu Leu Ile His Glu Leu Lys Gln Thr Leu Asn Ala Ile Lys Leu

965 970 975

Glu Glu Lys Gly Val Tyr Val Gln Ala Ser Thr Leu Gly Ser Leu Glu

980 985 990

Ala Leu Leu Glu Phe Leu Lys Thr Ser Glu Val Pro Tyr Ala Gly Ile

995 1000 1005

Asn Ile Gly Pro Val His Lys Lys Asp Val Met Lys Ala Ser Val

1010 1015 1020

Met Leu Glu His Asp Pro Gln Tyr Ala Val Ile Leu Ala Phe Asp

1025 1030 1035

Val Arg Ile Glu Arg Asp Ala Gln Glu Met Ala Asp Ser Leu Gly

1040 1045 1050

Val Arg Ile Phe Ser Ala Glu Ile Ile Tyr His Leu Phe Asp Ala

1055 1060 1065

Phe Thr Lys Tyr Arg Gln Asp Tyr Lys Lys Gln Lys Gln Glu Glu

1070 1075 1080

Phe Lys His Ile Ala Val Phe Pro Cys Lys Ile Lys Ile Leu Pro

1085 1090 1095

Gln Tyr Ile Phe Asn Ser Arg Asp Pro Ile Val Met Gly Val Thr

1100 1105 1110

Val Glu Ala Gly Gln Val Lys Gln Gly Thr Pro Met Cys Val Pro

1115 1120 1125

Ser Lys Asn Phe Val Asp Ile Gly Ile Val Thr Ser Ile Glu Ile

1130 1135 1140

Asn His Lys Gln Val Asp Val Ala Lys Lys Gly Gln Glu Val Cys

1145 1150 1155

Val Lys Ile Glu Pro Ile Pro Gly Glu Ser Pro Lys Met Phe Gly

1160 1165 1170

Arg His Phe Glu Ala Thr Asp Ile Leu Val Ser Lys Ile Ser Arg

1175 1180 1185

Gln Ser Ile Asp Ala Leu Lys Asp Trp Phe Arg Asp Glu Met Gln

1190 1195 1200

Lys Ser Asp Trp Gln Leu Ile Val Glu Leu Lys Lys Val Phe Glu

1205 1210 1215

Ile Ile

1220

Claims

1.一种磷酸化EIF5B特异性抗体，其特征在于，所述抗体为人源磷酸化ElF5B T78特异性位点多克隆抗体。

2.一种制备如权利要求1所述的磷酸化EIF5B特异性抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

抗体纯化。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括制备用于抗体纯化的多肽2的步骤，所述多肽2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述免疫处理包括至少4次，免疫处理后还包括抗血清效价检测的步骤，分别检测第三次、第四次免疫后的抗血清效价，若抗血清效价大于1：32000，则效价达到要求，若抗血清效价小于1：32000，则增加1-2次免疫。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗体纯化包括：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，纯化后的抗体效价大于1:64000。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述抗血清效价通过间接ELISA方法检测；所述抗体纯化通过抗原特异亲和纯化进行。

8.一种如权利要求1所述的抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌肿瘤中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括所述抗体及赋形剂。