CN112812109B - 化合物DaP-01及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了化合物DaP‑01及其制备方法和应用。本发明提供的化合物DaP‑01，为式(Ⅰ)所示化合物。本发明还保护化合物DaP‑01在制备药物中的应用。所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)促进肿瘤细胞中蛋白激酶B‑Raf降解；(b)抑制肿瘤细胞增殖；(c)治疗肿瘤。当DaP‑01分子进入细胞以后，达拉非尼与B‑Raf相互结合，同时泊马度胺与E3泛素连接酶CRBN结合，招募E3泛素连接酶复合体，从而降解B‑Raf蛋白，进一步抑制肿瘤的发生发展。本发明对于靶向治疗肿瘤有着重要的意义和作用。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，涉及化合物DaP-01及其制备方法和应用，具体涉及化合物DaP-01在促进蛋白激酶B-Raf降解、抑制肝癌细胞增殖、进而作为肝癌治疗药物的应用。
背景技术
肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。
Ras-Raf-MAPK信号通路参与各种生长因子、细胞因子、丝裂原以及激素受体活化后的信号转导，具有调节细胞增殖、生长和分化等方面功能。B-Raf作为蛋白激酶Raf中的一员,在MAPK通路中起关键作用。目前的研究发现B-Raf在许多肝癌患者中都存在高表达或者突变，抑制B-Raf的激酶活性或者降低B-Raf的表达都能显著的抑制肝癌的发生发展。因此众多医药公司相继开发了多种B-Raf激酶抑制剂并且已经批准上市，如：索拉菲尼(Sorafenib,商品名：多吉美)、瑞戈菲尼(Regorafenib,商品名：拜万戈)、威罗菲尼(Vemurafenib,商品名：ZelboRaf)和达拉非尼(Dabrafenib,商品名:Tafinlar)等等。达拉非尼由葛兰素史克公司研发，能够与B-Raf相互结合进一步抑制B-Raf的激酶活性，用于治疗B-RafV600E突变的不可切除/转移性黑色素瘤。
发明内容
本发明的目的是提供化合物DaP-01及其制备方法和应用。
本发明提供的化合物DaP-01，为式(Ⅰ)所示化合物；
本发明还保护化合物DaP-01在制备药物中的应用；所述药物为促进肿瘤细胞中蛋白激酶B-Raf降解的药物。
本发明还保护化合物DaP-01在制备药物中的应用；所述药物为抑制肿瘤细胞增殖的药物。
本发明还保护化合物DaP-01在制备药物中的应用；所述药物为治疗肿瘤的药物。
本发明还保护一种药物，其活性成分为化合物DaP-01；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：
(a)促进肿瘤细胞中蛋白激酶B-Raf降解；
(b)抑制肿瘤细胞增殖；
(c)治疗肿瘤。
以上任一所述肿瘤为人肝癌。
本发明还保护化合物DaP-01的制备方法，包括如下步骤：
式(Ⅱ)所示化合物和式(Ⅲ)所示化合物进行反应，得到式(Ⅰ)所示化合物；
式(Ⅱ)所示化合物即化合物6。
式(Ⅲ)所示化合物即化合物8。
式(Ⅲ)所示化合物的制备方法如下：
式(Ⅳ)所示化合物和丙炔胺反应，得到式(Ⅲ)所示化合物；
式(Ⅳ)所示化合物即化合物7。
式(Ⅱ)所示化合物的制备方法如下：
式(Ⅴ)所示化合物和泊马度胺反应，得到式(Ⅱ)所示化合物；
式(Ⅴ)所示化合物即化合物5。
式(Ⅴ)所示化合物具体可为以式(Ⅵ)所示化合物为原料制备的；
式(Ⅵ)所示化合物即化合物4。
式(Ⅵ)所示化合物具体可为以式(Ⅶ)所示化合物为原料制备的；
式(Ⅶ)所示化合物即化合物3。
式(Ⅶ)所示化合物具体可为以式(Ⅷ)所示化合物为原料制备的；
式(Ⅷ)所示化合物即化合物2。
式(Ⅷ)所示化合物可为以式(Ⅸ)所示化合物为原料制备的；
式(Ⅸ)所示化合物即化合物1。
化合物2的制备方法具体可为实施例1的步骤1。
化合物3的制备方法具体可为实施例1的步骤2。
化合物4的制备方法具体可为实施例1的步骤3。
化合物6的制备方法具体可为实施例1的步骤4。
化合物8的制备方法具体可为实施例1的步骤5。
化合物DaP-01的制备方法具体可为实施例1的步骤6。
化合物DaP-01是将达拉非尼与泊马度胺用小分子linker链接起来得到的。
化合物DaP-01具有促进蛋白激酶B-Raf降解、抑制肿瘤细胞增殖的作用。当DaP-01分子进入细胞以后，达拉非尼与B-Raf相互结合，同时泊马度胺与E3泛素连接酶CRBN结合，招募E3泛素连接酶复合体，从而降解B-Raf蛋白，进一步抑制肿瘤的发生发展。本发明对于靶向治疗肿瘤有着重要的意义和作用。
附图说明
图1为化合物DaP-01合成图。
图2为实施例2的结果图。
图3为实施例3的结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
无血清无双抗的DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)：Gibco公司。胎牛血清：Gibco公司。Cell Counting Kit-8(CCK8试剂盒)：DOJINDO公司。泊马度胺：Sigma Aldrich公司，CAS号19171-19-8。化合物7，中文名称为“达拉菲尼中间体5”，CAS号为1195768-23-0，上海毕得医药公司。
实施例1、化合物DaP-01的制备和表征
化合物DaP-01合成图见图1。
1、三乙二醇(化合物1)(5.0g，33.33mmol)溶于二氯甲烷(100mL)，然后加入对甲苯磺酰氯(3.17g，16.66mmol)和三乙胺(2.7mL，20mmol)，室温搅拌过夜，用等体积混合的1M盐酸水溶液与二氯甲烷进行萃取，然后收集有相机进行干燥浓缩，然后过硅胶柱(采用石油醚-乙酸乙酯洗脱,石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1-1:1)，得到化合物2(4.10g)。化合物2的得率为81.0％。
2、取化合物2(3.5g，11.5mmol)，溶于二甲基甲酰胺(40mL)，加入叠氮化钠(897mg，13.8mmol)，80℃反应过夜，浓缩过滤，然后过硅胶柱(采用石油醚-乙酸乙酯洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比为5:1-2:1)，得到化合物3(1.91g)。化合物3的得率为95％。
化合物3的表征数据：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:3.37(t,2H,J＝4.95Hz,CH2),3.59(t,2H,J＝4.28Hz,CH2),3.64-3.68(m,6H,3×CH2),3.72(t,2H,J＝4.47Hz,CH2)；HRESIMSm/z calcd.for C6H14N3O3[M+H]+:176.1035,found:176.1039.。
3、取化合物3(1.8g，10.29mmol)，溶于丙酮(30mL)，冰水浴条件下加入现制备的琼斯试剂(2.5M，1mL)并反应3小时，然后用等体积混合的水和二氯甲烷进行萃取，然后收集有相机进行干燥浓缩，然后过硅胶柱(采用石油醚-乙酸乙酯洗脱.石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1-1:2)，得到化合物4(1.75g)。化合物4的得率为90％。
化合物4的表征数据：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:3.28(t,2H,J＝4.93Hz,CH2),3.61(t,2H,J＝4.38Hz,CH2),3.68-3.72(m,4H,2×CH2),4.45(s,2H,CH2CO)；HRESIMS m/zcalcd.for C6H10N3O4[M-H]-:188.0671,found:188.0676.。
4、取化合物4(50mg，0.26mmol)，在氮气保护条件下加入二氯亚砜(3mL)，60℃回流反应2小时，然后浓缩抽干，得到含有化合物5的粗产品；氮气保护条件下，将含有化合物5的粗产品溶于2mL二氯甲烷和5mL四氢呋喃的混合物，然后加入泊马度胺(50mg，0.18mmol)，60℃回流反应2小时(完成反应时，进行TLC监测，泊马度胺原料反应完全)，然后浓缩反应液，然后过硅胶柱(采用石油醚-乙酸乙酯洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比为4:1-1:1)，得到化合物6(64mg)。化合物6的得率为80％。
化合物6的表征数据：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:9.41(s,1H,NH),8.82(d,J＝7.8Hz,1H),8.45(s,1H,NH),7.70(t,J＝7.8Hz,1H),7.54(d,J＝7.8Hz,1H),4.96(dd,J＝12.0Hz,J＝6.5Hz,1H),4.53(s,2H,CH2CO),3.69-3.75(m,4H,2×CH2),3.63(t,2H,J＝4.39Hz,CH2),3.26(t,2H,J＝4.94Hz,CH2),2.85-2.72(m,2H),2.46(t,J＝7.3Hz,2H)；HRESIMS m/zcalcd.for C19H21N6O7[M+H]+:445.1472,found:445.1478.。
5、取化合物7(20mg，0.037mmol)，溶于异丙醇(5mL)，加入丙炔胺(2.5μL，0.037mmol)，氮气保护条件下80℃回流反应4小时，然后浓缩反应液，然后过硅胶柱(采用石油醚-乙酸乙酯洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:1-1:2)，得到化合物8(15.4mg)。化合物8的得率为75％。
化合物8的表征数据：1H NMR(DMSO-d6,500MHz)δ:8.57(d,1H,J＝5.2Hz),7.62-7.76(m,1H),7.21-7.34(m,5H),6.94(d,1H,J＝5.2Hz),3.85(s,2H,CH2),2.56(s,1H),1.42(s,9H,2×CH3)；HRESIMS m/z calcd.for C26H23F3N5O2S2[M+H]+:558.1239,found:558.1240.。
6、取化合物6(11mg，0.025mmol)和化合物8(14mg，0.025mmol)，溶于甲醇(2mL)和水(2mL)的混合物，然后加入氯化亚铜(1mg)，室温过夜反应，然后浓缩反应液，然后过硅胶柱(采用石油醚-乙酸乙酯洗脱,石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:1-1:4)，得到化合物DaP-01(17mg)。化合物DaP-01的得率为70％。
化合物DaP-01的表征数据：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:9.38(s,1H,NH),8.87(d,J＝7.7Hz,1H),8.60-8.45(m,3H),7.72-7.55(m,3H),7.34-7.31(m,5H),6.95(d,1H,J＝5.1Hz),4.91(m,1H),4.49(s,2H,CH2CO),4.21(s,2H),3.71-3.86(m,4H),1.40(s,9H,2×CH3)；HRESIMS m/z calcd.for C45H42NaF3N11O9S2[M+Na]+:1024.2458,found:1024.2463.。
化合物DaP-01如式(Ⅰ)所示。
实施例2、化合物DaP-01能明显降低Huh7细胞中B-Raf的蛋白水平
1、将化合物DaP-01溶于DMSO中，使其浓度为5mM，然后用无血清无双抗的DMEM培养基稀释，得到浓度不同的DaP-01溶液。
2、将Huh7细胞均匀铺于6孔板内，采用含10％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基37℃静置培养24小时。
3、完成步骤2后，吸弃上清，每孔加入2ml新鲜的含10％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基，然后每孔加入2μlDaP-01溶液，使得化合物DaP-01在体系中的终浓度分别为25nM、50nM、125nM或250nM。阴性对照溶液与DaP-01溶液的区别仅在于不加入化合物DaP-01。
4、完成步骤3后，37℃静置培养24小时，弃除上清，加入细胞裂解液进行裂解，进行蛋白定量后，通过Western-blot检测B-Raf的蛋白水平。B-Raf抗体购于Santa CruzBiotechnology。
进行三次重复试验,结果一致。
结果见图2(图2中，Control代表阴性对照)。结果表明，采用浓度为125nM、250nM的DaP-01处理后的细胞中，B-Raf蛋白表达受到了明显的抑制。
实施例3、化合物DaP-01抑制肝癌细胞的生长
1、将Huh7细胞均匀铺于3个96孔板(每个96孔板铺18个孔，每孔5000个细胞)，采用含1％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基(每孔100μl培养基)，37℃静置培养4小时。
2、完成步骤1后，取1个96孔板，每孔加入10μl CCK-8溶液，然后37℃静置培养1小时，然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。作为0小时时间点。
3、完成步骤1后，取第2个96孔板，弃上清，每孔加入100μl含50nM或250nMDaP-01的培养基(每个浓度设置6个复孔)(阴性对照的区别仅在于不含有化合物DaP-01，阴性对照设置6个复孔)；然后37℃静置培养24小时，然后每孔加入10μlCCK-8溶液，然后37℃静置培养1小时，然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。作为24小时时间点。
4、完成步骤1后，取第3个96孔板，弃上清，每孔加入100μl含50nM或250nMDaP-01的培养基(每个浓度设置6个复孔)(阴性对照的区别仅在于不含有化合物DaP-01，阴性对照设置6个复孔)；然后37℃静置培养48小时，然后每孔加入10μlCCK-8溶液，然后37℃静置培养1小时，然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。作为48小时时间点。
培养基的制备方法：将化合物DaP-01溶于DMSO中，使其浓度为5mM，然后用含1％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基稀释，得到含DaP-01的培养基(DaP-01浓度分别为50nM或250nM)。
计算0小时、24小时和48小时不同时间点的细胞存活率。
结果见图3(图3中，Control代表阴性对照)。化合物DaP-01抑制肝癌细胞增殖。
Claims (10)
1.式(Ⅰ)所示化合物；
2.权利要求1中的式(Ⅰ)所示化合物在制备药物中的应用；所述药物为促进肿瘤细胞中蛋白激酶B-Raf降解的药物。
3.权利要求1中的式(Ⅰ)所示化合物在制备药物中的应用；所述药物为抑制肿瘤细胞增殖的药物。
4.权利要求1中的式(Ⅰ)所示化合物在制备药物中的应用；所述药物为治疗肿瘤的药物。
5.如权利要求2至4中任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肝癌。
6.一种药物，其活性成分为权利要求1中的式(Ⅰ)所示化合物；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：
(a)促进肿瘤细胞中蛋白激酶B-Raf降解；
(b)抑制肿瘤细胞增殖；
(c)治疗肿瘤。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于：所述肿瘤为肝癌。
8.权利要求1中的式(Ⅰ)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
式(Ⅱ)所示化合物和式(Ⅲ)所示化合物进行反应，得到式(Ⅰ)所示化合物；
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：式(Ⅲ)所示化合物的制备方法如下：
式(Ⅳ)所示化合物和丙炔胺反应，得到式(Ⅲ)所示化合物；
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：
式(Ⅱ)所示化合物的制备方法如下：
式(Ⅴ)所示化合物和泊马度胺反应，得到式(Ⅱ)所示化合物；
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